본 연구에서는 천연 미백소재 개발을 위하여 제주도 연안에 서식하는 해조류 중 홍조류의 일종인 새발 추출물의 멜라닌 생성에 연관된 생리활성을 분석하였다. 그 결과, 새발 추출물의 폴리페놀 함량은 2.0 % 이하였고, 라디칼 소거활성(DPPH)은 $IC_{50}$값이 $2,000{\mu}g/mL$ 이상이었으며, 세포독성은 관찰되지 않았다. 그리고 생쥐의 B16/F10 흑색종 세포에서 멜라닌 생합성에 관련된 효소의 저해효과를 알아본 결과, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬에 의해 유도된 extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK 1/2)의 활성화를 억제함으로써 티로시나제와 티로시나제 연관 단백질 1을 저해하는 것으로 확인되었다. 따라서 새발 추출물은 멜라닌 생합성에 필수적인 효소인 티로시나제의 저해활성과 티로시나제 연관 단백질 1의 발현억제 효과가 뛰어난 것으로 분석되었다. 그러므로 홍조류인 새발(Acanthopeltis japonica)의 추출물은 멜라닌 생성 자극제로 유도된 신호전달경로를 저해하는 미백 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 천연 미백소재 개발을 위하여 제주도 연안에 서식하는 해조류 중 홍조류의 일종인 새발 추출물의 멜라닌 생성에 연관된 생리활성을 분석하였다. 그 결과, 새발 추출물의 폴리페놀 함량은 2.0 % 이하였고, 라디칼 소거활성(DPPH)은 $IC_{50}$값이 $2,000{\mu}g/mL$ 이상이었으며, 세포독성은 관찰되지 않았다. 그리고 생쥐의 B16/F10 흑색종 세포에서 멜라닌 생합성에 관련된 효소의 저해효과를 알아본 결과, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬에 의해 유도된 extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK 1/2)의 활성화를 억제함으로써 티로시나제와 티로시나제 연관 단백질 1을 저해하는 것으로 확인되었다. 따라서 새발 추출물은 멜라닌 생합성에 필수적인 효소인 티로시나제의 저해활성과 티로시나제 연관 단백질 1의 발현억제 효과가 뛰어난 것으로 분석되었다. 그러므로 홍조류인 새발(Acanthopeltis japonica)의 추출물은 멜라닌 생성 자극제로 유도된 신호전달경로를 저해하는 미백 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
To develop the skin whitening agent, we investigated the effects of Acanthopeltis japonica, a rhodophyta on the coast of Jeju island, on melanogenesis. Dried A. japonica was refluxed with 70 % aqueous ethanol and the extract was evaporated to dryness. To validate the activity as a depigmenting agent...
To develop the skin whitening agent, we investigated the effects of Acanthopeltis japonica, a rhodophyta on the coast of Jeju island, on melanogenesis. Dried A. japonica was refluxed with 70 % aqueous ethanol and the extract was evaporated to dryness. To validate the activity as a depigmenting agent, various in vitro tests, polyphenol contents, and free radical scavenging activity were performed. In addition, cellular tyrosinase activity and protein expression of p-ERT, tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 were measured in B16/F10 murine melanoma cells. A. japonica had low polyphenol contents and low free radicals scavenging activities against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical. A. japonica suppressed cellular tyrosinase activity up to 86.9 % at $100{\mu}g/mL$ with inhibition or tyrosinase and TRP-1 expression in ${\alpha}$-melanocyte stimulating hormone (${\alpha}$-MSH)-treated B16/F10 melanoma cells. Our results suggest that inhibitory effects of A. japonica on melanogenesis are due to inhibiting the pathways involving ${\alpha}$-MSH-induced ERK activation. Therefore, A. japonica nay be useful as a skin whitening agent associated with the suppressive effect of melanotrophin-induced signaling pathway to inhibit melanin synthesis.
To develop the skin whitening agent, we investigated the effects of Acanthopeltis japonica, a rhodophyta on the coast of Jeju island, on melanogenesis. Dried A. japonica was refluxed with 70 % aqueous ethanol and the extract was evaporated to dryness. To validate the activity as a depigmenting agent, various in vitro tests, polyphenol contents, and free radical scavenging activity were performed. In addition, cellular tyrosinase activity and protein expression of p-ERT, tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 were measured in B16/F10 murine melanoma cells. A. japonica had low polyphenol contents and low free radicals scavenging activities against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical. A. japonica suppressed cellular tyrosinase activity up to 86.9 % at $100{\mu}g/mL$ with inhibition or tyrosinase and TRP-1 expression in ${\alpha}$-melanocyte stimulating hormone (${\alpha}$-MSH)-treated B16/F10 melanoma cells. Our results suggest that inhibitory effects of A. japonica on melanogenesis are due to inhibiting the pathways involving ${\alpha}$-MSH-induced ERK activation. Therefore, A. japonica nay be useful as a skin whitening agent associated with the suppressive effect of melanotrophin-induced signaling pathway to inhibit melanin synthesis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구는 제주도의 연안 조간대 부근에서 채집한 새 발(Aanthopeltis japonica) 추출물의 항산화 효과 및 멜라닌 생성과정에 미치는 효과를 분석하였다.
제안 방법
8) 500 로 처리하고 초음파로 분쇄하였으며, 이 상태로 1 h 동안얼음에서 보관하였다. 1 h 후, 4 ℃ 원심분리기에서 15, 000 rpm으로 20 min 동안 원심분리하였으며, 이때 상층액을 버리고 분리된 침전물에 10 % DMSO를 함유한 1 N NaOH 용액을 첨가하고 65 ℃ 항온 수조에서 3 h 동안 보관하면서 침전물이 용해되기를 기다린 후 이 용해된 용액을 멜라닌 함량 분석에 사용하였다. 멜라닌 함량은 490 nm에서 측정하였고, 그 측정값은 상층액의 단백질량으로 보정하였다.
2 mg/mL의 추출물과 널리 알려져 있는 항산화제인 트롤록스(trolox)와 미백제로 쓰이는 알부틴(arbutin)을 각각 대조군으로 사용하여 8, 16, 31, 63, 125, 500, 1000, 2000 /mL의 농도로 96-well에 100 μL를 넣고 0.4 mM DPPH 100 mL를 첨가하여 vortex로 균일하게 혼합하였다. 실온의 암실에서 30 min 동안 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성 효과는 Blois의 방법을 변형하여 수행하였다[19]. 2 mg/mL의 추출물과 널리 알려져 있는 항산화제인 트롤록스(trolox)와 미백제로 쓰이는 알부틴(arbutin)을 각각 대조군으로 사용하여 8, 16, 31, 63, 125, 500, 1000, 2000 /mL의 농도로 96-well에 100 μL를 넣고 0.
실온에서 1 h 동안 방치한 후 그 상징액을 얻어 725 nm에서 흡광도를측정하였다. Tannic acid (Aldrich, USAX 이용한 표준곡선은 tannic acid 1 mg을 50 % 메탄올 용액 1 mL에녹이고 시료의 최종농도가 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 “g/mL용액이 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 725 nm 에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.
이들은 phenolic hydroxyl기를 가지고 있기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하는 성질이 있으며, 항산화 효과 등의 생리활성 기능도 갖는다[22]. Tannic acid를 stan- dard로 사용하여 검량선을 작성하고 이로부터 새발 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 새발 추출물의 폴리페놀 함량은 2.
a- MSH 50 nM을 처리하고 13, 25, 50, 100 /mL 농도로새발추출물 시료를 처리하여, 멜라닌 생성 유도 조건에서의 저해 효과를 관찰하였다. 72 h 동안 37 ℃, CO2 항온기에서 배양하였으며, 배양 도중 36 h 경과 시점에서, 배지 교체와 동시에 위와 같은 조건으로 다시 처리하였다.
a-MSH 50 nM로 멜라닌 생성과정을 촉진시켜준 B16/ F10 흑색종 세포에 새발 추출물 시료를 13 ~ 100 mL 농도로 처리하여 세포 내 티로시나제 저해활성을 분석하였다(Figure 2). 시료 100 μg/mL 농도 처리시 알부틴의 세포 내 티로시나제 저해활성이 47.
멜라닌 함량은 490 nm에서 측정하였고, 그 측정값은 상층액의 단백질량으로 보정하였다. 그리고 a-MSH만 처리한 대조군과 비교하여 상대적인 멜라닌 함량을 측정하였다.
8), 9 pM L-티로신과 4 mM L-도파를 혼합한 후, 위에서 얻은상층액 100 μL를 처리하여 37 ℃ 항온기에서 2 h 동안반응시켰다. 반응액 중에 생성된 도파크롬을 475 nm에서측정하여 각각의 측정값을 분석에 사용한 상층액의 단백질량으로 보정하고, 멜라닌 생성을 유도한 대조군(a -MSH 처리군)을 기준으로 하여 상대적인 활성을 나타내었다. 그리고 다음 식에 의해 저해율을 구하였다.
새발 추출물이 멜라닌 생성과정에 관여하는 단백질 발현양상에 미치는 영향을 Western blot으로 분석하였다. 새발 추출물은 a-MSH에 의해 유도된 ERK 1/2의 활성화를 저해함으로써 멜라닌 생합성에 직접적으로 관여하는 효소인 티로시나제와 TRPT의 발현을 저해하는 것으로 확인되었다.
생쥐의 B16/F10 흑색종 세포를 96-well plate에 5 x 104 cells/mL가 되게 준비한 후 24 h 동안 37 ℃, CO2 항온기에서 배양하고, 멜라닌 생합성 유도물질인 a~MSH 50 nM을 처리하고 동시에 새발 70 % 에탄올 추출물 시료를 13, 25, 50, 100 pg/mL 농도로 처리하였다. 72 h 동안 37 ℃, CO2 항온기에서 배양하였으며, 배양 도중 36 h 이 지난 후, 배지 교체와 동시에 위와 같은 조건으로 다시 처리하였다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 새발(Acanthopeltis japonioa)은 제주도 연안의 조간대 부근에서 채집하여 실험실로 운반한뒤 흐르는 수돗물로 수세하여 염분을 제거하고, 건조한후 미세하게 분쇄하여 영하 18 ℃ 의 냉동고에 보관하였다. 보관된 새발 100 g을 70 % 에탄올 약 1 L로 48 h 상온에서 교반하여 추출한 후 여과하였고, 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 50 % 에탄올로 용해하여 사용하였다.
이론/모형
멜라닌 함량 측정은 Yasunobu법을 사용하였다 쥐 (Mus musculus)의 B16/F10 흑색종 세포주를 6 well plate에 5 X 104 cells/mL이 되게 준비한 후, 24 h 동안 37 ℃ CO2 항온기에서 배양하고, 멜라닌 생합성 유도물질인 a-MSH 50 nM을 처리하고 동시에 시료를 각각 처리하였다. 72 h 동안 37 ℃ CO2 항온기에서 배양하였으며 36 h이 지난 후 배지 교체와 동시에 a-MSH 50 nM과시료를 다시 처리하였다.
1 h 후, 4 ℃ 원심분리기에서 15, 000 rpm으로 20 min 동안 원심분리하였으며 상층액을취하여 세포 내 티로시나제 활성 분석에 사용했다. 세포내 티로시나제 활성 분석은 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용결과 생성되는 도파크롬을 비색법에 의해 측정했다[20]. 33 mM 인산 나트륨 완충 용액(pH 6.
성능/효과
멜라닌 합성과정은 일련의 산화과정이며, 이로 인해 생성된 멜라닌은 각질형성세포로 이동하여 항산화제로서의 역할을 수행하게 된다. 그러므로, 항산화 활성이 아주 좋은 물질의 경우, 멜라닌 합성과정을 저해하여 미백 생리활성이 나타나게 된다 이에 따라 항산화 활성을 분석한 결과, 항산화제로 알려진 트롤록스의 DPPH 라디칼 소거활성은 IGo값이 10g/m이었으며, 미백제로 알려진 알부틴의 DPPH 라디칼 소거활성은 IGo값이 128 “g/mL인데 비해, 새발 추출물은 DPPH 라디칼 소거 활성이 2,000 g/mL에서 14.2 %로 IGo값이 2,000 pg/mL 이상이기 때문에 라디칼 소거활성에 의한 항산화 활성은 매우 낮은 것으로 나타났다(Figure 1). 그러므로 폴리페놀 함량 자체가 낮고, 항산화 활성이 아주 낮은 새발 추출물은 폴리히드록시 페놀화합물이 갖는 세포독성과 항산화 활성이 탁월한 화합물이 화장품 제형에 포함될 경우에 쉽게 산화되어 일어나는 제형의 불안정성, 변색, 변취 등의 문제를 상대적으로 적게 가질 수 있을 것이라 사료된다 [22].
9 %로 알부틴보다 세포 내 티로 시나 제 저해 활성이 좋은 것을 알 수 있었다. 그리고 멜라닌 생성저해 정도는 알부틴이 32.9 %인데 비해 새발 추출물은 46.1 %로, 결과적으로 a-MSH에 의해 유도되어진 B16/ F10 흑색종 세포 내에서 멜라닌 생성저해효과도 좋은 것을 알 수 있다(Figure 3). 이는 새발 추출물이 멜라닌 생성을 자극하는 작용제인 a-MSH에 의해 유도되어진 세포 내 티로시나제 활성을 저해함으로써 결과적으로 생성되는 멜라닌의 함량도 줄어들고 있다는 것을 의미하며, 새발 추출물의 멜라닌 생성저해 효과가 단순한 활성 산소 소거 활성에 의한 것일 가능성이 상대적으로 낮다는 것을 알 수 있었다.
따라서 제주도 연안에 서식하며, 우뭇가사리 속에 속하는 ^(Acanthopeltis japonica)의 추출물은 흑색종 세포에서 q-MSH에 의해 유도된 ERK 1/2의 활성화와 멜라닌 생성 경로를 저해하는 효과가 입증됨으로써 미백 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
그러나, B16 흑색종 세포에서, a- MSH와 같은 몇몇 멜라닌 생성 활성화 인자들은, 멜라닌생성 촉진 과정에서 TRP-2를 오히려 억제하는 영향을미친다고 보고되어 있다[8T0]. 본 연구에서는, 또한 a~ MSH에 의한 TRP-1의 영향이 티로시나제에 비해 훨씬적다는 것을 알 수 있었다(Figure 4). 이는 미백의 지표물질인 알부틴이 티로시나제의 활성 부위에서 L-티로신과경쟁적 저해제로 작용함으로써 티로시나제 특이적인 멜라닌 생성저해 효과를 보이는 것[24]과는 달리 a-MSH 에 의해 유도된 ERK 1/2의 활성화와 관련된 세포신호전달 경로를 저해함으로써 티로시나제와 TRP-1 등의 멜라닌 생성에 필요한 효소경로를 저해하는 것으로 보인다.
분석하였다. 새발 추출물은 a-MSH에 의해 유도된 ERK 1/2의 활성화를 저해함으로써 멜라닌 생합성에 직접적으로 관여하는 효소인 티로시나제와 TRPT의 발현을 저해하는 것으로 확인되었다. TRP-2는 DOPAchrome tautomerase라고불리며, 그 기능은 중간대사산물인 DOPAchrome을 주로 DHICA로 이성화시키며, 멜라닌 생중합체 내에 carbo- xylated subunits의 구성을 조절하는 스위치 역할을 하는것으로 보고되어 있다.
2). 시료 100 μg/mL 농도 처리시 알부틴의 세포 내 티로시나제 저해활성이 47.4 %인데 반해, 새 발 추출물은 86.9 %로 알부틴보다 세포 내 티로 시나 제 저해 활성이 좋은 것을 알 수 있었다. 그리고 멜라닌 생성저해 정도는 알부틴이 32.
1 %로, 결과적으로 a-MSH에 의해 유도되어진 B16/ F10 흑색종 세포 내에서 멜라닌 생성저해효과도 좋은 것을 알 수 있다(Figure 3). 이는 새발 추출물이 멜라닌 생성을 자극하는 작용제인 a-MSH에 의해 유도되어진 세포 내 티로시나제 활성을 저해함으로써 결과적으로 생성되는 멜라닌의 함량도 줄어들고 있다는 것을 의미하며, 새발 추출물의 멜라닌 생성저해 효과가 단순한 활성 산소 소거 활성에 의한 것일 가능성이 상대적으로 낮다는 것을 알 수 있었다.
참고문헌 (24)
H. Z. Hill, W. Li, P. Xin, and D. L. Michell, Melanin: a two edged swords, Pigment Cell Res., 10, 158 (1997)
J. Cabanes, S. Chazarra, and F. Garcia-Carmona, Kojic acid, a cosmetic skin whitening agent, is a slow-binding inhibitor of catecholase activity of tyrosinase, J. Pharm. Pharmacol., 46, 982 (1994)
R. K. Tripathi, V. J. Hearing, K. Urabe, P. Aroca, and R. A. Spritz, Mutational mapping of the catalytic activities of human tyrosinase, J. Biol. Chem., 267, 707 (1992)
A. Korner and J. Pawelek, Mammalian tyrosinase catalyzes three reactions in the biosynthesis of melanin, Science, 217, 1163 (1982)
R. Han, H. P. Baden, J. L. Brissette, and L. Weiner, Redefining the skin's pigmentary system with a novel tyrosinase assay, Pigment Cell Res., 15, 290 (2002)
T. Kobayashi, G. Imokawa, D. C. Bennett, and V. J. Hearing, Tyrosinase stabilization by Tyrp1 (the brown locus protein), J. Biol. Chem., 273, 31801 (1998)
P. Manga, K. Sato, L. Ye, F. Beermann, M. L. Lamoreux, and S. J. Orlow, Mutational analysis of the modulation of tyrosinase by tyrosinase-related protein 1 and 2 in vitro, Pigment Cell Res., 13, 364 (2000)
K. Tsukamoto, I. J. Jackson, K. Urabe, P. M. Montague, and V. J. Hearing, A second tyrosinase-related protein, TRP-2, is a melanogenic enzyme termed DOPAchrome tautomerase, EMBO J., 11, 519 (1992)
J. H. Martinez-Liarte, F. Solano, J. C. Garcia-Borron, J. R. Jara, and J. A. Lozano, ${\alpha}-MSH$ and other melanogenic activators mediate opposite effects on tyrosinase and DOPAchrome tautomerase in B16/F10 mouse melanoma cells, J. Invest. Dermatol., 99, 435 (1992)
G. Imokawa, T. Kobayashi, M. Miyagishi, K. Higashi, and Y. Yada, The role of endrothelin-1 in epidermal hyperpigmentation and signaling mechanisms of mitogenesis and melanogenesis, Pigment Cell Res., 10, 218 (1997)
S. Im, E. S. Lee, W. Kim, W. On, J. Kim, M. Lee, and W. H. Kang, Donor specific response of estrogen and progesterone on cultured human melanocyte, J. Korea Med. Sci., 17, 58 (2002)
C. Romero-Graillet, E. Aberdam, M. Clement, J. P. Ortonne, and R. Bailotti, Nitric oxide produced by ultraviolet-irradiated stimulates melanogenesis, J. Clin Invest., 99, 635 (1997)
J. Grabbe, P. Welker, E. Dippel, and B. M. Czarnetzki, Stem cell factor, a novel cutaneous growth factor for mast cells and melanocytes, Arch. Dermatol. Res., 287, 78 (1994)
S. H. Pomerantz, The tyrosine hydroxylase activity of mammalian tyrosinase, J. Biol. Chem, 241, 161 (1966)
O. Yasunobu, K. Tomoko, O. Yuri, M. Hitoshi, K. Yoshiko, F. Yoko, I. Masamitsu, Y. Ytaka, K. Yoshitane, and S. Hiromu, Development of a novel zinc complex as whitening agent in a new concept, ASCS, 6, 69 (2003)
Y. Lu and L. Yeap Foo, Antioxidant activities of polyphenols from sage (Salvia officinalis), Food Chem., 75, 197 (2001)
H. H. Kang, H. S. Rho, J. S. Hwang, and S. G. Oh, Depigmenting activity and low cytotoxicity of alkoxy benzoates or alkoxy cinnamate in cultured melanocytes, Chem. Pharm. Bull., 51, 1085 (2003)
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.