[논문]마우스를 이용한 Clean Natural에 대한 소핵시험

조윤희; 김의경; 임영윤; 김곤섭; 이후장

마우스를 이용한 Clean Natural에 대한 소핵시험
The Micronucleus Test of Clean Natural with Mice 원문보기

韓國環境保健學會誌 = Journal of environmental health sciences, v.31 no.5 = no.86, 2005년, pp.411 - 414

조윤희 (전북대학교 수의과대학) , 김의경 (경상대학교 수의과대학 동물의학연구소) , 임영윤 (서남해수어류양식수산업협동조합) , 김곤섭 (경상대학교 수의과대학 동물의학연구소) , 이후장 (경상대학교 수의과대학 동물의학연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

Clean Natural is a new disinfectant of which main components are propolis and wood vinegar from Quercus mongolica. The mutagenicity of Clean Natural was studied by a micronucleus test in male ICR mice. The maximally tolerated dose (MTI) of Clean Natural was determined to >2.0 g/kg body weight. Therefore, the doses adopted for the micronucleus test was 2.0 g/kg as a high dose, 1.0 g/kg as a medium and 0.5 g/kg as a low of dose, respectively. Each of group was consisted of three doses of Clean Natural, positive control 2 mg/kg of mitomycin C and negative control 20 ml/kg of saline. A slide preparation was made at 24 hours following administration. No significant induction of micronuclei was observed in any of the three doses of Clean Natural orally administered. No cytotoxicity such as inhibition of hemopoiesis was observed in any group of test agent as the rate of polychromatic erythrocytes to total erythrocytes was over 40%. These results indicate that Clean Natural is not capable of inducing micronuclei in vivo mouse cells and thus has no genotoxicity in micronucleus test.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

18) 그러나, 본 실험에서는 (주)성원에서 의뢰한 시험물질 Clean Natural의 유전독성을 평가하고자 수의과학검역원 예규 제 8호 "동물용의약품 등의 독성시험지침" 및 OECD guideline에 따라 마우스의 말초혈액을 이용한 Supravital micronucleus assay로 소핵시험을 실시하였다.^19,20)
의 방법에 따라 3단계 통계처리법을 적용하여 결과를 분석하였다. 1, 2단계의 비교자료 활용에 의한 검정을 거쳐, 3단계에는 음성대조군과 시험물질 투여군과의 소핵적혈구의 출현빈도에 관한 유의성을 Cochran armitage 경향검정을 수행하였다(p<0.05).
Clean Natural 원액을 증류수를 이용하여 균질하게 현탁조제하여 미우스 체중 kg당 20 ml의 용량이 되도록 1회 강제 경구투여하였다. 양성대조물질인 Mitomycin C는 체중 kg당 2 mg/10 ml이 되도록 saline에 용해하여 1회 복강투여하였다.
급성독성시험 결과를 통하여 얻어진 LD₅₀를 고려하여, 2,000mg/kg를 최고용량으로 설정한 다음, 공비를 1/2로 하여 3단계의 농도로 시험군을 설정하였다. 용매 대조군으로는 saline을 사용하였으며 , 양성대조군으로는 Mitomycin C를 2 mg/kg body weight로 사용하였다.
현미경은 450 nm 파장의 Fluorescein Isohiocyanate(FITC)에서 검경하였다. 마우스 개체 당 1,000개의 적혈구에서 다 염성 적혈구(Polychromatic erythrocyte, PCE)와 정염성 적혈구(Normochromatic eiythrocyte, NCE)의 비를 구하고 다시 1,000개의 다염성 적혈구 중에서 소핵을 가진 다염성 적혈구의 출현빈도를 구하였다. 계수시 소핵의 크기는 세포직경의 1/2로부터 식별 가능한 범위까지 하였으며, 주변 유핵세포의 핵과 염색상이 동일한 것을 선택하였다.
순화 사육기간동안 관찰하여 건강한 동물만 시험에 사용하였으며, 실험동물용 고형사료((주)삼양사료)와 상수도를 자유공급하였다. 순화기간을 거친 모든 동물의 체중을 측정, 소정의 범위에 속하는 동물을 선별하여 무작위로 각군에 배분하였다. 개체의 식별은 색소에 의한 부위별 피모염색법과 사육상자별 tag 표시법을 이용하였다.
시험동물을 투여한 동물에 대하여 외관관찰을 실시하여 사망동물 및 이상징후의 빌생여부를 관찰하였다. 제작된 슬라이드는 4℃에서 2시간 동안 반응을 시킨 후, 3매 중 염색상태가 가장 양호한 슬라이드 1매를 선택하여, 1,000배의 현미경 하에서 검경하였다.
Clean Natural 원액을 증류수를 이용하여 균질하게 현탁조제하여 미우스 체중 kg당 20 ml의 용량이 되도록 1회 강제 경구투여하였다. 양성대조물질인 Mitomycin C는 체중 kg당 2 mg/10 ml이 되도록 saline에 용해하여 1회 복강투여하였다.
시험동물을 투여한 동물에 대하여 외관관찰을 실시하여 사망동물 및 이상징후의 빌생여부를 관찰하였다. 제작된 슬라이드는 4℃에서 2시간 동안 반응을 시킨 후, 3매 중 염색상태가 가장 양호한 슬라이드 1매를 선택하여, 1,000배의 현미경 하에서 검경하였다. 현미경은 450 nm 파장의 Fluorescein Isohiocyanate(FITC)에서 검경하였다.
이때, 너무 많은 혈액을 도말할 경우 적혈구들이 서로 겹쳐서 데이터의 해독이 용이하지 않을 수 있으므로 cover glass를 덮은 후에 휴지 등을 이용하여 살살 문질러서 너무 두껍게 혈액이 도말 되지 않도록 하였다. 표본은 각 동물 당 3매 씩을 제작하였다.

대상 데이터

(주)양성(경기도 용인시)으로부터 공급받은 ICR계 4주령 수컷 마우스를 온도 23±2℃, 상대습도 50±10%, 환기회수 13-18회/hr, 형광등 조명(12/12시간 명암, 조도 200-300 lux)의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육 상자(400W×250l×180H mm)에 1군씩(6마리) 사육하였다. 순화 사육기간동안 관찰하여 건강한 동물만 시험에 사용하였으며, 실험동물용 고형사료((주)삼양사료)와 상수도를 자유공급하였다.
(주)양성(경기도 용인시)으로부터 공급받은 ICR계 4주령 수컷 마우스를 온도 23±2℃, 상대습도 50±10%, 환기회수 13-18회/hr, 형광등 조명(12/12시간 명암, 조도 200-300 lux)의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육 상자(400W×250l×180H mm)에 1군씩(6마리) 사육하였다. 순화 사육기간동안 관찰하여 건강한 동물만 시험에 사용하였으며, 실험동물용 고형사료((주)삼양사료)와 상수도를 자유공급하였다. 순화기간을 거친 모든 동물의 체중을 측정, 소정의 범위에 속하는 동물을 선별하여 무작위로 각군에 배분하였다.
제작된 슬라이드는 4℃에서 2시간 동안 반응을 시킨 후, 3매 중 염색상태가 가장 양호한 슬라이드 1매를 선택하여, 1,000배의 현미경 하에서 검경하였다. 현미경은 450 nm 파장의 Fluorescein Isohiocyanate(FITC)에서 검경하였다. 마우스 개체 당 1,000개의 적혈구에서 다 염성 적혈구(Polychromatic erythrocyte, PCE)와 정염성 적혈구(Normochromatic eiythrocyte, NCE)의 비를 구하고 다시 1,000개의 다염성 적혈구 중에서 소핵을 가진 다염성 적혈구의 출현빈도를 구하였다.

이론/모형

Hayashi 등²¹⁾의 방법에 따라 3단계 통계처리법을 적용하여 결과를 분석하였다. 1, 2단계의 비교자료 활용에 의한 검정을 거쳐, 3단계에는 음성대조군과 시험물질 투여군과의 소핵적혈구의 출현빈도에 관한 유의성을 Cochran armitage 경향검정을 수행하였다(p<0.
순화기간을 거친 모든 동물의 체중을 측정, 소정의 범위에 속하는 동물을 선별하여 무작위로 각군에 배분하였다. 개체의 식별은 색소에 의한 부위별 피모염색법과 사육상자별 tag 표시법을 이용하였다.
혈액표본은 OECD guideline에 따라 제작하였다.²⁰⁾ 약제투여 24시간 후, 마우스의 말초혈액을 꼬리를 절단하여 채취한 다음, 미리 제작된 슬라이드(Acridine orange 용액(1mg/ml) 처리)에 혈액(10-20 μl)을 떨어뜨린 후, cover glass를 덮는다.

성능/효과

16) 프로폴리스 성분으로는 지금까지 약 150종 이상의 화합물이 알려져 있으며 주성분은 polyphenol이며 polyphenol로서는 flavonoid, phenolic acid 등이 있다.¹⁷⁾
시험물질을 2,000 mg/kg까지 투여한 결과 소핵다염성 적혈구의 관찰빈도는 용매대조군에 비해 시험물질 투여군 모두에서 통계학적으로 유의성 있는 변화는 관찰되지 않아 소핵유발성이 없는 것으로 판단된다. 또한, 세포독성의 지표로서 총적혈구(정염성 적혈구와 다염성 적혈구의 합)중 다염성 적혈구의 관찰빈도를 계수하였던 바, 시험물질투여군 모두에서 용매대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으나, 40% 이상으로 세포독성을 나타내지 않는 것으로 판단된다.
8)에서는 모두 용매대조군에 대해 통계학적으로 유의성 있는 변화를 관찰 할 수 없었다. 또한, 총적혈구 대비 다염성 적혈구의 관찰빈도(%)는 용매대조군 50.9±3.7, 저용량투여군 46.0±7.0, 중간 용량 투여군 44.7±4.7, 고용량투여군 49.4±3.4, 그리고 양성 대조군 47.3±2.7로서 용매투여군에 비해 통계학적으로 유의성 있게 낮게 관찰되었다(p<0.05). 이러한 결과는, Clean Natural의 랫드와 개에 대한 경구투여 독성시험에서 독성이 매우 낮은 것으로 확인된 결과와도 일치하였으며,²²⁾또한, 변이원성시험의 하나인 Salmonella typhimurium에 대한 복귀돌연변이시험에서 Clean Natural이 복귀돌연변이를 유발할 가능성이 없는 것으로 평가된 결과와도 일치하였다.
시험물질 Clean Natural에 대하여 마우스를 이용한 소핵시험을 실시한 바, 시험용량에서 투여 후, 혈액을 채취할 때까지의 24시간 동안 사망동물은 없었으며 특이한 임상증상도 관찰되지 않았다.
시험물질을 2,000 mg/kg까지 투여한 결과 소핵다염성 적혈구의 관찰빈도는 용매대조군에 비해 시험물질 투여군 모두에서 통계학적으로 유의성 있는 변화는 관찰되지 않아 소핵유발성이 없는 것으로 판단된다. 또한, 세포독성의 지표로서 총적혈구(정염성 적혈구와 다염성 적혈구의 합)중 다염성 적혈구의 관찰빈도를 계수하였던 바, 시험물질투여군 모두에서 용매대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으나, 40% 이상으로 세포독성을 나타내지 않는 것으로 판단된다.
소핵다염성 적혈구수와 총적혈구 대비 다염성 적혈구수의 현미경 검경 결과를 Table 1에 나타내었다. 식염수를 투여한 용매대조군에서의 소핵다염성 적혈구의 관찰빈도는 1.0± 1.0이었고, Mitomycin C를 투여한 양성대조군에서는 65.8±23.6로서 용매대조군에 비해 유의성있는 증가를 보였다(p<0.05). 그러나, 시험물질 투여군(저용량군; 0.
이상의 결과로 볼 때 본 시험조건 하에서 Clean Natural은 마우스의 말초혈액에서 소핵시험에 의한 유전독성은 없는 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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