선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구는 제조방법이 간단하고 생산성이 우수할 뿐만 아니라, 동시에 항암, 인체 체지방 감소, 면역 증강, 또는 당뇨병 예방 및 치료의 효과를 가지는 공액리놀레산 또는 이의 이성체를 결합시켜 기능성을 부여할 수 있는 공액리놀레산을 포함하는 고순도 디글리세라이드 식용유지 조성물(DG＋CLA)에 대한 안전성시험을 실시하였다. 유전 독성 여부를 검사하는 연구 방법 중 소핵(micronucleus) 시험은 시험물질을 마우스 복강 내에 주사하거나 강제 경구투여하고 24시간 후 골수를 채취하여 소핵 유발 유무를 관찰하는 in vivo 독성실험법의 하나이다.
제안 방법
- 충분히 건조시킨 골수도말표본을 메탄올로 고정한 후, 5% Giemsa 액으로 30분간 염색하였다. 0.01 M sorenson 인산완충액(pH 6.8)을 이용하여 수세하여 0.004% citric acid 수용액에 세정하고, 수세하여 건조시킨 후, 제작한 검체표본에 코드화하는 맹검법으로 검체에 번호를 부여하였다.
- 이하 공비 2로서 최고용량을 포함한 3용량의 시험물질군(2,000, 1,000, 500 mg/kg)과 음성대조군은 시험물질의 부형제로 사용한 olive oil을, 양성대조군은 Mitomycin C(2 mg/kg)로 설정하였다. DG＋CLA군은 존데를 이용하여 1회 경구투여 하였으며, 음성대조군은 시험물질군과 동등한 방법으로 olive oil을 경구투여 하였다. 양성대조군은 1회 복강 내 투여하였다.
- 소핵시험의 용량을 설정하고자 독성예비시험을 실시하였다. DG＋CLA의 최고 농도를 2,000 mg/kg으로 하여 이하 공비 2로 최고용량을 포함한 5용량의 시험물질을 경구투여 하였다. 투여 직후(0), 24, 48 및 72시간에 사망수 및 일반상태의 변화를 관찰한 결과, 사망동물은 없었으며 독성징후도 관찰되지 않았다(Table l).
- 시험물질 500, 1,000, 2,000 mg/kg의 용량과 음성대조군 및 양성대조군인 Mitomycin C 2 mg/kg 투여군을 설정한 후, 음성대조군과 시험물질군은 경구투여 하였고, 양성대조군은 복강투여 하여 최종 투여 후 24시간 후에 대퇴골로부터 골수세포를 채취, 도말하였다. 골수검체는 5% Giemsa액으로 염색하며 소핵유발빈도를 검경하였다. 시험결과 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험에서, 모든 시험물질군의 다염성적혈구(Polychromatic erythrocyte, PCE) 중 소핵다염성적혈구(Micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)의 출현율은 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 증가는 관찰되지 않았다.
- 골수세포의 채취는 시험물질 투여 후, 본시험에 앞서 수행된 소핵유발 빈도시험에서 결정된 골수세포 채취시간에 경추탈골법으로 마우스를 도살하고 대퇴골을 적출하여 근육질을 깨끗이 제거한 후, 그 양 끝단을 가위로 절단하여 200 μL의 우태아 혈청을 관류시켜 채취하였다.
- 코드화된 검체를 1,000배의 배율로 검경하였다. 골수에 대한 영향을 평가하기 위해 동물개체별로 다염성적혈구(PCE, Polychromatic erythrocyte)와 정염성적혈구(NCE, Normochromatic erythrocyte)의 합이 500개가 되도록 계수하여 총 적혈구 중 다염성적혈구의 비율 [PCE/(PCE＋NCE)]을 산출하였다. 이어서 다염성적혈구가 2,000개가 되도록 계수하여 다염성적혈구 중 소핵다염성적혈구(MNPCE, Micronucleated polychromatic erythrocyte)의 비율(MNPCE/2000PCE)을 구하여 세포독성의 지표로 삼았다.
- 에서 구입하여, 온도 24±2℃, 습도 50±3%의 항온, 항습 장치가 되어 있는 실험실 환경에서 고형사료로 1주일 동안 순화 및 검역기간을 거쳤다. 그 후 체중을 측정하여 체중 증가량 및 일반상태에 이상이 없는 건강한 동물만을 사용하여 시험을 수행하였다. 독성예비시험 15마리, 소핵유발빈도 시험 9마리, 소핵시험 25마리를 선발한 후, 각 군간 균등성 여부를 확인하여 군 분리하였다.
- 그 후 체중을 측정하여 체중 증가량 및 일반상태에 이상이 없는 건강한 동물만을 사용하여 시험을 수행하였다. 독성예비시험 15마리, 소핵유발빈도 시험 9마리, 소핵시험 25마리를 선발한 후, 각 군간 균등성 여부를 확인하여 군 분리하였다.
-
소핵유발 빈도 및 세포독성
독성예비시험 및 소핵유발빈도시험의 결과로부터 소핵시험은 2,000 mg/kg을 최고용량으로 하고 이하 공비 2로 최고 용량을 포함한 3용량의 DG＋CLA군과 음성대조군 및 양성대조군을 설정하였다. 시험물질을 1일 1회 1일간 경구투여하고, 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수세포를 수거하여 소핵유발과 세포독성을 평가하였다.
- 독성예비시험에서 결정한 최고용량 2,000 mg/kg을 투여하여, 24, 48 및 72시간째에 동물로부터 골수세포를 채취하여 소핵유발빈도가 증가하는 시간대를 소핵시험에서의 골수세포 채취시간으로 결정하였다. 투여액량은 10 mL/kg으로 하여, 군 분리 시의 체중으로부터 투여액량을 산출하였다.
- 독성예비시험에서 결정한 최고용량인 DG＋CLA 2,000 mg/kg을 경구투여 하였다. 경구투여 후 24, 48 및 72시간째에 시험동물로부터 골수세포를 채취하여 소핵유발빈도를 관찰한 결과, 모든 시간대에서 소핵의 증가가 관찰되지 않았다(Table 2).
- 경구투여 후 24, 48 및 72시간째에 시험동물로부터 골수세포를 채취하여 소핵유발빈도를 관찰한 결과, 모든 시간대에서 소핵의 증가가 관찰되지 않았다(Table 2). 따라서 72시간 동안 소핵 증가가 나타나지 않아서 통상적으로 사용하는 24시간을 골수세포채취시간으로 정하였다.
- 본시험에 앞서 최고용량을 2,000 mg/kg을 기준으로 1,000, 500, 250, 125 mg/kg 용량으로 각 용량당 3마리의 마우스를 이용하여 독성예비시험을 실시하였다. 투여직후(0), 24, 45 및 72시간에 각 용량별 사망수 및 일반상태의 변화를 관찰하여 소핵시험의 최고용량을 설정하였다.
- 소핵다염성적혈구의 출현빈도가 음성대조군 또는 historical control data와 비교하여 시험물질군에서 통계적으로 유의하게 상승하고, 용량의존성이 인정되는 경우, 양성으로 판정하였다.
- 소핵시험의 용량을 설정하고자 독성예비시험을 실시하였다. DG＋CLA의 최고 농도를 2,000 mg/kg으로 하여 이하 공비 2로 최고용량을 포함한 5용량의 시험물질을 경구투여 하였다.
- 시험물질 공액리놀렌산이 함유된 디글리세라이드 식용유지 조성물의 마우스에 대한 소핵유발시험을 실시하였다. 시험물질 500, 1,000, 2,000 mg/kg의 용량과 음성대조군 및 양성대조군인 Mitomycin C 2 mg/kg 투여군을 설정한 후, 음성대조군과 시험물질군은 경구투여 하였고, 양성대조군은 복강투여 하여 최종 투여 후 24시간 후에 대퇴골로부터 골수세포를 채취, 도말하였다. 골수검체는 5% Giemsa액으로 염색하며 소핵유발빈도를 검경하였다.
- 시험물질 공액리놀렌산이 함유된 디글리세라이드 식용유지 조성물의 마우스에 대한 소핵유발시험을 실시하였다. 시험물질 500, 1,000, 2,000 mg/kg의 용량과 음성대조군 및 양성대조군인 Mitomycin C 2 mg/kg 투여군을 설정한 후, 음성대조군과 시험물질군은 경구투여 하였고, 양성대조군은 복강투여 하여 최종 투여 후 24시간 후에 대퇴골로부터 골수세포를 채취, 도말하였다.
- 시험물질 투여 후 일반상태의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 체중측정은 투여개시 전 1회 및 골수채취직전에 1회 측정하였다.
- 독성예비시험 및 소핵유발빈도시험의 결과로부터 소핵시험은 2,000 mg/kg을 최고용량으로 하고 이하 공비 2로 최고 용량을 포함한 3용량의 DG＋CLA군과 음성대조군 및 양성대조군을 설정하였다. 시험물질을 1일 1회 1일간 경구투여하고, 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수세포를 수거하여 소핵유발과 세포독성을 평가하였다.
- DG＋CLA군은 존데를 이용하여 1회 경구투여 하였으며, 음성대조군은 시험물질군과 동등한 방법으로 olive oil을 경구투여 하였다. 양성대조군은 1회 복강 내 투여하였다. 투여액량은 10 mL/kg으로 하여, 군 분리 시의 체중으로부터 투여액량을 산출하였다.
- 에서 구입하여, 온도 24±2℃, 습도 50±3%의 항온, 항습 장치가 되어 있는 실험실 환경에서 고형사료로 1주일 동안 순화 및 검역기간을 거쳤다.
- 골수에 대한 영향을 평가하기 위해 동물개체별로 다염성적혈구(PCE, Polychromatic erythrocyte)와 정염성적혈구(NCE, Normochromatic erythrocyte)의 합이 500개가 되도록 계수하여 총 적혈구 중 다염성적혈구의 비율 [PCE/(PCE＋NCE)]을 산출하였다. 이어서 다염성적혈구가 2,000개가 되도록 계수하여 다염성적혈구 중 소핵다염성적혈구(MNPCE, Micronucleated polychromatic erythrocyte)의 비율(MNPCE/2000PCE)을 구하여 세포독성의 지표로 삼았다.
- 독성예비시험 결과, 일반상태의 변화 및 사망동물이 관찰되지 않은 최고용량인 2,000 mg/kg을 소핵시험의 최고용량으로 정하였다. 이하 공비 2로서 최고용량을 포함한 3용량의 시험물질군(2,000, 1,000, 500 mg/kg)과 음성대조군은 시험물질의 부형제로 사용한 olive oil을, 양성대조군은 Mitomycin C(2 mg/kg)로 설정하였다. DG＋CLA군은 존데를 이용하여 1회 경구투여 하였으며, 음성대조군은 시험물질군과 동등한 방법으로 olive oil을 경구투여 하였다.
- 골수세포의 채취는 시험물질 투여 후, 본시험에 앞서 수행된 소핵유발 빈도시험에서 결정된 골수세포 채취시간에 경추탈골법으로 마우스를 도살하고 대퇴골을 적출하여 근육질을 깨끗이 제거한 후, 그 양 끝단을 가위로 절단하여 200 μL의 우태아 혈청을 관류시켜 채취하였다. 채취한 골수를 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 버린 후, 침전된 골수세포를 잘 부유시켜 소량을 슬라이드글래스에 낙하하고 도말하여 개체당 2매의 골수도말검체를 제작하였다. 충분히 건조시킨 골수도말표본을 메탄올로 고정한 후, 5% Giemsa 액으로 30분간 염색하였다.
- 시험물질 투여 후 일반상태의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 체중측정은 투여개시 전 1회 및 골수채취직전에 1회 측정하였다.
- 독성예비시험에서 결정한 최고용량 2,000 mg/kg을 투여하여, 24, 48 및 72시간째에 동물로부터 골수세포를 채취하여 소핵유발빈도가 증가하는 시간대를 소핵시험에서의 골수세포 채취시간으로 결정하였다. 투여액량은 10 mL/kg으로 하여, 군 분리 시의 체중으로부터 투여액량을 산출하였다. 전체의 시간대에 있어 소핵유발빈도의 증가가 관찰되지 않을 경우는 통상적으로 사용하는 24시간을 골수세포채취 시간으로 한다.
- 본시험에 앞서 최고용량을 2,000 mg/kg을 기준으로 1,000, 500, 250, 125 mg/kg 용량으로 각 용량당 3마리의 마우스를 이용하여 독성예비시험을 실시하였다. 투여직후(0), 24, 45 및 72시간에 각 용량별 사망수 및 일반상태의 변화를 관찰하여 소핵시험의 최고용량을 설정하였다.
대상 데이터
- 공액리놀렌산이 함유된 디글리세라이드 식용유지 조성물(DG＋CLA)은 86.6% 디글리세라이드와 60% 공액리놀렌산을 화학적으로 합성한 원료를 (주)일신웰스로부터 공급받아본 실험에 사용하였다. 양성대조물질인 Mitomycin C(MMC, Lot No.
데이터처리
- 소핵다염성적혈구의 출현빈도는 음성대조군과 다른 군에 있어 Kastenbaum & Bowman의 추정학적 통계방법(11)을 이용하여 검증하였다. 다염성적혈구의 출현빈도에 대해서는 t-test 법을 이용하여 5% 유의수준에서 통계적 유의성을 검증하였고, 체중의 변화는 ANOVA test를 실시하여 5% 유의수준에서 통계적인 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 본 연구는 DG＋CLA에 대한 안전성시험의 일환으로서 마우스를 이용한 소핵시험을 “의약품등의 독성시험기준”(식품의약품안전청 고시 제 5005-60호, 2005)에 따라 실시하였다.
- 소핵다염성적혈구의 출현빈도는 음성대조군과 다른 군에 있어 Kastenbaum & Bowman의 추정학적 통계방법(11)을 이용하여 검증하였다.
성능/효과
- 독성예비시험에서 결정한 최고용량인 DG＋CLA 2,000 mg/kg을 경구투여 하였다. 경구투여 후 24, 48 및 72시간째에 시험동물로부터 골수세포를 채취하여 소핵유발빈도를 관찰한 결과, 모든 시간대에서 소핵의 증가가 관찰되지 않았다(Table 2). 따라서 72시간 동안 소핵 증가가 나타나지 않아서 통상적으로 사용하는 24시간을 골수세포채취시간으로 정하였다.
- 독성예비시험 결과, 일반상태의 변화 및 사망동물이 관찰되지 않은 최고용량인 2,000 mg/kg을 소핵시험의 최고용량으로 정하였다. 이하 공비 2로서 최고용량을 포함한 3용량의 시험물질군(2,000, 1,000, 500 mg/kg)과 음성대조군은 시험물질의 부형제로 사용한 olive oil을, 양성대조군은 Mitomycin C(2 mg/kg)로 설정하였다.
- 이는 시험동물에서 DG＋CLA 2,000, 1,000, 500, 250, 125 mg/kg의 투여는 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 독성예비시험 결과로 소핵시험의 최고 투여 용량을 2,000 mg/kg으로 정하였다.
- 음성대조군 및 양성대조군의 소핵유발빈도는 historical control date의 정상범위에 있었기 때문에 본시험은 적절한 조건하에서 실시되었음이 확인되었다. 따라서 본 시험 조건하에서 시험물질인 공액리놀렌산이 함유된 디글리세라이드 조성물은 마우스 골수세포의 소핵유발에 영향을 주지 않는 것으로 판단된다.
- 02를 나타내었다(Table 4). 따라서 시험물질에 의해 세포 독성 수치가 뚜렷하게 증가하거나 감소하는 경향이 없었으며 모든 실험군에서 통계학적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
- 본 시험에서 설정한 용량범위 내에서 개체 당 2,000개의 PCE를 대상으로 소핵을 계수한 결과, 개체 당 2,000개의 PCE에서 관찰된 소핵을 가진 PCE의 빈도는 음성대조군, DG＋CLA 500 mg/kg 투여군, DG＋CLA 1,000 mg/kg 투여군, DG＋CLA 2,000 mg/kg 투여군 및 양성대조군의 순으로 평균 0.60±0.89, 1.00±0.71, 1.20±1.30, 0.60±0.89, 181.80±3.70을 나타내었다(Table 4).
- 본 시험에서는 소핵시험에 앞서 25마리의 ICR 마우스 수컷에게 시험물질인 DG＋CLA 500, 1,000 및 2,000 mg/kg과 양성대조물질을 경구투여한 후, 투여로 인한 사망동물 및 일반증상을 관찰한 결과, 모든 시험군에서 투여로 인한 사망 동물은 없었으며, 특이한 임상증상도 관찰되지 않았다. 체중 변화를 관찰한 결과, 시험 전 기간을 통하여 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다(Table 3).
- 골수검체는 5% Giemsa액으로 염색하며 소핵유발빈도를 검경하였다. 시험결과 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험에서, 모든 시험물질군의 다염성적혈구(Polychromatic erythrocyte, PCE) 중 소핵다염성적혈구(Micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)의 출현율은 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 증가는 관찰되지 않았다. 한편, 양성대조군의 다염성적혈구 중 소핵다염성적혈구의 출현율은 음성대조군과 비교하여 현저한 증가가 인정되었다.
- 음성대조군 및 양성대조군의 소핵유발빈도는 historical control date의 정상범위에 있었기 때문에 본 시험은 적절한 조건하에서 실시되었음이 확인되었다. 이상의 결과로 본 시험 조건하에서 시험물질인 공액리놀렌산이 함유된 디글리세라이드 조성물은 마우스 골수세포의 소핵유발에 영향을 주지 않는 것으로 판단된다.
- 본 시험에서는 소핵시험에 앞서 25마리의 ICR 마우스 수컷에게 시험물질인 DG＋CLA 500, 1,000 및 2,000 mg/kg과 양성대조물질을 경구투여한 후, 투여로 인한 사망동물 및 일반증상을 관찰한 결과, 모든 시험군에서 투여로 인한 사망 동물은 없었으며, 특이한 임상증상도 관찰되지 않았다. 체중 변화를 관찰한 결과, 시험 전 기간을 통하여 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다(Table 3).
- DG＋CLA의 최고 농도를 2,000 mg/kg으로 하여 이하 공비 2로 최고용량을 포함한 5용량의 시험물질을 경구투여 하였다. 투여 직후(0), 24, 48 및 72시간에 사망수 및 일반상태의 변화를 관찰한 결과, 사망동물은 없었으며 독성징후도 관찰되지 않았다(Table l). 이는 시험동물에서 DG＋CLA 2,000, 1,000, 500, 250, 125 mg/kg의 투여는 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
- 한편 양성대조군에서는 소핵 빈도에서 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의적인 증가를 나타내었다(p<0.01).
- 시험결과 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험에서, 모든 시험물질군의 다염성적혈구(Polychromatic erythrocyte, PCE) 중 소핵다염성적혈구(Micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)의 출현율은 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 증가는 관찰되지 않았다. 한편, 양성대조군의 다염성적혈구 중 소핵다염성적혈구의 출현율은 음성대조군과 비교하여 현저한 증가가 인정되었다. PCE/(PCE＋NCE)의 비는 시험물질군과 음성대조군을 비교하였을 때 통계학적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.