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문제 정의
- SWe와 SMe가 산화제애 의한 세포 손상을'직접 방지할 수 있는지를 확인하기 .위하여 소수성 .
- 예방할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 반응성 산소기를 발생시켜 신장 조직 손상을 유발하는 것으로 알려진 몇 가지 독성 약믈들에 외한 신장 조직손상율 SWe와 SMe가 방지할 수 있는지를 조사하고 두 약물의 효능의 차이휼 비교하고자 하였다.
- 25찌. 본 실험에서는 시험관 내 실험에서 CC1<가 신장 세포의 손상도 유발하는지를 확인하기 위해 LDH 유출 정도를 조사한 결과. 조직 절편을 ImM CCk에 노출시켰을 때 LDH 유츨은 거의 4배 가까이 증가함으로써 C3가 신장 조직을 손상시켰으며(Fig.
- 위에서와 같이 黃苓을 재료로 한 연구 동향들 중 세포 내 산화의 억제에 관한 연구들이 발표되고 있는 추세이므로 본 연구예서는 黄苓의 믈 추츨믈(SWe)과 메탄올 추출물(SMe)이 산화적 스트레스에 의한 횐쥐의 신장 조직 손상을 억제할 수 있는지를 확인하여 보았다.
- 인체 내에서 반응성 산소기들의 발생량이 많거나 항산화제 역할을 하는 물질들의 체내 농도가 감소하게 되면 세포는 손상을 받아서 여러가지 질병을 유발시키는 원인이 되기때문에1지3) 반응성 산소기를 제거하거나 발생을 억제하는약믈이 개발된다면 여러가지 형태의 생체 조직 손상을 방지하거나 예방할 수 있을 것이다. 이에 본 연구애서는사염화탄소(Cdi), menadione, tat-butyl hydropenjxids (tBHP), 수은을 사용하여 신장 조직 손상을 유발시킨 후 黃苓의 물 추출물과 메탄올 추출물이 산화적 스트레스에 의한 횐줘의 신장 조직 손상을 어떤 기전으로 보호하는지룰 관찰한 결과 유의성을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0.248mg/ml NADPH(143mM sodium phosphate, 6.3mM NarEDTA, pH. 7.5를 함유하고 있는) 용액 700(丄 6mM 5, 5'-dithiobis-2-nitrobenzoic add(DTNB) 용액 ]00d 와 증류수 198(4> cuvette에 넣어 30°C에서 15분간, 데운 후시료 20를 넣고 섞은 다음 266U/ml GSSG reductase 10 U 를 첨가하여 412nm에서 흡광도의 변화를 관찰하였고 단위는 wg/mg protein으로 나타내었다.
- CCk와 마찬가지로 반옹성 산소기를 발생시켜 세포독성을 나타내는 것으로 알려진 수은20) 을 이용하여 SWe와 SMe의 영향을 조사하였는데. 신장 조직에 O.
- QCk에 의한 신장 세포의 손상을 약물이 효과적으로 억제하는지를 시험관 내 실험을 통해 확인하기 위해 여러 농도의 SWe와 SMe가 들어있는 용액 내에서 lmM의 CCk를 신장 조직 절편에 처리하고 LDH 유출 정도를 조사하였다. 실험 결과에 나타내지는 않았지만 조직 절편에 아무런 처치를 하지 않은 상태에서 단순배양만 60분간 실시한 정상 배양군의 경우 LDH 유출은 &2H.
- 한국)로 lOOP에서 2시간 전탕한 후 추출액을 부직포를 이용하여 찌꺼기를 제거하였으며. SMe 추출을 위해서는 메탄올 1.500«1와 함께 실온에서 24시간 방치한 후 1차 추츨엑을 얻었으며 다시 메탄올 LOOOml를가한 후 24시간 실온에 방치한 후 2차 추츨엑을 얻은 후 1차 및 2차 추츨액을 합하여 감압 농축하였다. 위의 추출액 두 가지를 동결 건조기 (SFDSM06, 삼원.
- SWe 및 SMe가 산화제에 의한 세포 손상을 직접 방지할 수 있는지를 확인하기 위하여 2% 농도의 SWe 및 SMe를 처리하여 세포 손상 억제 효과를 관찰하였다. 정상 배양군에서는 8.
- 黃苓의 믈 추츨믈 (SWe) 과 메탄올 추출믈 (SMe) 을 얻기 위해 100g 씩으로 나누었으며, SWe 추츨을 위해서는 증류수 1.500 와 함께 전기 약탕기①WP-1800T, 대웅. 한국)로 lOOP에서 2시간 전탕한 후 추출액을 부직포를 이용하여 찌꺼기를 제거하였으며.
- 5)로 되어 있으며. 독성 약물을 처리할 때는 이들 약물이 들어있는 용액 내에서 60분 동안 배양하였다 배양 후에 조직을 들어내어 세포의 손상 정도를 조사하기 위하여 lactate dehydrogenase(LDH) 의 유출을 측정하였으며. 또한 세포 손상이 지질의 과산화와 연관이 있는지는 그 생성물인 malondWehyde(MDA) 의 함량을 측정하여 평가하였다.
- 독성 약물을 처리할 때는 이들 약물이 들어있는 용액 내에서 60분 동안 배양하였다 배양 후에 조직을 들어내어 세포의 손상 정도를 조사하기 위하여 lactate dehydrogenase(LDH) 의 유출을 측정하였으며. 또한 세포 손상이 지질의 과산화와 연관이 있는지는 그 생성물인 malondWehyde(MDA) 의 함량을 측정하여 평가하였다. 본 실험에서 각 추출물의 효과를 조사할 때는 용액 내에 적당한 농도로 녹여 사용하였다.
- 또한 세포 손상이 지질의 과산화와 연관이 있는지는 그 생성물인 malondWehyde(MDA) 의 함량을 측정하여 평가하였다. 본 실험에서 각 추출물의 효과를 조사할 때는 용액 내에 적당한 농도로 녹여 사용하였다.
- 위하여 소수성 .산화제29'인 tBHP에 신장 조직을 노출시킨 후 각 약물의 반응을 관찰하였다. 신장 조직을 ImM tBHP에 노출시킨 결과 LDH 유출이 증가하였다.
- 세포 손상을 일으키는지와. 수은에 의한 손상을 SWe 및 SMe가 억제할 수 있는지를 조사하였다. 신장 조직에 0.
- 신장 세포 손상에 따른 세포 M GSH의 함량에 미치는 2% 농도의 SWe와 SMe의 효과를 확인하기 위하여 배양액 내에 CO4< 처리하여조직 내 GSH 함량을 축정한 결과. LDH 유츨을 현저히 증가시키는 CCk hnM 농도에서의 .
- 신장 조직 손상 유발을 목적으로 사용된 산화제는 CO*, menadione, tBHP 및 수온을 사용하였으며 이로 인해 유발된 신장 조직 손상을 어떤 기전으로 억제하는지를 조사하였다.
- 신장조직 절편을 차가운 1.15%KC1 용액 (5%wt/vol) 속에서 파쇄 하여 이 조직 파쇄 균질액 0.5 ml 에 1%인산 용액 3 과 0.6%thiobarbituric acid 용액 1血을 첨가하여 끓는 물에서 45분간 가열하였다. n-Butanol 4 ml를 첨가하여 완전히 섞은 다음 2, 0TOxg에서 20분간 원심분리한 후, 상층액의 흡광도를 536nm와 520nm에서 측정하였다.
- 약물로 처리된 신장 조직 절편을 들어내어 증류수를 넣고 갈아서 만든 조직액과 배양 용액을 각각 50(d 취하여 LDH 활성을 LDH 측정 kit (아산제약, 한국를 이용하여 측정하였다.
- 8g의 SMe, 건조 추츨믈을 얻었다. 이들을 냉동실에 신선하게 보관하였다가 실험 직전예 필요한 농도로 배양액에 회석하여 사용하였다.
- SWe 및 SMe가 독성 약물에 의한 신장. 조직 손상을 방지할 수 있는지 확인하기 위하여 시험관내 실험을 통해 신장 세포 손상을 유발시킨 다음 이에 대한 각 약물의 효과를 조사하여 다음과 같은 결른을 얻었다.
대상 데이터
- 黄측은 시중(음니허브. 경북 영천. 한국)에서 구입하여 본 대학 본초학교실에서 精選하여 사용하였다.
- 기본 배양액의 조성은 130mM NaCl, 10mM KC1. 1.
-
1) 동물
동믈은 시험관 내 실험용으로 체중 200g 내외의 Sprague-Dawley 계 수컷 횐쥐를 대한실험동믈(대한실험동믈. 한국)에서 구입하여 본 대학 동믈 사육 실에서 고형사료(삼양사료, 한국)와 믈을 충분히 공급하면서 2 주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
- 실험용 횐쥐를 회생시킨 후 신장을 들어내어 100mM NaCl, 10mM KCL 1.5mM CaCM 40mM Tris-HCl로 된 차가운 용액 (pH, 7.5)을 신장 동맥 내에 주입하여 혈액을 제거한 다음 Stadie-Riggs microtome으로 약 0.3~0.5mn 두께의 신장 조직 절편을 만들어 사용하였다.
- 500«1와 함께 실온에서 24시간 방치한 후 1차 추츨엑을 얻었으며 다시 메탄올 LOOOml를가한 후 24시간 실온에 방치한 후 2차 추츨엑을 얻은 후 1차 및 2차 추츨액을 합하여 감압 농축하였다. 위의 추출액 두 가지를 동결 건조기 (SFDSM06, 삼원. 한국) 를 이용하여 각각 11.3g의 SWe과 7.8g의 SMe, 건조 추츨믈을 얻었다. 이들을 냉동실에 신선하게 보관하였다가 실험 직전예 필요한 농도로 배양액에 회석하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SAS(The SAS System for Windows, ver. 6.12, SAS Institute, U.S.A.)를 이용하였다 실험 성적은 평균±표준오차(mean 土 S.E.)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Students t-test로 검정하여 p- 값이 0.05미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- GSH 함량은 Anderson의 방법吟 으로. 측정하였다.
- n-Butanol 4 ml를 첨가하여 완전히 섞은 다음 2, 0TOxg에서 20분간 원심분리한 후, 상층액의 흡광도를 536nm와 520nm에서 측정하였다. MDA값은 단백질 lmg당 pmoles로 표시하였고 단백질 농도는 Bradford15' 의 방법으로 측정하였다.
- 신장 조직의 지질의 과산화는 그 산물인 MDA를 측정하여 평가하였다 신장 조직 내 MDA 함량은 Uchiyama와 Mihara의 방법으로 측정하였다. 신장조직 절편을 차가운 1.
성능/효과
- 5. 1.0 및 2%농도에서 SWe 및 SMe 모두가-신장 조직의 손상을 억제하였으며 SMe 투여가 더 효과적이었다.
- 5, 1. 2% 농도로 첨가하였을 때 각각의 약물의 농도에 비례하여 CCk에 의한 LDH 유출이 감소하였으며 모두 대조 배양군과 유의한 차이를 보였다.
- 신장 조직을 ImM tBHP에 노출시킨 결과 LDH 유출이 증가하였다. 2%농도의 SWe와 SMe를 첨가한 경우에는 LDH 유츨이 SMe의 경우에만 유의하게 감소하였다(Fig. 4). 그러므로 위와 같은 결과로 미루어보면 SMe는 산화제에 의한 반응성 산소기의 발생을 억졔함으로쩌 신장 조직의: 손상을.
- 2. 신장 조직을 ImM CCk에 노출시키면서 2% 농도의 SMe를 처치한 경우 신장 조직 내 GSH 함량이 증가하였다.
- 3. 신장 조직에 ImM menadione을 처리했을 때 SMe의 경우에서만 조직 내 LDH 유출의 감소를 나타내었다.
- 4. 신장 조직을 ImM tBHP에 노츨시켰을 때 2% 농도의 SMe를 첨가한 경우에 LDH 유츨의 감소가 나타났다
- 5. 신장 조직에 0.5mM 수은을 처리하면서 SWe 및 SMe를 처리한 경우 신장 조직에서의 LDH 유출과 지질의 과산화가 유의하게 감소되었다.
- 1). CCk를 처리한 용액 내에 SWe와 SMe를 0.5, 1.0및 2%농도로 각각 첨가하였을 때 각 약믈의 농도에 비례하여 CCk에 의한 LDH 유츨이 유의하게 감소하였다. 그러나 각 농도에서 SWe와 SMe 사이에도 유위한 차이가 있었으므로 CCh 에 의한 세포 손상에 SMe 투여가 더 효과적임올 알 수 있다.
- 2%로 증가하였다. SWe 및 SMe를 처리하였을 경우 SWe의경우 LDH 유츨에 감소의 경향이 있었으나 통계적으로 유의하지는 않았으며, SMe의 경우에는 LDH 유출이 13.1H.4%로 유의하게 감소하였다(Fig. 4).
- SWe와 SMe가 포함된 배양엑과 포함되어있지 않은배양엑 내에 CCk를 처리하여 조직 내 GSH 함량율 측정한 결과 정상 베양군의 경우 432t5.1 umde/g prot的in이었던 것이 ImM 농도외 冋가 처치된 대조 베 양군에서는 13.1±3.2 umole/g protein으로 감소하였다.
- 淘. 따라서 본 실험에서 SMe의 경우 CCU 에 의한 세포 내 GSH의 감소현상을 방지한 결과로 반응성 산소기를 제거하여 LDH의 유출을 방지하는 작용에 영향을 받았지만 SWe의 경우 이와는 다른 작용에 의한 것으로 추측된다. 이에 대해서는 앞으로 추가적인 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
- 5). 수은이 신장 조직 손상을 일으키는 농도에서 지질의 과산화를 유발하는지를 조사한 결과, 0.5mM 수은을 처리했을 때 지질의 과산화가 증가하였고, 2% 농도로 SWe 및 SMe룔 첨가하였을 때 모두 유의하게 감소하였다(Fig. 6).
- 수은이 신장 조직 손상을 일으키는 농도에서 지질의과 산화를 일으키는지를 조사한 결과, 0.5mM 수은을 처리했을 떄 지질의 과산화가 81.5±7.3 pmole MDA/mg protein에서 208.4±10.8 pmole MDA/mg protein로 증가하였고, 2% 농도의 SWe와 SMe를 처리하였을 경우 150.6±13.6 pmole MDA/mg protein과 122.6±6.5 pmole MDA/mg protein로 유의하게 감소하였다(Fig. 6).
- 수은에 의한 손상을 SWe 및 SMe가 억제할 수 있는지를 조사하였다. 신장 조직에 0.5mM 수은을 처리했을 때 LDH 유츨이 11.7±2.3%에서 25.6±4.7%로 증가하였고, 여기에 각각 2% 농도의 SWe 및 SMe를 처리하였을 때 16.4±1.5%와 14.8±1.9%로 모두 유의하게 감소하였다(Fig. 5).
- 신장 조직에 ImM menadione을 처리했을 때 LDH 유출이 6.2±1.1%애서 23.5±4.2%로 현저하게 증가하였으며, 여기에 SWe 및 SMe를 처리하였을 경우 각각 17.6±1.8% 및 11.8±1.7%로 나타나 SMe의 경우 유의하게 세포 손상이 억제되었다(Fig. 3).
- 따라서 SWe와 SMe가 항산화 작용에'의해 세포손상을 방지 한다면 menadione에 의한 LDH 유출을 감소시킬 수 있을 것이다. 신장 조직에 ImM, menadione을 처리했을 때 LDH 유츨은 현저하게 증가하였으며. 여기에 SWe와 SMe를 2%농도로 첨가한 결과 LDH 유출은 SMe의 경우에서만 유의하게 감소하였다(Fig.
- 산화제29'인 tBHP에 신장 조직을 노출시킨 후 각 약물의 반응을 관찰하였다. 신장 조직을 ImM tBHP에 노출시킨 결과 LDH 유출이 증가하였다. 2%농도의 SWe와 SMe를 첨가한 경우에는 LDH 유츨이 SMe의 경우에만 유의하게 감소하였다(Fig.
- 조사하였다. 실험 결과에 나타내지는 않았지만 조직 절편에 아무런 처치를 하지 않은 상태에서 단순배양만 60분간 실시한 정상 배양군의 경우 LDH 유출은 &2H.4%였으며 ImM CCk에 노출시킨 대조 배양 군에서의 27.3H.2%에 비해 거의 4배 가까이 증가함으로써 CCk가 시험관 내에서도 간조직 손상을 일으키고 있음을 확인하였다(Fig. 1). CCK를 처리한 용액 내에 SWe와 SMe를 각각 0.
- 5mM 수은을 처리했을 떼의 LDH 유츨이 증가하였고. 여기에 2% 농도로 약재 추츨믈을 첨가하였을 때 두 약제의 경우 모두 세포의 손상이 유의하게 감소하였으며 (Fig. 5). 수은이 신장 조직 손상을 일으키는 농도에서 지질의 과산화를 유발하는지를 조사한 결과, 0.
- 신장 조직에 ImM, menadione을 처리했을 때 LDH 유츨은 현저하게 증가하였으며. 여기에 SWe와 SMe를 2%농도로 첨가한 결과 LDH 유출은 SMe의 경우에서만 유의하게 감소하였다(Fig. 3).
- 이상과 같이 SWe와 SMe는 독성 약믈에 의한 신장조직의 손상에 유효하였으며 SMe가 SWe 보다 그 효과가 뛰어났다. 따라서 한약재의 추츨에 따른 화학적 변화와 이에 따른 효과의 차이에 대한 더욱 자세한 기전에 관해서는 앞으로 더욱 많은 연구를 진행하여야 할 것으로 생각된다.
후속연구
- 반응성 산소기는 인체 여러 조직에서 허혈/재관류에 의한 세포 손상, 그리고 사염화탄소, menadione, 수은, 알콜, paraquat 등 여러종류의 독성 물질에 의한 세포, 손상의 병인으로 인정되고 있기 때문에"%) 반응성 산소기를 제거하거나 발생을 억제하는 약물이 개발된다면 여러가지 형태의 신장 조직 손상을 방지하거나 예방할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 반응성 산소기를 발생시켜 신장 조직 손상을 유발하는 것으로 알려진 몇 가지 독성 약믈들에 외한 신장 조직손상율 SWe와 SMe가 방지할 수 있는지를 조사하고 두 약물의 효능의 차이휼 비교하고자 하였다.
- 뛰어났다. 따라서 한약재의 추츨에 따른 화학적 변화와 이에 따른 효과의 차이에 대한 더욱 자세한 기전에 관해서는 앞으로 더욱 많은 연구를 진행하여야 할 것으로 생각된다.
- 그 정도에 있어서는 SMe가 SWe 보다 훨씬 뛰어남을 보였다. 이러한 실험 결과는 한의학에서 약물을 추출 또는 煎湯하는 과정에 거치게 되는 여러 화학적 변화를 통해 한약재가 가지고 있는 고유의 성질에 많은 변화가 일어나 이로 인해 생체에 각기 다른 양상으로 그 효과가 나타나는 것으로 생각되는데 이러한 효과들에 대한 더욱 자세한 기전과 한약재 추출 방법의 다양화에 관해서는 앞으로 더욱 많은 연구를 진행하여야 할 것으로 생각된다.
- 따라서 본 실험에서 SMe의 경우 CCU 에 의한 세포 내 GSH의 감소현상을 방지한 결과로 반응성 산소기를 제거하여 LDH의 유출을 방지하는 작용에 영향을 받았지만 SWe의 경우 이와는 다른 작용에 의한 것으로 추측된다. 이에 대해서는 앞으로 추가적인 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
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