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문제 정의
- 2에 rhamnose C-6 signal이 나타난다. 따라서 본 화합물은 flavonoid0]] rhamnose와 다른한개의 당이 결합한 배당체로 추정하고 당의 종류를 확인하기 위하여 compound 1을 5% 황산으로 가수분해하여 glucose 와 rhamnose를 확인하였다. 당의 결합위치를 확인하기 위하여 HMBC spectrum을 검토한 결과, fucose C-2와* rhamnose H-l, C-7과 glucose H-l, C4와 methoxyl기의 proton 사이에 cross peak를 확인함으로써, 이 화합물은 neohesperidosidee]- isosakuranetine 7번 위치에 결합된 poncirin으로 결론짓고 문헌30)에 소개된 spectral data와 비교하여 동정하였다.
- 피부 melanin 생합성을 저해하는 물질을 천연물로부터 분리 , 구조를 규명하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 문헌 둥에 소개되어 있거나, 민간에서 피부에 관련하여 사용되고 있는 100종의 고등식물을 MeOH로 추출하고 이를 다시 CH2C12, EtOAc.
제안 방법
- 따라서 이 화합물은 탄소수가 12개이고, benzene rkig의 1, 4위치가 치환된 구조로 치환기는 이중결합 및 methoxy기를 포함하는 것으로 추정하였다. 1H-1H COSY spectrum을 통하여 각 proton들 간의 인접관계를 확인하였고, HMQC spectnim어서 각 proton과 carbon을 assignment하였으며, HMBC spectrum에서 C-1'과 H-5, 이과 methoxy기의 proton 사이의 cross peak를 확인함으로써, 이 화합물은 avenalumic acid methyl ester로 결론짓고 문헌%에 소개된 spectral data와 비교하여 동정하였다. 분리된 화합물의 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생성 억제 효과를 kojic acid를 비교 물질로 하여 즉정한 결과를 Table Ⅱ에 나타내었다.
- - 지실 6 kg을 MeOH로 상온에서 일주일씩 3회 반복 추출하여, 추출액을 모아 감압 농축하였다. 감압 농축한 MeOH 추출액을 증류수에 현탁시키고, 동량의 CH2CI2를 가하여 CH2C12 층과 H2O 층을 분 획하는 조작을 3회 반복 실시한 후, CH2C12 층을 감압 농축 하여 CH2Q2 분획을 얻었다. 남은 H2O 층에 다시 ethyl acetate (EtOAc> 동량 가해서 H2O 층과 EtOAc 층을 분획하는 조작을 3회 반복 실시한 후, EtOAc 층을 감압 농축하여 EtOAc 분획을 얻고, 나머지를 H2O 분획으로 하였다.
- 5 N perchloric acid로 2회 반복 주출하고 cold ethanol/ether(3:l)로 2회 반복 추출한 뒤 ethyl ether로 추출하여 건조시켰다. 건조물에 1N NaOH 용액 1 ml를 첨가한 후 5분간 꿇는 물에서 처리하여 멜라닌을 녹인 다음 405 nm에서 ELISA reader로 홉광도를 측정하여 control과 비교하였다.
- 본 연구실에서는 B-16 mouse melanoma 세포주에서 melanin 생합성에 대하여 저해활성이 있는 물질을 천연물로부터 개발 하고자 약 100여종의 국산 자원식물을 methanol (MeOH)로 추출하고 이를 유기용매와 물로 분획하여 시료를 조제하고, 각각의 시료를 이용하여 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생성 저해 활성을 측정하였다(Table I). 그 결과 비교적 강한 활성을 나타낸 지실로부터 melanin 생성 저해활성 물질을 분리, 구조를 규명하고 활성을 측정하였다.
- Compound 2의 ‘H-NMR 및 13C-NMR spectrume compound 1과 매우 유사한 pattemi- 보여 골격 구조가 같은 화합물로 추정되었다. 그러나 compound 1에서 관찰되는 4-methoxy기의 signal이 관찰되지 않아 이 화합물은 지실에서 분리되어 보고된 naringin으로 결론짓고 문헌지에 소개된 spectral data와 비교하여 동정하였다.
- 감압 농축한 MeOH 추출액을 증류수에 현탁시키고, 동량의 CH2CI2를 가하여 CH2C12 층과 H2O 층을 분 획하는 조작을 3회 반복 실시한 후, CH2C12 층을 감압 농축 하여 CH2Q2 분획을 얻었다. 남은 H2O 층에 다시 ethyl acetate (EtOAc> 동량 가해서 H2O 층과 EtOAc 층을 분획하는 조작을 3회 반복 실시한 후, EtOAc 층을 감압 농축하여 EtOAc 분획을 얻고, 나머지를 H2O 분획으로 하였다. 얻어진 CH2C12 분획, EtOAc 분획, H2O 분획 중 B-16 mouse melanoma 세포주에서 melanin 생성 억제효과를 강하게 보인 H2O 분획(150 g)을 MCI-gel CHP-20P에 loading하고 MeOH-H2O (1:9, 1:4, 3:7, 2:3, 1:1, 1:0)를 용출액으로 하여 fr 1부터 fr 5를 얻었다.
- 따라서 본 화합물은 flavonoid0]] rhamnose와 다른한개의 당이 결합한 배당체로 추정하고 당의 종류를 확인하기 위하여 compound 1을 5% 황산으로 가수분해하여 glucose 와 rhamnose를 확인하였다. 당의 결합위치를 확인하기 위하여 HMBC spectrum을 검토한 결과, fucose C-2와* rhamnose H-l, C-7과 glucose H-l, C4와 methoxyl기의 proton 사이에 cross peak를 확인함으로써, 이 화합물은 neohesperidosidee]- isosakuranetine 7번 위치에 결합된 poncirin으로 결론짓고 문헌30)에 소개된 spectral data와 비교하여 동정하였다.
- 본 연구실에서는 B-16 mouse melanoma 세포주에서 melanin 생합성에 대하여 저해활성이 있는 물질을 천연물로부터 개발 하고자 약 100여종의 국산 자원식물을 methanol (MeOH)로 추출하고 이를 유기용매와 물로 분획하여 시료를 조제하고, 각각의 시료를 이용하여 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생성 저해 활성을 측정하였다(Table I). 그 결과 비교적 강한 활성을 나타낸 지실로부터 melanin 생성 저해활성 물질을 분리, 구조를 규명하고 활성을 측정하였다.
- 玦0로 분획한 각각의 시료를 대상으로 하여 150 |ig/ml의 농도에서 B-16 mouse melanoma cell lines을 이용한 미백 활성을 검토한 결과, 51종의 시료(17%)가 20% 이상의 melanin 생성 억제효과를 나타냈으며, 신이의 CH2C12 분획 (80%), 백출의 H2O 분획 (61%), 지실의 CH2C12 분획(56%), H2O 분획 (53%)이 강한 저해 활성을 나타내었다. 본 연구에서는 지실의 분획 중에서 세포독성을 나타내지 않고 melanin 생합성 저해활성만을 나타낸 지실의 H2O 분획에 대하여 각종 column chromatography를 이용, 활성지향적 분리를 시도하여 4종의 화합물을 분리하였다.
- 29) 즉, B-16 mouse melanoma cell lines을 EMEM(10% fetal FCS) 배지를 사용하여 T-75 culture flask에서 confluencee}- 될 때까지 배양한 후, culture dish에 cell number/? 1 x 106/dish 이상이 되도 록 seeding한 후 1일간 더 배양하였다. 시험물질을 working concentratione 100배 이상으로 제조하여 0.5% DMSO 또는 ethanol 등의 용매에 녹인 후 첨가하여 1일간 배양하였다. 배지를 교환한 후 2일간 더 배양한 뒤 생성된 멜라닌의 양을 정량하였다.
- 9에 두 개의 methyl group에 의한 signal과 8 70고에 ester methylene carbon signal 이 관찰된다. 이상의 spectral data의 검토 결과 본 화합물은 bis(2- methylheptyl)phthalate으로 결론짓고 문헌32)에 소개된 spectral data와 비교하여 동정하였다.
대상 데이터
- Fraction collector는 Advante(渭 SF-160을 사용하였다. ‘H 및 13C-NMR spectrume Broker ARX 250 (250 MHz) spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다. EIMS spectrume micromass mass spectrometer (AUTOSPEC, UK)를 사용하였다.
- - 실험에 사용된 재료들은 서지학적인 정보를 토대로 하여 한방이나 민간에서 미백효과를 목적으로 사용하고 있거나, 혹은 피부에 적용하는 한약이나 민간약을 한약재상을 통하여 구입하거나 채집을 통하여 수집하고 전문가의 확인을 거쳐 사용하였다.
- 발색 시약은 vanillinsulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ ethanol용액, anisaldehyde sulfuric acid 시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.5 N hyperchloric acid,cold ethanol/ethyl ether (3:1), 1 N NaOH solution, hemacyto- mether, microcentrifuge, UV/VIS spectrophotometer, B-16 mouse melanoma 세포주이다.
- TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography고정 상은 silicagel (70 - 230 mesh, Merck), Sephadex LH-20 (25 - 100 (I, Sigma), MCI-gel CHP-20P (75 - 150 [i, Mitsubishi Chem. Co.), RP-18 (40- 63 Jim, Merck), Toyopearl HW-40F (Tosho), Cosmosil (Nacalai tesque) 등을 사용하였다. 발색 시약은 vanillinsulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ ethanol용액, anisaldehyde sulfuric acid 시액을 사용하였다.
- ‘H 및 13C-NMR spectrume Broker ARX 250 (250 MHz) spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다. EIMS spectrume micromass mass spectrometer (AUTOSPEC, UK)를 사용하였다. 추출 및 column chromatography용 용매는 시약용 1급을 사용하였다.
- 선광도는 JASCO의 DIP-1000(digital polarimeter, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec HI를 사용하였다. Fraction collector는 Advante(渭 SF-160을 사용하였다. ‘H 및 13C-NMR spectrume Broker ARX 250 (250 MHz) spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다.
- 추출 및 column chromatography용 용매는 시약용 1급을 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography고정 상은 silicagel (70 - 230 mesh, Merck), Sephadex LH-20 (25 - 100 (I, Sigma), MCI-gel CHP-20P (75 - 150 [i, Mitsubishi Chem.
- ), RP-18 (40- 63 Jim, Merck), Toyopearl HW-40F (Tosho), Cosmosil (Nacalai tesque) 등을 사용하였다. 발색 시약은 vanillinsulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ ethanol용액, anisaldehyde sulfuric acid 시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.
이론/모형
- 기기 및 시약 - 융점은 Fisher-Johns의 Melting Point Apparatus# 사용하여 측정하였으며, 온도는 보정하지 않았다. 선광도는 JASCO의 DIP-1000(digital polarimeter, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec HI를 사용하였다.
- 기기 및 시약 - 융점은 Fisher-Johns의 Melting Point Apparatus# 사용하여 측정하였으며, 온도는 보정하지 않았다. 선광도는 JASCO의 DIP-1000(digital polarimeter, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec HI를 사용하였다. Fraction collector는 Advante(渭 SF-160을 사용하였다.
성능/효과
- 1. 피부 melanin 생합성을 저해하는 물질을 천연물로부터 개발하고자 약 100여종의 고등식물을 대상으로 B-16 mouse melanoma cell lines을 이용한 미백 활성을 검토한 결과, 지실의 MeOH 추출물의 물분획이 melanin 생합성을 강하게 억제한다는 사실을 알고 활성물질의 분리를 시도하여 4종의 화합물을 분리하였다. 분리된 4종의 화합물들은 물리화학적 특성 및 각종 spectral data의 검토 결과 각각 poncirin (1), naringin (2), bis(2-methytheptyl)phthalate (3), avenalumic acid metliyl ester (4)로 결정하였으며, B-16 melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성 저해 활성은 kojic a* cid 비교 물 질로 하여 즉정한 결과, bis(2-methytheptyl)phthalate (3)가 IC50 value 36.
- 3아) Melanine 표피 기저층에 존재하는 melanocyte 내의 소기관인 melanosome에서 생합성 되며, melanocyte의 수지상 돌기를 통하여 주위의 keratinocyte로 전달되고, 피부의 각질층으로 이행된다.5) Melanosome 내에서의 melanin 생성과정은 tyrosine이 tyrosinase의 작용에 의해 dopa, dopaquinone으로 산화되고, 이들은 효소의 작용 및 자동 산화 반응에 의해 dopachrome, indole carboxylic acid, indole quinone류 등으로 대사되어 최종적으로 melanin을 합성한다.6-8) Melanocyte 안에서 melanin 색소 생산에 관여하는 인자로는 tyrosinase6) 이외 에도 각종 prostaglandine, 9) interferon, 10) melanocyte stimulating hormone(MSH), 11'12) vitamin D3, 13) histamine,gene expression에 관여하는 인자14) 등이 보고되었다.
- 68에 H-2'에 해당하는 2H의 proton signal이 관찰된다. “GNMR에서 aliphatic 영역에 8개만의 carbon signal이 관찰되는 것으로 보아 본 화합물은 대칭구조를 하고 있는 것을 알 수 있으며, 8 16.0과 12.9에 두 개의 methyl group에 의한 signal과 8 70고에 ester methylene carbon signal 이 관찰된다. 이상의 spectral data의 검토 결과 본 화합물은 bis(2- methylheptyl)phthalate으로 결론짓고 문헌32)에 소개된 spectral data와 비교하여 동정하였다.
- 문헌 둥에 소개되어 있거나, 민간에서 피부에 관련하여 사용되고 있는 100종의 고등식물을 MeOH로 추출하고 이를 다시 CH2C12, EtOAc. 玦0로 분획한 각각의 시료를 대상으로 하여 150 |ig/ml의 농도에서 B-16 mouse melanoma cell lines을 이용한 미백 활성을 검토한 결과, 51종의 시료(17%)가 20% 이상의 melanin 생성 억제효과를 나타냈으며, 신이의 CH2C12 분획 (80%), 백출의 H2O 분획 (61%), 지실의 CH2C12 분획(56%), H2O 분획 (53%)이 강한 저해 활성을 나타내었다. 본 연구에서는 지실의 분획 중에서 세포독성을 나타내지 않고 melanin 생합성 저해활성만을 나타낸 지실의 H2O 분획에 대하여 각종 column chromatography를 이용, 활성지향적 분리를 시도하여 4종의 화합물을 분리하였다.
- 분리된 4종의 화합물 전반에 걸쳐 melanin 생성 억제활 성이 나타났으며, 그 중 bis(2-methytheptyl)phthalate가 가장 강한 억제활성을 나타내었다(IC% Value : 36.8 μM) (Fig. 1) (Table I) (Table II).
- 피부 melanin 생합성을 저해하는 물질을 천연물로부터 개발하고자 약 100여종의 고등식물을 대상으로 B-16 mouse melanoma cell lines을 이용한 미백 활성을 검토한 결과, 지실의 MeOH 추출물의 물분획이 melanin 생합성을 강하게 억제한다는 사실을 알고 활성물질의 분리를 시도하여 4종의 화합물을 분리하였다. 분리된 4종의 화합물들은 물리화학적 특성 및 각종 spectral data의 검토 결과 각각 poncirin (1), naringin (2), bis(2-methytheptyl)phthalate (3), avenalumic acid metliyl ester (4)로 결정하였으며, B-16 melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성 저해 활성은 kojic a* cid 비교 물 질로 하여 즉정한 결과, bis(2-methytheptyl)phthalate (3)가 IC50 value 36.8 μM로 가장 강하였다.
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