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문제 정의
- 이에 본 연구진은 백출의 메탄올 추출물로부터 항암활성성분을 분리하고자 용매분획과 반복적인 칼럼크로마토그래피를 실시하여 추출물을 정제한 결과 최종적으로 4종의 sesquiterpene (1-4) 화합물 및 1종의 acetylene 화합물(5)을 얻었으며 이들의 이화학적 성상 및 기기분석 자료로부터 그 구조를 확인 동정하였다. 아울러 이들 화합물들의 암세포에 대한 in vitro 세포 증식 저해효과를 연구하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 생약재 백출의 MeOH 추출물은 A549 (인체유래 비소세 포암주) 둥 5종의 인체유래 암세포주에 대하여 농도의존적으로 양호한 세포증식저해효과를 나타내었다. 백출의 뿌리MeOH 추출물을 활성 유도 분획법 (Bioactivity-directed fractionation)0]] 따라 chromatography로 정제한 결과 사종의 ses- quiterpenoid 화합물과 1종의 polyacetylene 화합물을 활성성분으로 분리 정제하였다. 분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (^-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, atractylon (1), atractylenolide I (2), atractylenolide Ⅲ(3), eudesma-4(15), 7(ll)-dien-8-one (4) 및 diacetyl-atractylodiol (5)로 확인 동정되었다.
- 분리 및 정제 - 77-hexane 분획 (180 g)을 SiO2 column chromatography (hexane : ethylacetatee10:1-1:1) 실시하여 7개의 분획 (Hl~H7)로 나눈 후, 그 중 H3 (59 g) 분획을 ^-hexane:EtOAc (1:1)를 유출 용매로 재차 SiO2 column chromatography를 수행하여 다섯개의 소분획 (H31~H35) 으로 나누었다. 이 중 소분획 H31 (42 g)을 SiO2 column chromatography (-hexane:EtOAc=l:l)를 시행하여 무색 침 상 화합물 1 (12 g)을 얻었으며, H35 (2 g)을 RP-18 column chromatography (90% MeOH)를 시행하여 무색 침상 화합물 2 (270mg>을 얻었다.
- 기기 및 시약 - NMRe Brucker의 ANP300과 AMX 500 을 사용하였다. 선광도는 JASCO DIP-4 digital p* olarimetei 사용하였고, low resolution MS (70 eV)는 JEOL사의 JMS- DX 303 mass spectrometer를 시용하였으며, column packing 용 silica gele Kiesel gel 60 (Merck)를 사용하였고, TLC plate는 Kiesel gel 60F254 (Merck}을 사용하였다. 발색'시약 은 10% JESQ을 사용하였으며 UV 254nm, 365nm에서 검줄하였다.
- 한편, 본 연구진은 A549 (인체유래 비소세포암주) 등 5종의 인체유래 암세포주를 대상으로 하여 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과를 지표로 하여 300여종의 생약재 추출물들의 항암효능 을 검색하여 본 결과 생약재 백출의 MeOH 추출물이 농도 의존적으로 양호한 종양세포증식 저해효과를 보여주고 있음을 알 수 있었다. 이에 본 연구진은 백출의 메탄올 추출물로부터 항암활성성분을 분리하고자 용매분획과 반복적인 칼럼크로마토그래피를 실시하여 추출물을 정제한 결과 최종적으로 4종의 sesquiterpene (1-4) 화합물 및 1종의 acetylene 화합물(5)을 얻었으며 이들의 이화학적 성상 및 기기분석 자료로부터 그 구조를 확인 동정하였다. 아울러 이들 화합물들의 암세포에 대한 in vitro 세포 증식 저해효과를 연구하였기에 보고하고자 한다.
- 추출 및 용매분획 - 건조중량 6 kg의 세절한 백출을 상 온에서 methanol 60 L로 1주일간 냉침(3회 반복)한 후 여액 을 모아 수욕상에서 감압 농축하여 MeOH 엑기스 940 g을 얻었으며, 이를 증류수 20 L에 현탁시킨 후 n-hexane, ethyl acetate (EtOAc) 및 butanol (BuOH)의 순으로 단계적으로 주줄한 결과 n-hexane 분획 180g, EtOAc 분획 110g 및 BuOH 분획 20 g을 얻었다.
- 화합물 4는 무색 오일상의 화합물로서, ELMS (M+, 218), H-NMR, 13C-NMR data를 통해 이 화합물의 분자식으로 추정하였다. H-NMR data에서 8 0.
대상 데이터
- 기기 및 시약 - NMRe Brucker의 ANP300과 AMX 500 을 사용하였다. 선광도는 JASCO DIP-4 digital p* olarimetei 사용하였고, low resolution MS (70 eV)는 JEOL사의 JMS- DX 303 mass spectrometer를 시용하였으며, column packing 용 silica gele Kiesel gel 60 (Merck)를 사용하였고, TLC plate는 Kiesel gel 60F254 (Merck}을 사용하였다.
- 생약재 백출의 MeOH 추출물은 A549 (인체유래 비소세 포암주) 둥 5종의 인체유래 암세포주에 대하여 농도의존적으로 양호한 세포증식저해효과를 나타내었다. 백출의 뿌리MeOH 추출물을 활성 유도 분획법 (Bioactivity-directed fractionation)0]] 따라 chromatography로 정제한 결과 사종의 ses- quiterpenoid 화합물과 1종의 polyacetylene 화합물을 활성성분으로 분리 정제하였다.
- 주출, 분획 및 column chromatography용 시약 은 1급 시약을 정제 없이 사용하였고나머지 시약은 1급 시 약을 정제해서 사용하거나 특급 시약을 사용하였다. 세포독성 실험은 sulforhodamin B(SRB) bioassay방법을 응용하여 수행하였다 실험에 사용한 암세포주들은 A549 (non small cell lung carcinoma), SK-OV-3 (ademoncarcinoma, ovary malignant ascites), SK-MEL-2 (malignant melanoma, metastasis to skin of thigh), XF-498 (central nerve system tumor) 및 HC15 (colon adenocarcinoma)이며 모두 human origin tumor cell line들로써, 미국의 국립암연구소(NCI)로부터 분양받아 한국화학연구원에서 계대배양 중인 것을 사용하였다,
- 화합물 2는 무색 침상 화합물로서 , EI-MS ([M]+, 230) 및 ]H-NMR, 13C-NMR data를 통해 이 화합물의 분자식은 C15H1Q2으로 주정하였다. 1H-NMR spectrum에서는 6 0.
성능/효과
- 화합물 1은 무색 침상 물질로서 ELMS ([M]+, 216) 및 1H-NMR, , 3C-NMR data를 통해 이 화합물의 분자식임을 알 수 있었으며 mp, [a]D, 1H-NMR, i3C-NMR data를 기존 문헌'"과 비교한 결과 furano-sesquiterpenoid type의 atractylon으로 동정하였다.
- 화합물 4는 무색 오일상의 화합물로서, ELMS (M+, 218), H-NMR, 13C-NMR data를 통해 이 화합물의 분자식으로 추정하였다. H-NMR data에서 8 0.78, 1.82 및 1.99 ppm에서 3개의 methyl group을 각각 관찰할 수 있었으며 , 5 4.61 및 4.85 ppm에서 각각 exocyclic methylene proton signal들을 관찰할 수 있었다.-NMR에서는 세 개의 methylsignal (8 17.
- 3 ppm에서 carbonyl carbon sign아을 관찰할 수 있었다. 기타 mp, [a]D 등 물리 화학적 data 및 ‘H-NMR, 13C- NMR data을 기존 문헌과 비교한 결과 fiirano-sesquiter- penoid type의 atractylenolide I으로 확인하였다.
- 5ppm)을 관찰되었다. 따라서 화합물 4는 eudesmane typeeudesma-4(l5), 7(ll)-dien-8-one [selina-4(15), 7(ll)-dien-8-one|로서 추정할 수 있었고 기존 문헌과 비교한 결과 일치함을 확인하였다.
- 분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (^-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, atractylon (1), atractylenolide I (2), atractylenolide Ⅲ(3), eudesma-4(15), 7(ll)-dien-8-one (4) 및 diacetyl-atractylodiol (5)로 확인 동정되었다. 분리된 화합물(1-5)들 을 각각 SRB 방법으로 5종의 인체유래 종양세포주에 대하여 시험관 내 암세포성장저해효과를 검색하여 본 결과 atractylenolide I (2)이 가장 우수한 항암효과를 나타내었으며 화합물 3-5 등의 경우 역시 양호한 효능를 나타내었다.
- 백출의 뿌리MeOH 추출물을 활성 유도 분획법 (Bioactivity-directed fractionation)0]] 따라 chromatography로 정제한 결과 사종의 ses- quiterpenoid 화합물과 1종의 polyacetylene 화합물을 활성성분으로 분리 정제하였다. 분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (^-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, atractylon (1), atractylenolide I (2), atractylenolide Ⅲ(3), eudesma-4(15), 7(ll)-dien-8-one (4) 및 diacetyl-atractylodiol (5)로 확인 동정되었다. 분리된 화합물(1-5)들 을 각각 SRB 방법으로 5종의 인체유래 종양세포주에 대하여 시험관 내 암세포성장저해효과를 검색하여 본 결과 atractylenolide I (2)이 가장 우수한 항암효과를 나타내었으며 화합물 3-5 등의 경우 역시 양호한 효능를 나타내었다.
- 함유성분으로는 acetaldehyde, furfural, atractylon, diacetylatractylodiol 등이 보고되고 있다. 한편, 본 연구진은 A549 (인체유래 비소세포암주) 등 5종의 인체유래 암세포주를 대상으로 하여 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과를 지표로 하여 300여종의 생약재 추출물들의 항암효능 을 검색하여 본 결과 생약재 백출의 MeOH 추출물이 농도 의존적으로 양호한 종양세포증식 저해효과를 보여주고 있음을 알 수 있었다. 이에 본 연구진은 백출의 메탄올 추출물로부터 항암활성성분을 분리하고자 용매분획과 반복적인 칼럼크로마토그래피를 실시하여 추출물을 정제한 결과 최종적으로 4종의 sesquiterpene (1-4) 화합물 및 1종의 acetylene 화합물(5)을 얻었으며 이들의 이화학적 성상 및 기기분석 자료로부터 그 구조를 확인 동정하였다.
- 한편, 분리 정제된 각 화합물(L5)를 각각 SRB 방법으로 A549 (비소세포폐암주), SK-OV-3 (난소암주), SK-MEL-2 (피부종양주), XF-498 (중추신경계종양주) 및 HCT-15 (직장 종양주) 등 5종의 인체유래 종양세포주에 대한 시험관 내 세포증식 저해 효과를 검색하여 본 결과 atractylenide I (2)의 경우 각각의 암세포주에 대한 IC50 (50% 세포증식저해효과를 나타내는 농도) 치가 각각 7.6 μg/m/ (A549), 13.6 jig/ ml (SK-OV-3), 8.7 μg/m/ (SK-MEL-2), 13.0 gg/m; (XF498) 및 9.9 gg/rn/ (HCT15) 등으로 관찰되어 우수한 종양세포증식 저해효과를 나티내었으며 atractylenolide Ⅲ (3), eudesma- 4( 15), 7( 1 l)-dien-8-one (4), diacetyl-atractylodiol (5)둥 화합물도 양호한 항암효과를 나타내었다 (Table I).
- 화합물 3은 무색 침상 화합물로서 EI-MS, ]H-NMR 및 13C-NMR data를 화합물 2의 그것들과 비교하여 본 결과 화합물 3은 화합물 2의 olefin 구조가 hydration이 된 화학구조로 이루어져 있음을 유추할 수 있었으며 문헌)검색 결과 화합물 3은 atractylenolide I (2)의 A8, 9 olefin 구조에 hydration이 일어난 atractylenolide Ⅲ으로 동정할 수 있었다.
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