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문제 정의
- 특히 천연물 및 식품류에 포함되어있는 폴리페놀성 화합물들은 항산화, 암세포 성장억제, 항돌연변이 등 다양한 생리활성을 나타내어 심혈관계 질환 및 암의 치료와 예방제로서의 활용 가능성을 검토하는 많은 연구가 이루어지고 있다. 따라서 본 연구에서는 동백나무의 기능성 물질 확보와 가공을 통한 고부가가치 창출을 목표로 국내에서 자생하는 동백나무를 부위별로 추출물을 제조하여 항산화 및항미생물 활성을 평가하고자 하였다.
- 또한, 종실에서 분리된 hyperoside는 AIDS유발과 관련된 HIV-1 protease의 억제 효과를 나타내었고, 씨와 과피의 추출물도 항염증 및 소염 활성을 보였으나 동백의 종실에 대한 연구는 검토한 바 있으나, 동백의 부위별 성분분석이나 생리활성에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다. 본 연구에서는 전라남도에 분포된 동백나무를 부위별로 메탄올 추출하여 항산화 및 항미생물 활성을 살펴보았다.
가설 설정
- 1)Free radical scavenging activity of each sample was determined relative to DMS-treated control groups. Each value was expressed as mean±standard deviation(n = 3) 2)Amount required for 50% reduction of DPPH after 30 min
제안 방법
- 5 mC 를 첨가하여 반응을 정지시키고 전체를 10 로 정용하여 실온에서 1시간 방치 후, 725 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 이때 표준 검량곡선은 표준물질로 (±)-catechin을 0, 28, 42, 67, 78의 농도로 조제하여 y= 12.47-0.17 6 (R2= 0.98522) 에서 작성하여 검량하였다. 모든 처리는 3회 반복하여 평균값으로 환산하였다.
- DPPH (l, l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 radical로서, radical 전자의 비 편재화에 의해 안정화된 상태로 존재한다. 에탄올에 용해시킨 100 pM DPPH 용액을 180씩 96 well plate에 분주하고, 여기에 1, 10, 50, 100 "g의 시료를 20 씩 첨가하여 최종 반응용액이 200가 되도록 하였다. 일정시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader (Bio-Tek, USA)를 사용하여 517nm 에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소를 조사하였고, 무처리구와 처리구의 값을 비교하여 free radical 소거 활성을 결정하였다.
- 에탄올에 용해시킨 100 pM DPPH 용액을 180씩 96 well plate에 분주하고, 여기에 1, 10, 50, 100 "g의 시료를 20 씩 첨가하여 최종 반응용액이 200가 되도록 하였다. 일정시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader (Bio-Tek, USA)를 사용하여 517nm 에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소를 조사하였고, 무처리구와 처리구의 값을 비교하여 free radical 소거 활성을 결정하였다. Free radical 소거활성을 공존시킨 DPPH의 50%를 환원시키는데 필요한 시료의 양 (瞄)을 RCso으로 나타냈으며, 기존의 항산화제인 Vit.
- C, Vit. E 및 BHT를 표준시료로 하여 동백나무 부위별 시료의 항산화 활성을 비교하였다.
- 순수 분리된 각 균주의 단일집락을 취해 10 의 균 생육 액체배지에 접종하여 각각 균주의 생육적온에서 18~24 시간씩 3 회 배양한 후 항균활성 시험균주로 사용하였다. 항균성 시험용 평판배지의 조제는 각각의 15%의 한천이 첨가된 생육 배지를 멸균하여 petridish에 15n씩 분주하여 기층용 배지를 응고시키고, 0.
- 배양한 후 항균활성 시험균주로 사용하였다. 항균성 시험용 평판배지의 조제는 각각의 15%의 한천이 첨가된 생육 배지를 멸균하여 petridish에 15n씩 분주하여 기층용 배지를 응고시키고, 0.7% 한천이 첨가된 중층용 배지를 각각 5 씩 시험관에 분주하여 멸균한 후, 각종 시험균액 (멸균식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 660nm 에서 흡광도 0.3이 되게 한 균 현탁액) 0.1 M 를 무균적으로 가하여 잘 혼합한 다음 기층용 배지 위에 분주한 다음 고르게 응고시켜 2중의 균접종 중층배지를 만들어 사용하였다. 동백나무 부위별 추출물의 항균 활성검색은 한천배지 확산법 (disc plate method)^ 측정하였다 (Piddocket, 1990; Bauer et al.
- , 1996). 즉, 1, 5, 10, 15 mg/m£ 농도의 부위별 동백나무 메탄올 추출물을 0.45 membrane filter로 여과하여 제균한 다음 멸균된 filter paper disc (8 mm)에 50 흡수시킨 후 추출용매를 무균적으로 풍건하여 완전히 날려 보내고 각각 균의 생육적온에서 24~48 시간 동안 배양한 다음 paper disc 주변에 형성된 clear zone의 직경을 측정하여 항균 활성을 비교하였다. 이때 각 시료를 녹이기 위해 사용한 용매 및 계면활성제에 대한 공실험을 실시하였다.
- 45 membrane filter로 여과하여 제균한 다음 멸균된 filter paper disc (8 mm)에 50 흡수시킨 후 추출용매를 무균적으로 풍건하여 완전히 날려 보내고 각각 균의 생육적온에서 24~48 시간 동안 배양한 다음 paper disc 주변에 형성된 clear zone의 직경을 측정하여 항균 활성을 비교하였다. 이때 각 시료를 녹이기 위해 사용한 용매 및 계면활성제에 대한 공실험을 실시하였다.
- 동백나무 부위별 메탄올 추출물의 항균효과는 액체배지 희석법 (Victor-Lorian, 1991; Koneman et al., 1992)을 약간 변형하여 박테리아의 성장 저해효과 (MIC) 측정하였다. 즉, 고체 배지에서 자란 각 균주의 단일집락을 10 의 액체배지에 접종하여 각각 균의 최적생육온도에서 12시간씩 액체배지에서 2회 계대배양하였다.
- , 1992)을 약간 변형하여 박테리아의 성장 저해효과 (MIC) 측정하였다. 즉, 고체 배지에서 자란 각 균주의 단일집락을 10 의 액체배지에 접종하여 각각 균의 최적생육온도에서 12시간씩 액체배지에서 2회 계대배양하였다. 각각의 시험균은 대수 증식기 중기 (2~6 시간 배양 후)에 도달하였을 때 배양액을 생균수가 2x106 CFU/가 되도록 적절하게 희석한 다음 각각을 96 well microplate에 100씩 분주하고, 여기에 동백나무의 부위별 추출물의 고형물 함량이 1, 5, 10, 15mg/me 의 농도로 well당 100씩 첨가하였고, 시료 혹은 접종균주를 제외시켜 대조 구로 하여 균 생육적온에서 24시간 동안 배양하였다.
- 즉, 고체 배지에서 자란 각 균주의 단일집락을 10 의 액체배지에 접종하여 각각 균의 최적생육온도에서 12시간씩 액체배지에서 2회 계대배양하였다. 각각의 시험균은 대수 증식기 중기 (2~6 시간 배양 후)에 도달하였을 때 배양액을 생균수가 2x106 CFU/가 되도록 적절하게 희석한 다음 각각을 96 well microplate에 100씩 분주하고, 여기에 동백나무의 부위별 추출물의 고형물 함량이 1, 5, 10, 15mg/me 의 농도로 well당 100씩 첨가하였고, 시료 혹은 접종균주를 제외시켜 대조 구로 하여 균 생육적온에서 24시간 동안 배양하였다. MIC의 판정은 육안으로 검사하여 혼탁물이 관찰되지 않은 well의 해당 시료농도를 측정하거나 또는 균이 자라지 않는 well의 시료 액을 50씩 취하여 평판배지에 도말한 후 배양하여 집락 형성 유무로 결정하였다.
- 각각의 시험균은 대수 증식기 중기 (2~6 시간 배양 후)에 도달하였을 때 배양액을 생균수가 2x106 CFU/가 되도록 적절하게 희석한 다음 각각을 96 well microplate에 100씩 분주하고, 여기에 동백나무의 부위별 추출물의 고형물 함량이 1, 5, 10, 15mg/me 의 농도로 well당 100씩 첨가하였고, 시료 혹은 접종균주를 제외시켜 대조 구로 하여 균 생육적온에서 24시간 동안 배양하였다. MIC의 판정은 육안으로 검사하여 혼탁물이 관찰되지 않은 well의 해당 시료농도를 측정하거나 또는 균이 자라지 않는 well의 시료 액을 50씩 취하여 평판배지에 도말한 후 배양하여 집락 형성 유무로 결정하였다.
- C 방법 (1984)에 따라 측정하였다. 시험균주들을 액체배지 10 에 접종하여 각각 균의 최적 생육온도에서 12~18시간씩 2회 배양한 후 각각의 시험균이 대수 증식기 중기 (2~6시간 배양 후)에 도달하였을 때 배양액을 0.1% bacto peptone 용액으로 10-2, 1, 10%, 1( 농도로 단계 희석하여 고체 평판배지에 0.1 mC씩 분주한 후 도말하여생육적온에서 24시간 배양한 다음 형성된 집락을 계수하여 배양액 또는 그 희석액의 당의 CFU (Colony forming unit) 로 나타내었다.
- 일반적으로 항산화 활성은 페놀성 화합물이 원인물질로 관련되어 있는 것이 알려져 있어 동백나무의 각 부위에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 조사하였다. 동백나무의 어린잎, 성숙한 잎, 꽃봉오리, 꽃, 수피, 가지 및 종자로부터 헥산을 처리하여 지용성 성분을 제거하고 수용성의 성분만을 추출하여 (±)-catechin 표준 곡선을 이용하여 총 폴리페놀 화합물의 함량을 측정하였다 (Fig. 1). 총페놀 화합물의 함량은 어린잎에서는 161.
- 또한 식품의 원료나 부재료 등에 항미생물이 존재함이 계속적으로 밝혀지고 있고 식품에의 응용에 관한 연구가 진행되고 있다 (Comer & Beuchat, 1981). 동백의 경우 천연 식품 보존제개발의 일환으로 유박 추출물의 항균활성에 관한 연구 (Kang et al., 1998)가 보고되어 있으나 그 외에 수행된 연구는 아주 미미한 실정이므로 동백나무의 각 부위별로 항미생물 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 동백나무의 부위별 재료는 전남 장흥군 천관산의 동백자생 군락지에 있는 야생 동백나무로부터 꽃은 2~3월에, 어린잎은 4~5월에, 성숙한 잎과 수피는 6~8월에, 그리고 종자는 10~11월에 각각 채취하여 동결건조하여 마쇄한 후, 각각 10 5배의 메탄올로 상온에서 24시간 3회 추출하였다. 추출액은 감압농축하여 1/10로 농축한 다음 동결건조로 분말화하여 실험 재료로 사용하였다.
- C (ascorbic acid), BHT는 Sigma, Vit. E (dL-a-Tocopherol)는 Kanto 제품을 사용하였다. 또한 항미생물 활성측정에 사용된 배지로써 LB, NB, TSB, Bacto™ peptone 및 Bacto™ agar는 BD 저] 품을 사용하였다.
- E (dL-a-Tocopherol)는 Kanto 제품을 사용하였다. 또한 항미생물 활성측정에 사용된 배지로써 LB, NB, TSB, Bacto™ peptone 및 Bacto™ agar는 BD 저] 품을 사용하였다.
- Enterobacter spp. Cl036 및 Salmonella typhimu- riimi을 각각 사용하였다.
데이터처리
- 98522) 에서 작성하여 검량하였다. 모든 처리는 3회 반복하여 평균값으로 환산하였다.
이론/모형
- 시료의 총페놀 함량은 페놀성물질이 phosphomolybdic acid 와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 Folin-Denis 법으로 측정하였다. 즉, 건조시료 1 80% 에탄올용액 100 m2를 가하여 80℃에서 2시간 반복추출 후 여과하였다.
- 항산화 활성은 DPPH법 (Brand-Wiliams et al., 1995)을이용하여 시료의 free radical 소거능을 측정하였다. DPPH (l, l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 radical로서, radical 전자의 비 편재화에 의해 안정화된 상태로 존재한다.
- 1 M 를 무균적으로 가하여 잘 혼합한 다음 기층용 배지 위에 분주한 다음 고르게 응고시켜 2중의 균접종 중층배지를 만들어 사용하였다. 동백나무 부위별 추출물의 항균 활성검색은 한천배지 확산법 (disc plate method)^ 측정하였다 (Piddocket, 1990; Bauer et al., 1996). 즉, 1, 5, 10, 15 mg/m£ 농도의 부위별 동백나무 메탄올 추출물을 0.
- 생균수의 측정은 A.O.A.C 방법 (1984)에 따라 측정하였다. 시험균주들을 액체배지 10 에 접종하여 각각 균의 최적 생육온도에서 12~18시간씩 2회 배양한 후 각각의 시험균이 대수 증식기 중기 (2~6시간 배양 후)에 도달하였을 때 배양액을 0.
성능/효과
- 1). 총페놀 화합물의 함량은 어린잎에서는 161.77mg으로 성숙한 잎보다는 약 4배 많은 페놀을 함유하고 있고, 꽃봉오리에서는 124.33 mg, 꽃에서는 103.07 mg으로 동백나무 잎과 꽃의 수용성 추출물은 성숙할수록 총페놀 함량이 감소하는 경향을 보였다. 그리고 수피, 가지 및 종자의 총페놀 함량은 각각 28.
- 07 mg으로 동백나무 잎과 꽃의 수용성 추출물은 성숙할수록 총페놀 함량이 감소하는 경향을 보였다. 그리고 수피, 가지 및 종자의 총페놀 함량은 각각 28.37 mg, 20.68 mg 그리고 8.84 mg으로 페놀 화합물의 함량이 상대적으로 낮게 나타났다. Moo 등 (2004)은 몇 가지 약용식물을 부분별로 추출하여 조사하였는데 뿌리와 씨에서보다 잎이나 껍질에서 페놀 화합물의 함량이 높게 측정되었다고 보고하였는데 본 연구에서도 동백나무의 종자보다 어린잎에서 약 30배 정도 많은 양의 페놀 화합물을 함유하여 이들 결과와 유사하게 나타났다.
- Moo 등 (2004)은 몇 가지 약용식물을 부분별로 추출하여 조사하였는데 뿌리와 씨에서보다 잎이나 껍질에서 페놀 화합물의 함량이 높게 측정되었다고 보고하였는데 본 연구에서도 동백나무의 종자보다 어린잎에서 약 30배 정도 많은 양의 페놀 화합물을 함유하여 이들 결과와 유사하게 나타났다. 이상의 결과로 보아 어린잎, 꽃봉오리 및 꽃의 추출물은 항산화 활성 및 항균활성 등의 생리활성이 높을 것으로 생각된다.
- E 및 BHT와 유사한 free radical 소거능을 보였다. 이 중 가장 효과가 뛰어난 어린 잎 추출물의 DPPH free radical 소거 효과는 1, 10, 50, 100ug/ml의 추출물 농도에서 각각 8.52%, 64.77%, 92.97%, 그리고 92.19%로 나타나 낮은 농도에서도 항산화 활성이 높게 나타났으며, 꽃봉오리 추출물에서도 어린잎과 같은 농도에서 각각 5.34%, 38.97%, 92.28%, 93.54%로 비교적 강한 항산화 활성을 보였다.
- 각 부위별 추출물들의 RCw은 어린잎이 7.16ug/ml, 꽃봉오리는 1445ug/ml 수, 꽃은 18.40ug/ml으로 페놀 화합물의 함량에 비례하여 항산화 활성이 높게 나타났으며, 성숙한 잎은 28.40 ug/ml 수피는 42.68 ug/ml 가지는 60.44 ug/ml의 순으로 항산화 효과를 보였다. 그러나 종자에서는 DPPH를 50% 환원시키는데 필요한 시료의 양을 측정할 수 없었다.
- 이상의 결과로 동백나무도 어린잎, 꽃봉오리와 꽃 추출물 중에서 보다 강력한 항산화 활성을 나타내는 polyphenol성 화합물 등의 항산화물질을 함유하고 있으리라 생각되며, 예로부터 동백의 어린잎을 차의 재료로 사용하였다는 기록과 사찰에서 화전으로 식용하였다는 것으로 보아 동백의 잎이나 꽃은 식용이 가능하며, 이를 이용한 천연항산화제의 개발가능성도 높다고 생각된다 (Hwang et al., 2004).
- 3 및 Table 2에 나타내었다. 그 결과 disc에 점적한 각 부위별 추출물의 농도가 증가할수록 항균활성이 크게 나타났다. 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 어린잎 추출물의 경우 B subtilis, S.
- 그 결과 disc에 점적한 각 부위별 추출물의 농도가 증가할수록 항균활성이 크게 나타났다. 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 어린잎 추출물의 경우 B subtilis, S. fradiae, P. aeruginosa, 및 S. typhimurium에 대 해 15 mg/m£ 농도에서 13 nun 의 억제환으로 강력한 활성을 나타내었다. 따라서 동백나무에서도 어린잎 부위의 추출물은 그람양성균과 그람음성균에 대해 넓은 항균력을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.
- typhimurium에 대 해 15 mg/m£ 농도에서 13 nun 의 억제환으로 강력한 활성을 나타내었다. 따라서 동백나무에서도 어린잎 부위의 추출물은 그람양성균과 그람음성균에 대해 넓은 항균력을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. 이 중에서 S.
- C1036균주에 15 mg/ml 농도로 첨가하였을 때 각각 8 mm, 9 mm의 억제 효과를 나타내었다. 한편 본 실험에 사용한 동백나무의 부위별 추출물의 농도가 1 mg/ml 이하인 경우에는 항균 효과를 검증할 수 없었고, 동백나무의 꽃, 수피, 가지 및 종자 부위의 추출물의 경우도 모든 균주에 대해 항균활성을 나타내지 않았다.
- 또한 Clark 등 (1981)은 식물체에 함유된 페놀성 물질이 항균활성을 나타낸다고 보고하였는데 본 연구에서도 동백나무의 부위별 메탄올 추출물에 함유된 페놀성 물질의 함량에 따라서 항균활성의 차이가 나타남을 알 수 있었다. 이상과 같은 결과로 보아 동백나무의 어린잎 추출물의 항균 활성은 페놀성 물질의 함량에 따라서 차이가 나타났으며, 페놀성 물질의 함량이 높을수록 항균활성이 높아 천연항균제로서의 사용 가능성이 높은 것으로 생각된다.
- co에서는 항균활성을 보이지 않았다. 이와 같이 그람양성균이 그람음성균보다 각각의 농도에서 최소저해농도의 효과가 더 높은 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 Nakamura 등 (1991)이 보고한 바와 같이 그람양성균의 세포벽은 peptidoglycan 층이 표면에 노출되어 항균활성 물질의 공격을 받기 쉽지만 그람음성균은 lipopolysaccharide를 주성분으로 하는 외막이 peptidoglycan 층을 보호하는 역할을 하기 때문이라고 생각된다.
- 항산화효과는 항산화력 성분인 총페놀 화합물의 함량과 DPPH radical 소거법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였는데 총 페놀 화합물의 함량은 동백나무 부위별 추출물의 건조중량 100 g에 대하여 어린잎, 꽃봉오리 및 꽃 추출물에 각각 74.24 mg , 65.02 mg, 그리고 62.42 mg로 나타났다.
- Free radical 소거활성을 공존시킨 DPPH의 50%를 환원시키는데 필요한 시료의 양 (RCm)은 어린잎, 꽃봉오리 그리고 꽃의 추출물에서 각각 7.16ug/ml, 14.45 ug/ml 및 18.4ug/ml 의 낮은 농도로 활성을 나타내어 기존의 합성 항산화제인 BHT 의 61.23 ug/ml 보다 높은 항산화 효과를 나타내어 천연 항산화제로서 이용 가능성을 보여주었다.
- 7종의 시험균에 대한 항균력이 가장 높았던 어린잎 추출물의 최소저해농도 (MIC)는 1~ 15mg/me 으로 나타났으며, 그람양성균이 그람음성균보다 각 농도에서 최소저해농도의 효과가 더 높은 것으로 나타났다.
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