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문제 정의
- 본 연구의 목적은 광주 근교인 지리산과 병풍산에 자생하며 hypericin을 다량 함유한 고추나물을 가지고 RAPD 분석을 함으로써 지리적 차이에 의한 유전적 차이 유무를 규명하고자 하였고, 또 동일 과(斗)에 속하는 물레나물, St. John's wort 와의 비교를 통해 유전적인 다양성과 계통간의 근연성을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- , 2002). PCRe GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystem아을 사용하였고, RAPD를 위한 PCR 반응은 pre-denaturation 95℃ 5분, 1 cycle 후, denaturation 95℃ 1분, annealing 36℃ 1분, extension 72℃ 2분으로 총 45 cycle을 시행하였으며 post-extensione 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 증폭된 DNA는 EtBr 존재 하에 1.
- RAPD 분석 결과 다형성을 나타내는 밴드의 유무에 따라 1 또는 0의 수치로 전환시킨 후 각각 하나의 운영 분류 단위 (OTU, operational taxonomic unit)로 하여 기초 자료 행렬 (data matrix)을 작성하였다. 유연관계 분석은 Jaccard coefficient 계산법에 따라 유사도 지수를 계산한 후 NTSYS- PC 프로그램을 사용하여 비가중 산술 결합법 (UPGMA, unweighted pair-group method using arithmetic average)으로유집 분석하였다 (Yoo and Jang, 2003).
- 고추나물에서 최적의 PCR 증폭 조건을 확립하기 위해서 template DNA, primer, dNTP 및 Taq DNA polymerase 의 농도를 달리하여 증폭하였다. 그 결과, 고추나물의 최적 DNA 증폭은 template DNA 1.
- , 2002). 추출한 genomic DNA는 0.8% agarose gel에 6X loading dye (40% sucrose, 0.6 ug/ul bromophenol blue)를 혼합하여 100 V에서 30분 정도 전기영동한 후 EtBr 존재 하에서 단일 밴드 생성 여부를 확인하였다.
대상 데이터
- DNA는 지리산에서 채집한 고추나물과 기내 배양 중인 병풍산 고추나물, 물레나물, St. John's wort에서 추출하였다. 각 샘플들의 잎 0.
- RAPD 분석에 사용된 실험재료는 지리산과 병풍산에 자생하고 있는 고추나물을 2003년 6월과 8월 사이에 채집하여 사용하였고, 고추나물과의 비교를 위한 St. John's won와 물레나물은 기내 배양한 것을 사용하였다. 물레나물 종자는 2002년 병풍산에서 채집하여 70% ethanol에 수 초간 침지하고, 2% sodium hypochlorite 용액으로 3분간 표면 살균하여 멸균수로 3-4회 세척한 후, 기내에서 무균 발아시켜, MS 배지 (Murashige & Shoog, 1962)에서 광조건 50 piol m-2s-1, 광주기 16/8 h, 온도 25±1℃로 배양 중인 식물체를 사용하였다.
- John's won와 물레나물은 기내 배양한 것을 사용하였다. 물레나물 종자는 2002년 병풍산에서 채집하여 70% ethanol에 수 초간 침지하고, 2% sodium hypochlorite 용액으로 3분간 표면 살균하여 멸균수로 3-4회 세척한 후, 기내에서 무균 발아시켜, MS 배지 (Murashige & Shoog, 1962)에서 광조건 50 piol m-2s-1, 광주기 16/8 h, 온도 25±1℃로 배양 중인 식물체를 사용하였다. St.
- 주문한 프라이머 26개와 Bioneer co.의 random primer (10-mer) 20개를 스크리닝하여 증폭된 밴드의 수가 많고 선명한 프라이머 30개를 선발하였다 (Table 2).
데이터처리
- matrix)을 작성하였다. 유연관계 분석은 Jaccard coefficient 계산법에 따라 유사도 지수를 계산한 후 NTSYS- PC 프로그램을 사용하여 비가중 산술 결합법 (UPGMA, unweighted pair-group method using arithmetic average)으로유집 분석하였다 (Yoo and Jang, 2003).
이론/모형
- 2 g을 채취하고 액체 질소를 막자사발에 넣은 다음 고운 분말이 될 때까지 갈았다. DNA 추출은 DNeasy plant Mini kit (Qiagen)를 이용하여 설명서에 따라 수행하였다 (Kim et al., 2004; Song et al., 2002). 추출한 genomic DNA는 0.
- RAPD 분석을 위한 primer는 Amholdt-Schmitt (2000)의 paperS 참고하여 6개의 primer (001, 006, 020, 025, 026, 029)를 Jenotech에 주문 . 제작하였고 Operon Technologies Inc.
성능/효과
- Distance를 계산하는 방식은 simple matching coefficient와 Jaccard's coefficient 를 사용하였는데, simple matching coefficient를 사용하였을 때는 4개의 tree가 그려졌고, Jaccard's coefficient® 사용하였을 때는 1개의 tree가 그려졌다’ 4개의 tree 중 Jaccard's coefficient와 가장 높은 상관계수를 가지는 tree는 r 값이 0.97770으로 나타났다 (date not shown).
- Random amplified polymorphic DNAs (RAPD) 분석을 통해 한국산 물레나물 속 (Hypericum) 식물에서의 유연관계를 분석한 결과, 병풍산 고추나물과 지리산 고추나물 사이에 상당한 유전적 차이가 있음을 확인할 수 있었고, 지리산의 500m, 1000m 그리고 1300m 고도 차이에 따른 군락지별로도 밴드 패턴의 차이가 확인되었다. 동일 과 (科)에 속한 물레나물보다는 서양고추나물이라고 불리는 St.
- 677 정도의 유사도를 보이며 지리산 고추나물과는 유전적으로 다소 차이가 있음을 나타내었다. 그리고 물레나물보다는 St. John's wort가 고추나물과 유연관계가 더 가까운 것으로 나타났다 (Fig. 2).
- 밴드 패턴의 차이가 확인되었다. 동일 과 (科)에 속한 물레나물보다는 서양고추나물이라고 불리는 St. John's wort가 고추나물과 유연관계가 더 가깝게 나타났다.
- 물레나물과 St. John's wort는 다른 4개체와는 유사도 0.36 이하에서 유집되어 유연관계가 가장 멀게 나타났으며, 지리산 500m 고지의 고추나물과 지리산 1300m 고지의 고추나물은 유사도 0.85 이상에서 유집되어 유연관계가 가장 높게 나타났다 (Fig. 2).
- 분류군 전체에서 반응이 일어난 30 종류의 primei로부터 총 1194개의 밴드가 관찰되었으며, 이 중 다형화 (polymorphism) 를 보Q]는 밴드는 411개 (344%)로 primer당 평균 13.7 개의다형화 밴드를 보이는 것으로 나타났다. Primer별 밴드 수는 17개 (OP-026)에서 61개 (R-03)로 다양하였으며, 평균 밴드 수는 39.
- 선발한 30개의 프라이머를 이용해서 물레나물 속 식물 3종 6개체를 대상으로 RAPD 분석을 한 결과, 다형성을 보이는 밴드가 증폭되었다 (Table 3). 증폭된 random primer의 염기서열 중 guanine (G)과 cytosine (C)의 함량은 PCR 증폭에 많은 영향을 미치는 것으로 알려져 있는데 (Fritsch et al.
- 지역별로는 지리산 지역에 분포하는 서로 다른 세 가지 고도 (500 m, 1000 m, 1300 m)에서의 고추나물은 모두 유사도 0.84 이상에서 유집되어 높은 유사도를 보이는 것으로 나타났고, 전남 담양의 병풍산에 자생하는 고추나물은 그보다 훨씬 낮은 0.677 정도의 유사도를 보이며 지리산 고추나물과는 유전적으로 다소 차이가 있음을 나타내었다. 그리고 물레나물보다는 St.
- 8개로 나타났다 (Table 3). 한편 R-이은 관찰된 20개 밴드 중 15 (75%)개가 다형화 현상을 보여 가장 높은 polymorphism을 보이는 반면, OPA-02 primer는 3개 (7%) 로가장 낮은 다형화 현상을 보였다.
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