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문제 정의
- , 1974; Ristola & Pyorala, 1972). 따라서 본연구는 이러한 유용한 이점을 가진 초음파 병행 추출을 이용함과 동시에 극성, 비극성 용매 (water, butanol, ethyl acetate, chloroform 등)를 이용하여 얻어진 분획물들의 면역 증진 활성을 탐색하고, 이러한 생리활성 검증을 통하여 이들의 면역 증진제로서의 가능성을 부여하고, 더 나아가 본 연구 자료들이 기능성 식품에 관련된 분야에 바탕 자료로서 가치를 지니게 하기 위해 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- Cytokinee IL-6와 TNF-a의 정량을 IL-6와 TNF-a 정량 kit를 사용하여 측정하였다. 세포의 농도를 1~2xl04cells/M의 농도로 조절한 후 24 well plate에 900 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양 (37℃, 5% CO2)시킨 후 시료의 최종농도를 1.
- Cytokines 분비량은 면역 세포에 대한 활성 실험에서 효과가 가장 높게 나타났던 추출공정인 60℃ 의 40 kHz 초음파 병행 추출물의 water 분획층과 butanol 분획층을 이용하여 분획물 실험을 행하였다. Fig.
- 구입하여 상온에서 보관하면서 사용하였다. Fig. 1의 추출 공정도와 같이 각 시료를 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료중량에 대하여 각각 10배의 증류수를 추출 용매로 사용하여 40℃, 60℃, 100℃에서 추출한 후, 초음파 추출기 (Asia industry, Kor.)를 통하여 각각의 온도에서 40 kHz, 60 kHz, 130 kHz의 초음파로 30분간 초음파 추출을 병행하였다. 초음파 병행 추출로 얻어진 추출물들을 극성, 비극성 용매 (water, butanol, ethyl acetate, chloroform)를 이용하여 분획물들을 얻었고, 이렇게 얻어진 분획물들을 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결 건조한 뒤에 실험에 사용하였다.
- NK-cell에 대하여 인간 면역세포인 B, T cell을 이용 이 세포들이 분비하는 1L-2를 비롯한 여러가지 cytokine 생약재의 분획물 투여로 cytokine 분비량의 증가에 따른 NK-cell의 생육 증진 효과가 초음파 병행 추출물에 비해 얼마나 더 증가되는지를 관찰하였다. 이전에 확인했던 실험들에서와 마찬가지로 그 결과가 좋았던 water 분획층과 butanol 분획층을 가지고 그 결과를 관찰하여본 결과를 Fig.
- 원심분리하여 상층액을 취하였다. NK-cell을 24well plate에 4~5×104 cells/ml로 900㎕씩 분주하고 24시간 후 T세포와 B세포의 상층액을 각 plate에 100㎕씩 투여하여 48시간 동안 배양한 후 6일동안 NK-cell의 생육도는 cell counter를 이용하여 생세포수를 이용하여 NK-cell의 생육 증진 효과를 측정한다. 이것은 T세포와 B세포에서 분비하는 cytokine인 Ⅱ.
- 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역 기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 l.OxlO2 * 4 cells/mg의 농도로 심고 시료를 투여하여 8일 동안 배양하면서 매일매일 각 well의 cell을 hemacytometere- 세포 수를 측정하여 생육 증강도를 측정하는 방법으로 control에 대한 증식률로 계산하였다 (Lee et al., 2002).
- Table 3은 T세포에 의한 NK-cell의 활성도를 공정 요인별로 나타낸 것으로 공정 요인으로는 초음파 병행의 유무와 온도의 변화를 이용하였다. 가장 좋은 활성 촉진 효과를 나타낸 것으로는 60℃에서 40 kHz의 초음파로 병행 추출한 복분자 water 분획층이며, 이 추출물 1.
- 면역 기능 증강 효과는 인간 면역 세포인 T cell과 B cell 을 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역 기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 l.
- 0g/C 로 100㎕씩 첨가하여 다시 5일 동안 배양 (37℃, 5% CO2)하였다. 배양배지를 원심분리기를 이용하여 상층액을 취한 다음 450 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D값을 표준물질을 이용해 작성한 표준곡선과 비교하여 cytokine의 양을 즉정하였다(Oh, 1991; Han et al., 1998).
- 실험에 이용한 세포주로 T cell (Jurkat, ATTC, USA)과 B cell (Raji, ATTC, USA)을 이용하여 면역세포 생육 증진 효과를 검토하였고, NK cell (NK-92MI cell, ATTC, USA) 의활성을 측정하였다. 인간 전과립 세포 (human promyelocytes; HL60, ATTC, USA)를 이용하여 세포 분화 정도를 측정하였다.
- 이것의 결과로는 온도가 60℃, 40 kHz의 초음파일 때 최대의 생산성을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 추출 공정과 수율이 높게 나타난 분획물을 이용하여 실험에 이용하였고, 온도와 초음파 주파수를 달리하여 비교한 실험도 실시하였다.
- 인간 T세포와 B세포를 T-25 Flask에 배양하면서 시료를 투여한 후 증식정도를 관찰하면서 3~4번의 계대 배양 후 세포를 원심분리하여 상층액을 취하였다. NK-cell을 24well plate에 4~5×104 cells/ml로 900㎕씩 분주하고 24시간 후 T세포와 B세포의 상층액을 각 plate에 100㎕씩 투여하여 48시간 동안 배양한 후 6일동안 NK-cell의 생육도는 cell counter를 이용하여 생세포수를 이용하여 NK-cell의 생육 증진 효과를 측정한다.
- 측정하였다. 인간 전과립 세포 (human promyelocytes; HL60, ATTC, USA)를 이용하여 세포 분화 정도를 측정하였다. 인간 전과립 세포는 RPMI 1640배지에 10% heatinginactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK-celle a-MEM 배지에 2mM L-glutamine, 0.
- 인간 전과립 세포 (human promyelocytes; HL60, ATTC, USA)를 이용하여 세포 분화 정도를 측정하였다. 인간 전과립 세포는 RPMI 1640배지에 10% heatinginactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK-celle a-MEM 배지에 2mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, 10-4M2-mercaptoethanol, 12.5% fetal bovine serum (FBS)와 12.5% horee serum (Myelocult)을 첨가시켜 배양하였다.
- 인간 전과립 세포인 HL60을 이용하여 세포분화 중 단핵구 세포 분화 단계의 검정을 위한 acid phosphatase의 활성도를 측정하였다. 이것은 단핵구의 정량적인 수치를 측정하기 위한 방법으로 세포의 농도가 4~5×104 cells/mC로 포함된 배지를 24 well plate에 900㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 혈청은 GIBCO (USA)사의 fetal bovine seruin과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다. Cyokine 측정을 위해 IL-6와 TNF-a kit는 Chemicon (USA)사의 것을 구입하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 마황과 복분자, 당귀는 경동시장에서 2003년 구입하여 상온에서 보관하면서 사용하였다. Fig.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Alpha minimum essential medium (a-MEM)은 GIBCO (USA)로부터 구입하였고, Hepes bufibr는 SIGMA (USA)에서 구입하였다. 혈청은 GIBCO (USA)사의 fetal bovine seruin과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다.
- )를 통하여 각각의 온도에서 40 kHz, 60 kHz, 130 kHz의 초음파로 30분간 초음파 추출을 병행하였다. 초음파 병행 추출로 얻어진 추출물들을 극성, 비극성 용매 (water, butanol, ethyl acetate, chloroform)를 이용하여 분획물들을 얻었고, 이렇게 얻어진 분획물들을 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결 건조한 뒤에 실험에 사용하였다.
- 혈청은 GIBCO (USA)사의 fetal bovine seruin과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다. Cyokine 측정을 위해 IL-6와 TNF-a kit는 Chemicon (USA)사의 것을 구입하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
- Fig. 4에서 온도를 달리한 추출공정에서의 IL-6 분비량을 측정한 결과 60℃에서 복분자가 18.5XUT4 pg/cell의 가장 효과적인 분비 증가를 나타내었으며, 40℃에서는 17.9xl0T pg/cell 로 나타났다. 다른 작물인 마황과 당귀 또한 60℃로 추출하였을 때, 각각 1.
- 6과 Table 3에 나타내었다. Fig. 6은 B세포에 의한 NK-cell의 생육도 증가율을 나타낸 것으로 복분자 water 분획층은 1.0 gK의 농도에서 배양 6일째 날 91%의 활성증진을 나타내었고, butanol 분획층은 82%의 증진을 나타내 control의 31%에 비해 각 2.94배, 2.65 배 증가한 것으로 나타났으며, 당귀 water 분획층과 butanol 분획층에서 각 84%와 80%의 활성 증진을 나타내 control에 비해 각각 2.71 배, 2.58배 증진효과를 나타낸 것을 확인 할 수 있었다. cell density# 측정한 결과 복분자 water 분획 층을 첨가했을 때 가장 높은 NK-cell의세포 생육도를 나타내었으며, 배양 6일째 l.
- cell density# 측정한 결과 복분자 water 분획 층을 첨가했을 때 가장 높은 NK-cell의세포 생육도를 나타내었으며, 배양 6일째 l.Og/C의 농도에서 17.3x102 cells/m£의 생육 도를 나타내 control 6×102 cells/mC 에 비해 2.88배 증가한 것으로 높은 생육 증진도를 나타내었고, 마찬가지로 당귀 분획물도 control에 비해 water 분획층에 의해 2.65배의 NK-cell 생육 증진 도를 나타내 아주 높은 생육 증진도를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다.
- Table 1에서 나타난 결과로 복분자 (Rubus Coreanus Miq.) water 분획층 수율이 59.63%로 가장 높게 나타났으며, 그다음으로 butanol 분획층과 ethyl acetate 분획층, chloroform 분획층의 순서로 각각 19.06%, 4.58%, 2.56%로 나타났다. 마황, 당귀 water 분획층의 수율은 각각 55.
- 변화를 이용하였다. 가장 좋은 활성 촉진 효과를 나타낸 것으로는 60℃에서 40 kHz의 초음파로 병행 추출한 복분자 water 분획층이며, 이 추출물 1.0g/C 를가하여 배양한 T cell 상층액을 가하였을 때 NK-celle 배양 6일째 97%, butanol 분획층은 93%의 활성증진을 보여 초음파 병행 추출하지 않은것과 다른 온도 조건에 비해 높은 생육 활성 촉진 효과를 나타내었다. 그리고 당귀 분획물 또한 60 ℃, 40 kHz의 초음파 추출물의 water 분획층과 butanol 분획 층에서 각 92%와 80%의 활성 증진을 나타내 다른 추출공정보다 높은 활성을 나타내었다.
- 이것은 각 공정별로 얻어진 분획물을 이용하여 면역 활성도를 실험하여 최적의 추출 조건을 확립하기 위한 실험으로서, T 세포와 B 세포에 대한 활성이 가장 높은 추출 조건으로는 온도가 60℃와 40 kHz의 초음파를 병행 추출하였을 때 면역 활성도가 가장 높게 나타났다. 그 중 당귀 water 분획층에서 184.9%, 171.5%로 butanol 분획의 173.4%, 165.3%보다 높은 면역 활성도를 나타내었고, ethyl acetate나 chloroform 분획물보다 더 높은 활성도를 나타내어, water의 분획층에서 가장 높은 면역 활성도를 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 복분자와 마황의 결과 또한 당귀와 유사한 결과를 관찰할 수 있었다.
- 0g/C 를가하여 배양한 T cell 상층액을 가하였을 때 NK-celle 배양 6일째 97%, butanol 분획층은 93%의 활성증진을 보여 초음파 병행 추출하지 않은것과 다른 온도 조건에 비해 높은 생육 활성 촉진 효과를 나타내었다. 그리고 당귀 분획물 또한 60 ℃, 40 kHz의 초음파 추출물의 water 분획층과 butanol 분획 층에서 각 92%와 80%의 활성 증진을 나타내 다른 추출공정보다 높은 활성을 나타내었다. 이것으로 알 수 있듯이 생체 방어 기능을 증진 시킬 수 있는 최적의 추출공정으로는 60℃에서 40 kHz의 초음파를 병행하여 추출하는 것으로 사료된다.
- 그 중 복분자 water 분획층이 가장 높은 세포 분화 활성도를 나타냈다. 또한 복분자와 마황의 분획물이 crude 상태의 초음파 병행 추출물에 비해 최고 20% 이상의 분화 활성도를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이것은 분획으로 인해 초음파를 병행한 추출물들보다 분화유도 물질의 증가와 이로 인한 세포의 신호전달 체계가 신속하게 이루어져 분화 도가 증가한 것으로 사료되어진다.
- 56%로 나타났다. 마황, 당귀 water 분획층의 수율은 각각 55.63%와 50.17%로 나타나 water 분획층의 수율이 가장 높게 나타났으며, butanol 분획층, ethyl acetate 분획층, chloroform 분획층의 순서로 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이것의 결과로는 온도가 60℃, 40 kHz의 초음파일 때 최대의 생산성을 나타내는 것으로 나타났다.
- 복분자와 마황의 결과 또한 당귀와 유사한 결과를 관찰할 수 있었다. 여기서 알 수 있듯이 생체 방어 기능의 하나인 면역 세포들의 활성도에서는 온도가 60℃에서 40 kHz의 초음파를 병행 추출하여 이것의 water 분획물일 때 가장 좋은 생체 방어 기능을 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
- 당귀와 마황에서도 40 kHz의 초음파로 병행 추출한 것이 더 높은 분비량을 나타낸 것을 확인 할 수 있었다. 이것으로 40 kHz의 초음파로 병행 추출하는 것이 생산성 향상이나 생체 방어 기능에 있어서 다른 추출 공정보다 더 좋은 결과를 나타내며, 따라서 이러한 공정을 이용하여 추출하는 것이 가장 경제적인 것으로 사료된다.
- 04배 높은 분비량을 나타내었다. 이것으로 60℃의 온도에서 추출하였을 때, 생체 방어 기능 효과가 우수한 것으로 나타났다. Fig.
- 증진 실험결과를 나타내었다. 이것은 각 공정별로 얻어진 분획물을 이용하여 면역 활성도를 실험하여 최적의 추출 조건을 확립하기 위한 실험으로서, T 세포와 B 세포에 대한 활성이 가장 높은 추출 조건으로는 온도가 60℃와 40 kHz의 초음파를 병행 추출하였을 때 면역 활성도가 가장 높게 나타났다. 그 중 당귀 water 분획층에서 184.
- 17%로 나타나 water 분획층의 수율이 가장 높게 나타났으며, butanol 분획층, ethyl acetate 분획층, chloroform 분획층의 순서로 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이것의 결과로는 온도가 60℃, 40 kHz의 초음파일 때 최대의 생산성을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 추출 공정과 수율이 높게 나타난 분획물을 이용하여 실험에 이용하였고, 온도와 초음파 주파수를 달리하여 비교한 실험도 실시하였다.
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