독활메탄올 추출물과 그 분획의 항혈전 및 항산화 효과를 확인하기 위하여 ADP를 이용하여 혈소판 응집억제효과를 탐색하고 DPPH 및 ABTS-radical 소거능을 측정하여 항산화능을 측정하였다. 그 결과 독활, 특히 EtOAc 분획은 ADP에 의해 유도된 혈소판응집과 트롬빈에 의한 혈소판 부착에 대하여 농도 의존적으로 저해효과를 나타내었으며, 높은 폴리페놀 함량과 가장 높은 라디칼 소거능을 통하여 독활의 항산화 효과를 확인하였다. 이상의 결과로 독활 EtOAc 분획의 높은 DPPH 및 ABTS radical 소거능이 항혈소판 효과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
독활 메탄올 추출물과 그 분획의 항혈전 및 항산화 효과를 확인하기 위하여 ADP를 이용하여 혈소판 응집억제효과를 탐색하고 DPPH 및 ABTS-radical 소거능을 측정하여 항산화능을 측정하였다. 그 결과 독활, 특히 EtOAc 분획은 ADP에 의해 유도된 혈소판응집과 트롬빈에 의한 혈소판 부착에 대하여 농도 의존적으로 저해효과를 나타내었으며, 높은 폴리페놀 함량과 가장 높은 라디칼 소거능을 통하여 독활의 항산화 효과를 확인하였다. 이상의 결과로 독활 EtOAc 분획의 높은 DPPH 및 ABTS radical 소거능이 항혈소판 효과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
The dried roots of Aralia continentalis Kitagawa is known to have the potential for anti-inflammation and anti-rheumatic, but their effects on thrombosis are not clear. In this study, we evaluated the anti-platelet and antioxidative activities of A. continentalis Kitagawa. Methanol extract and its v...
The dried roots of Aralia continentalis Kitagawa is known to have the potential for anti-inflammation and anti-rheumatic, but their effects on thrombosis are not clear. In this study, we evaluated the anti-platelet and antioxidative activities of A. continentalis Kitagawa. Methanol extract and its various fractions of A. continentalis Kitagawa inhibited ADP-induced platelet aggregation, and EtOAc fraction showed strongest inhibition in a concentration-dependent manner with a $IC_{50}$ value of 217.7 ${\mu}g/ml$. Moreover, the EtOAc fraction contained 77.7% of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) and 43.1% of 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical-scavenging activity at 0.1 mg/ml. In addition, the methanol and EtOAc fraction dose-dependently inhibited thrombin-stimulated platelet adhesion to collagen or fibrinogen. Collectively, these results suggest that the polyphenol-rich EtOAc fraction from A. continentalis Kitagawa can reduce platelet hyperactivation by scavenging free radicals. Thus, the EtOAc fraction of A. continentalis Kitagawa is a potential source for inhibition of platelet-dependent thrombosis.
The dried roots of Aralia continentalis Kitagawa is known to have the potential for anti-inflammation and anti-rheumatic, but their effects on thrombosis are not clear. In this study, we evaluated the anti-platelet and antioxidative activities of A. continentalis Kitagawa. Methanol extract and its various fractions of A. continentalis Kitagawa inhibited ADP-induced platelet aggregation, and EtOAc fraction showed strongest inhibition in a concentration-dependent manner with a $IC_{50}$ value of 217.7 ${\mu}g/ml$. Moreover, the EtOAc fraction contained 77.7% of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) and 43.1% of 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical-scavenging activity at 0.1 mg/ml. In addition, the methanol and EtOAc fraction dose-dependently inhibited thrombin-stimulated platelet adhesion to collagen or fibrinogen. Collectively, these results suggest that the polyphenol-rich EtOAc fraction from A. continentalis Kitagawa can reduce platelet hyperactivation by scavenging free radicals. Thus, the EtOAc fraction of A. continentalis Kitagawa is a potential source for inhibition of platelet-dependent thrombosis.
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문제 정의
따라서 본 실험에서는, 천연물질로서 한방에서 많이 이용되고 있는 독활의 항산화능이 항혈전 활성에 미치는 영향을 체계적으로 검토하고 그 기전을 연구하기 위하여, 먼저 전반적인 항혈소판 및 항산화 효과를 in vitro에서 검토하였다.
가설 설정
ng/ml) 2) Aggregation is presented as means±SD (n=3). 3) Inhibition (%)=[(A-B)/(A)]xl00z where A is the percent ag gregation in the control and B is the percent aggregation in the sample.
standard. 2) Each value is mean±SD (n>3).
reaction. 3) Each value is mean±SD (n=3).
제안 방법
Rat를 ethyl ether로 마취하고, 항응고제 0.15 M sodium citrate를 혈액과 l:9(v/v)의 비율이 되도록 함유한 주사기로 복대동맥으로 부터 채혈하였다. Platelet rich plasma (PRP)는 200x g에서 10분간 원심분리하여 상등액의 PRP를 얻었고, 계속하여 800x g에서 15분간 원심분리하고, 침전된 혈소판을 washing buffer (137 mM NaClz 2.
USA)를 이용한 탁도 측정 법으로측정하였다[3]. Washed platelet# 37℃에서 3분간 in cubation 시킨 후 농도별로 시료를 처리하고 2분 후 혈소판응집을 유도하는 물질 ADP (6 piM)으로 응집을 유도하였으며, 10분간 측정한 후 억제정도를 계산하였다. 억제정도(%) 는 시료를 처리하지 않은 것을 control로 하여, 아래와 같은 방법으로 구하였다.
이 주줄물을 물에 현탁 시킨 후 n-hexane, CHCla, EtOAc 및 BuOH로 순차적으로 3회 반복 추출하였다. 각 분획들을 감압 농축한 후 동결 건조하여 hexane 분획 (4.3 g), CHCI3 분획 (2.4 g), EtOAc 분획 (2.6 g), BuOH 분획(15.6 g) 및 남은 HQ 층(82.5 g)을 얻었다.
독활 메탄올 추출물과 그 분획의 항혈전 및 항산화 효과를 확인하기 위하여 ADP를 이용하여 혈소판 응집 억제효과를 탐색하고 DPPH 및 ABTS-radical 소거능을 측정하여 항산화능을 측정하였다. 그 결과 독활, 특히 EtOAc 분획은 ADP에 의해 유도된 혈소판응집과 트롬빈에 의한 혈소판 부착에 대하여 농도 의존적으로 저해효과를 나타내었으며, 높은 폴리페놀 함량과 가장 높은 라디칼 소거능을 통하여 독활의 항산화 효과를 확인하였다.
먼저 독활의 메탄올 추출물의 혈소판 응집억제효과 검색 결과 우수한 항혈소판 작용을 나타내었으므로 이 추출물을 통상적인 방법으로 분획하여 각 분획에 대한 활성을 검색하였다. 혈소판의 응고 촉진제로 사용된 ADP (6 |iM)에 의해서 혈소판의 응고가 유도되었으며, 혈소판을 독활의 메탄올 추출물 또는 그 분획들과 2분간 전처리한 후 ADP로 응고를 유도하면 헥산과 클로로포름분획을 제외한 시료에 의해 응고가 억제되는 것을 관찰하였다(Table 1).
방법 [18]에 따라 측정하였다. 세척하여 얻은 혈소판은 농도별 시료와(10, 25, 50, 100, 200 μg/ml) 함께 또는 혈소판 만(대조군)을 100 μl씩 각각의 well에서 37℃에서 10분간 보관한 후 50 μl 트롬빈(0.2 U/ml)으로 혈소판을 활성화 시켰다. 96-well plate는 콜라겐(40 ㎍/ml in 0.
시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 1, 1-di- phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 환원력을 측정한것으로, 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 0.8 ml와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH (Sigma Chemical Co. Chicago, IL, USA) 용액 0.2 ml를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다[16]. 각 시료 추출물의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조 구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RCso 값으로 나타내었다.
식물의 폴리페놀 및 플라보노이드와 항혈전 효과와의 연관성을 알아보기 위하여 독활 추출물과 분획층의 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며, 이 추출물의 직접적인 항산화 효과를 알아보기 위하여 DPPH 및 ABTS의 radical 감소를 측정함으로서 시료의 free radical-scavenging 활성을 조사하였다. Table 2에 나타낸 것과 같이 추출물의 총 폴리페놀은 27.
7 g)로 사용하였다. 이 주줄물을 물에 현탁 시킨 후 n-hexane, CHCla, EtOAc 및 BuOH로 순차적으로 3회 반복 추출하였다. 각 분획들을 감압 농축한 후 동결 건조하여 hexane 분획 (4.
각 시료 추출물의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조 구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RCso 값으로 나타내었다. 이때 상대활성의 비교를 위하여 대조군으로 25 mg/ml butylated hydroxy anisole (BHA) 를 사용하였으며 모든 실험은 3회 반복 측정하였다.
이상과 같이 EtOAc 분획물의 항혈소판과 항산화 효과가 가장 높게 나타났으므로 EtOAc 분획물의 혈소판 활성에 대한 억제능을 응집과 부착에 대하여 효과로 알아보았다. 혈소판의 부착은 혈소판 활성화 과정의 초기과정으로 콜라겐이나 피브리노겐과 같은 단백질에 의해서 이루어진다.
이를 실온에서 1시간 반응한 후 spectrophotometer를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid를 이용하여 작성한표준곡선으로 함량을 구하였다.
4)에 suspension 시켜서 washed platelet로 하였다[12]. 혈소판 응집 억제능에 사용한 washed platelet는 cell counter (Hema-vet HV950FS, Drew scientific, USA)를 이용하여 혈소판 수를 계측하고 buffer로 희석하여 혈소판이 3xl08 platelet/ml이 되도록 조정하였다. 혈소판은 저온에서 응집되므로 이상의 실험은 상온에서 실행하였다.
대상 데이터
건조된 독활 1 kg을 10배 (w/v)의 80% 메탄올로 3회 추출, 여과(Whatman NO.3, England) 하고 vacuum evaporator (R-3000, Buchi, Switzerland)로 농축한 후 동결 건조하여 메탄올 주줄물(161.7 g)로 사용하였다. 이 주줄물을 물에 현탁 시킨 후 n-hexane, CHCla, EtOAc 및 BuOH로 순차적으로 3회 반복 추출하였다.
본 실험에 사용된 Sprague-Dewley rat은 (주)오리엔트바이오에서 분양 받아 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 스트레스를 최소화하고, 몸무게 250-300 g 의 male을 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용한 독활(A. continentalis Kitagawa)은 대구광역시 약령시장에서 원산지는 중국인 건조된 것을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3-5회 반복 시행되었으며, 결과는 평균±SEM 또는 SD로 나타냈으며, 두 그룹 사이의 유의차는 unpaired Student's f-test에 의하여 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
ABTS radical-g- 이용한 항산화력 측정 은 ABTS cation de- colourisation assay방법[1 기에 의하여 실시하였다. 14 mM ABTS (2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)용액과 4.
Rat의 혈소판 응집 억제능은 Aggregometer (Chrono-Log Co., Ltd., Havertown, PA. USA)를 이용한 탁도 측정 법으로측정하였다[3]. Washed platelet# 37℃에서 3분간 in cubation 시킨 후 농도별로 시료를 처리하고 2분 후 혈소판응집을 유도하는 물질 ADP (6 piM)으로 응집을 유도하였으며, 10분간 측정한 후 억제정도를 계산하였다.
총 폴리페놀 함량은 널리 사용되고 있는 Folin-denis [14] 법을 응용한 방법[15]에 따라 측정하였다. 먼저 시료 1 mg을증류수 1 ml에 녹이고, 10배 100배 희석한 희석액 2 ml에 2 배로 희석한 Folin 시약 2 ml을 첨가하고 3분간 반응 시킨 후 NaKG를 서서히 가하였다.
활성화된 혈소판의 피브리노겐 또는 콜라겐에의 부착은 Tsuzynski 방법 [18]에 따라 측정하였다. 세척하여 얻은 혈소판은 농도별 시료와(10, 25, 50, 100, 200 μg/ml) 함께 또는 혈소판 만(대조군)을 100 μl씩 각각의 well에서 37℃에서 10분간 보관한 후 50 μl 트롬빈(0.
성능/효과
EtOAc 분획물의 혈소판 응집에 대한 억제효과를 ADP (6 HM)로 응고를 유도하여 테스트한 결과, 사용한 농도 범위에서 모두 농도 의존적으로 응고에 억제효과 있었으며 (Fig. 1), 이 에 대한 ICso 값은 217.7 μg/ml로 나타났다. 또한 혈소판이 피브리노겐과 콜라겐에 부착하는 것에 대한 억제효과를 트롬빈(0.
측정하였다. 그 결과 독활, 특히 EtOAc 분획은 ADP에 의해 유도된 혈소판응집과 트롬빈에 의한 혈소판 부착에 대하여 농도 의존적으로 저해효과를 나타내었으며, 높은 폴리페놀 함량과 가장 높은 라디칼 소거능을 통하여 독활의 항산화 효과를 확인하였다. 이상의 결과로 독활 EtOAc 분획의 높은 DPPH 및 ABTS radical 소거능이 항혈소판 효과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
독활의 메탄올 추출물과 분획 층을 100 ng/ml 의 농도에서 DPPH radical-scavenging 효과를 비교한 결과, 추출물과 EtOAc 분획의 RC50값은 각각 59.1±20.5과 45.4± 32.4 ng/ ml로 다른 분획 층들에 비교해서 높은 라디칼 소거능이 있었다(Table 3). 이것은 대조구로 사용된 BHA 보다는효과가 적었으나, 조추출물과 분획물로서는 비교적 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다.
이것은 대조구로 사용된 BHA 보다는효과가 적었으나, 조추출물과 분획물로서는 비교적 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 ABTS 라디칼 소거능은 전체적으로 DPPH 라디컬에 대한 효과에 비교하면 낮았으며 추출물의 경우 RC50값이 968.0±46.5 μg/ml였으나, EtOAc 분획에서 213.6±12.2 μg/ml로 소거능이 4배 이상 높아져 폴리페놀이 풍부한 층에서 항산화능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(Table 4).
7 μg/ml로 나타났다. 또한 혈소판이 피브리노겐과 콜라겐에 부착하는 것에 대한 억제효과를 트롬빈(0.2 U/ml)으로 혈소판을 활성화하여 조사한 결과, EtOAc 분획물이 농도의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며 시료농도 100 μg/ml과 200 Hg/ml에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 2).
혈소판의 응고 촉진제로 사용된 ADP (6 |iM)에 의해서 혈소판의 응고가 유도되었으며, 혈소판을 독활의 메탄올 추출물 또는 그 분획들과 2분간 전처리한 후 ADP로 응고를 유도하면 헥산과 클로로포름분획을 제외한 시료에 의해 응고가 억제되는 것을 관찰하였다(Table 1). 메탄올 추출물, EtOAc, BuOH, H2O 분획의 농도 100 μg/ml에서 대조군에 비하여 각각 41.6%, 46.0%, 38.9%, 18.0%의 저해효과를 나타내었다. 이와 같이 독활의 EtOAc 분획에서 가장 높은 혈소판 응집 억제 효과를 나타내어 강한 항혈소판 활성 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되며 부탄올 분획에서도 높은 활성을 확인하였다.
9 mg/g으로 보고되었다[19]. 이 결과와 비교해 볼 때 독활의 EtOAc 분획은 높은 함량의 폴리페놀를 함유하고 있는 것을 알 수 있다. 식물의 폴리페놀 또는 플라보노이드가 항혈전 능에 미치는 영향에 관한 연구는 많지 않으나, cyclooxygenase- 2 활성의 억제 [2이, 혈소판내의 cAMP농도의 감소, TxA2의억제 및 PGI2의 증가[21, 22] 등의 arachidonate cascade의 초기 과정을 조절하는 것으로 나타났다.
4 ng/ ml로 다른 분획 층들에 비교해서 높은 라디칼 소거능이 있었다(Table 3). 이것은 대조구로 사용된 BHA 보다는효과가 적었으나, 조추출물과 분획물로서는 비교적 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 ABTS 라디칼 소거능은 전체적으로 DPPH 라디컬에 대한 효과에 비교하면 낮았으며 추출물의 경우 RC50값이 968.
그 결과 독활, 특히 EtOAc 분획은 ADP에 의해 유도된 혈소판응집과 트롬빈에 의한 혈소판 부착에 대하여 농도 의존적으로 저해효과를 나타내었으며, 높은 폴리페놀 함량과 가장 높은 라디칼 소거능을 통하여 독활의 항산화 효과를 확인하였다. 이상의 결과로 독활 EtOAc 분획의 높은 DPPH 및 ABTS radical 소거능이 항혈소판 효과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
0%의 저해효과를 나타내었다. 이와 같이 독활의 EtOAc 분획에서 가장 높은 혈소판 응집 억제 효과를 나타내어 강한 항혈소판 활성 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되며 부탄올 분획에서도 높은 활성을 확인하였다.
혈소판의 응고 촉진제로 사용된 ADP (6 |iM)에 의해서 혈소판의 응고가 유도되었으며, 혈소판을 독활의 메탄올 추출물 또는 그 분획들과 2분간 전처리한 후 ADP로 응고를 유도하면 헥산과 클로로포름분획을 제외한 시료에 의해 응고가 억제되는 것을 관찰하였다(Table 1). 메탄올 추출물, EtOAc, BuOH, H2O 분획의 농도 100 μg/ml에서 대조군에 비하여 각각 41.
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