Objectives: The purpose of this study was to investigate the effects of Angelicae pubescentis Radix water extract (ACE) on immune properties in macrophage cells. Methods: The cells were divided into two groups: As a control, the first was not treated with ACE, and the other was treated with ACE. Tog...
Objectives: The purpose of this study was to investigate the effects of Angelicae pubescentis Radix water extract (ACE) on immune properties in macrophage cells. Methods: The cells were divided into two groups: As a control, the first was not treated with ACE, and the other was treated with ACE. Together with the cell viability, productions of nitric oxide (NO) and cytokines such as interleukin (IL)-$1{\beta}$, IL-6, and tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ by treating of ACE were monitored. Results: 1. There was no decrease of the cell viability after 24 hr incubation, but a significant decrease after 48 hr incubation with all four concentrations (25, 100, 200, and $400\;{\mu}g/m{\ell}$) of ACE. 2. A significant increase in the production of NO was observed in the concentrations above $50\;{\mu}g/m{\ell}$ of ACE after 24 hr incubation. 3. Further, after 48 hr incubation, the critical concentration of ACE for the increase was reduced to $25\;{\mu}g/m{\ell}$. 4. The production of (IL)-$1{\beta}$ significantly increased with the ACE concentrations of 100 and $200\;{\mu}g/m{\ell}$ after 24 hr incubation. 5. The production of IL-6 significantly increased with the ACE concentration of $200\;{\mu}g/m{\ell}$ after 24 hr incubation. 6. A significant increase in the production of (TNF)-${\alpha}$ was detected with ACE concentrations of 50, 100, and $200\;{\mu}g/m{\ell}$ after 24 hr incubation. Conclusions: These show that ACE increases mouse macrophage NO production at concentrations above $50\;{\mu}g/m{\ell}$, and the cytokines ((IL)-$1{\beta}$, IL-6, and (TNF)-${\alpha}$) at concentrations above $200\;{\mu}g/m{\ell}$. These results suggest that ACE improves macrophage immune property.
Objectives: The purpose of this study was to investigate the effects of Angelicae pubescentis Radix water extract (ACE) on immune properties in macrophage cells. Methods: The cells were divided into two groups: As a control, the first was not treated with ACE, and the other was treated with ACE. Together with the cell viability, productions of nitric oxide (NO) and cytokines such as interleukin (IL)-$1{\beta}$, IL-6, and tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ by treating of ACE were monitored. Results: 1. There was no decrease of the cell viability after 24 hr incubation, but a significant decrease after 48 hr incubation with all four concentrations (25, 100, 200, and $400\;{\mu}g/m{\ell}$) of ACE. 2. A significant increase in the production of NO was observed in the concentrations above $50\;{\mu}g/m{\ell}$ of ACE after 24 hr incubation. 3. Further, after 48 hr incubation, the critical concentration of ACE for the increase was reduced to $25\;{\mu}g/m{\ell}$. 4. The production of (IL)-$1{\beta}$ significantly increased with the ACE concentrations of 100 and $200\;{\mu}g/m{\ell}$ after 24 hr incubation. 5. The production of IL-6 significantly increased with the ACE concentration of $200\;{\mu}g/m{\ell}$ after 24 hr incubation. 6. A significant increase in the production of (TNF)-${\alpha}$ was detected with ACE concentrations of 50, 100, and $200\;{\mu}g/m{\ell}$ after 24 hr incubation. Conclusions: These show that ACE increases mouse macrophage NO production at concentrations above $50\;{\mu}g/m{\ell}$, and the cytokines ((IL)-$1{\beta}$, IL-6, and (TNF)-${\alpha}$) at concentrations above $200\;{\mu}g/m{\ell}$. These results suggest that ACE improves macrophage immune property.
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문제 정의
본 연구에서는 獨活을 물 추출하여 얻은 시료 ACE로 마우스 대식세포를 이용하여 cell viability, NO 생성, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 cytokine 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
이에 본 연구에서는 독활이 대식세포 면역 활동에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 열수 추출하여 얻은 추출물(이하 ACE)로 마우스 대식세포에 전처리 후 배양하여 cell viability와 NO 생성을 관찰하였고, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 cytokine 생성에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
의 방법을 응용, 세포배양액 중에 존재하는 NO를 Griess 시약을 이용하여 측정하였고, NO의 농도를 추정하기 위해 microplate reader를 이용, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 NO의 생성 정도를 비교하였다. 0, 25, 50, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 다양한 시료를 배지에 담아 각 well에 처리하고 24 혹은 48시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 60 ㎕을 채취하여 여기에 Griess 시약 100 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 뒤 microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 NO 생성은 다음 공식으로 계산되었다.
96 well plate에 1×105 cells/㎖의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 0, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등의 다양한 농도의 시료와 함께 배지에 담아 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
96 well plate에 1×104 cells/well의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어주었다. 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 0, 25, 50, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 시료를 각 well에 처리하고 24 혹은 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 PBS에 녹인 1 ㎍/㎖ MTT(Sigma, USA)를 100 ㎕씩 각 well에 처리하여 알루미늄 호일로 차광시킨 뒤 2시간 동안 같은 조건에서 배양하였다.
배양이 끝나면 상등액을 채취하여 Bio-Plex Suspension Assay System을 이용, Quantitative Multiplexed Cytokine/Chemokine Assay를 실시하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 마우스 대식세포 cytokine 생성에 대한 시료의 영향을 계산, 비교하였다.
본 연구에서는 獨活을 물 추출하여 얻은 시료 ACE로 마우스 대식세포를 24시간, 48시간 배양하여 cell viability와 NO생성을 관찰하였고, 24시간 배양하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 cytokine 생성에 미치는 영향을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
세포로부터 생성되는 NO의 양은 Weissman 등22-24)의 방법을 응용, 세포배양액 중에 존재하는 NO를 Griess 시약을 이용하여 측정하였고, NO의 농도를 추정하기 위해 microplate reader를 이용, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 NO의 생성 정도를 비교하였다. 0, 25, 50, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 다양한 시료를 배지에 담아 각 well에 처리하고 24 혹은 48시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 60 ㎕을 채취하여 여기에 Griess 시약 100 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 뒤 microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (NUAIRE, USA), pulverizer(Rong tsong, Taiwan), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), air compressor(Tamiya, Japan), homogenizer(Omni, USA), research microscope(Becton dickinson, USA), centrifuge(Hanil, Korea), fume hood(Hanil, Korea), clean bench(Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner(Branson, USA), microplate reader(Bio-Rad, USA), thermo aluminum bath(Fine PCR, USA), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), water bath(iNtRON biotech, Korea), ice-maker(Vision Scientific Co, Korea) 및 Bioplex-200(Bio-rad, USA) 등이다.
본 실험을 위해서 ethyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), methyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), DMSO(Sigma, USA), DMEM(Sigma, USA), 1×phosphate buffered saline(PBS, Sigma, USA), EDTA(Sigma, USA), acetic acid(Sigma, USA), isopropanol(Sigma, USA), trypsin-EDTA(Sigma, USA), NO assay kit(Oxford Biomedical Research, USA) 및 Bio-Plex cytokine assay kit(Panomics, USA) 등이 사용되었다.
실험에 사용된 mouse 대식세포는 Raw 264.7 cell line(한국 세포주 은행, Korea)을 사용하였다.
실험에 사용된 獨活(Angelicae Pubescentis Radix; root of Aralia continentalis KITAGAWA, 옴니허브, Korea)은 2008년 11월에 구입(NO: 2008-11-0009)하였고, 약재는 사용 전에 초음파 세척기(ultrasonic cleaner)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.
2, Japan)로 감압 여과하고 이 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었다. 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 시료로 사용하였고, 동결건조 추출물은 11.46 g을 얻었으며, 수율은 22.91%이었다.
데이터처리
본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 mean ± SD로 나타냈으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student’s t-test로 분석하여 p-value가 0.05 미만일때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
Raw 264.7 cells에 나타내는 세포독성 유발 효과를 알아보기 위하여 Mosmann 등21)의 방법을 응용하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×104 cells/well의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어주었다.
성능/효과
1. 세포생존율을 측정한 결과 24시간 배양한 군에서는 유의한 변화가 없었고, 48시간 배양한 군에서는 25, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 농도에서 유의한 감소를 보였다.
2. 마우스 대식세포의 NO 생성은 24시간 배양한 군에서는 50, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 농도에서 유의한 증가를 보였다.
3. 마우스 대식세포의 NO 생성은 48시간 배양한 군에서는 모든 농도에서 유의한 증가를 보였다.
4. 마우스 대식세포의 IL-1β 생성은 100, 200 ㎍/㎖의 농도 군에서 유의한 증가를 보였다.
48시간 처리 시 25, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 농도 군에서 유의한 감소를 보였다(Table 2, fig. 2).
5. 마우스 대식세포의 IL-6 생성은 200 ㎍/㎖의 농도 군에서 유의한 증가를 보였다.
6. 마우스 대식세포의 TNF-α 생성은 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등의 농도 군에서 유의한 증가를 보였다.
ACE가 마우스 대식세포 생존율에 미치는 영향을 비교한 결과 24시간 처리 시 생존율의 변화는 없었다(Table 1, fig. 1).
ACE가 마우스 대식세포의 IL-1β 생성에 미치는 영향을 비교한 결과 24시간 처리 시 100, 200 ㎍/㎖ 등의 농도 군에서 유의한 증가를 보였다(Table 5, Fig. 5).
ACE가 마우스 대식세포의 IL-6 생성에 미치는 영향을 비교한 결과 24시간 처리 시 200 ㎍/㎖의 농도 군에서 유의한 증가를 보였다(Table 6, Fig. 6).
ACE가 마우스 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 비교한 결과 24시간 처리 시 50, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 농도 군에서 유의한 증가를 보였다(Table 3, Fig. 3).
ACE가 마우스 대식세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 비교한 결과 24시간 처리 시 모든 농도 군에서 유의한 증가를 보였다(Table 7, Fig. 7).
ACE의 마우스 대식세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행한 결과 24시간 동안 배양한 경우에는 유의한 변화가 나타나지 않았으나, 48시간의 배양에서는 25, 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 등의 농도 군에서 유의한 감소를 나타내 었다.
후속연구
이러한 결과는 ACE가 대식세포의 NO, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 면역매개인자의 생성을 촉진함으로써, 생성된 면역매개인자를 이용한 침입성병원체 및 노화세포잔존물 제거 등의 대식세포 면역 활성을 증진시키는 효능이 있을 것으로 보인다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
獨活에 함유된 성분은 무엇인가?
獨活은 오가과(五加科 두릅나무과 Araliaceae)에 속한 독활 Aralia continentalis KITAGAWA(Aralia cordata THUNB.)의 뿌리를 건조하여 사용하며30), 정유 성분 1~2%, 스테아린산 0.07%, 수지, 살리실산과, 디테르펜산, 구리, 망간 및 니켈 등이 함유되어 있다31). 性은 溫 無毒하고, 味는 辛苦하며30), 辛溫發散, 祛風勝濕하는 效能으로 熟地黃, 當歸, 川芎, 續斷, 杜沖, 白芍藥 및 桑寄生등을 配合하여 부인과 임상에서는 産後 身痛과 下肢痛의 치료에 사용해 왔다4).
IL-1β의 특징은 무엇인가?
IL-1β 는 TNF-α와 그 기능이 유사하며, 적절히 발현되면 생체방어기능으로서 B림프구와 T림프구의 증식과 분화를 촉진시키며 항염증반응, 항종양작용 및 조혈작용 등을 하나, 과잉 또는 장기적인 생성이 일어나게 되면 생체침습작용으로 발열반응, 염증, 조직파괴, 쇼크 등을 일으킬 수도 있다50). ACE는 24시간의 배양에서 마우스 대식세포의 IL-1β 생성을 100, 200 ㎍/㎖의 농도 군에서 유의하게 증가시켰다.
獨活의 효능은 무엇인가?
07%, 수지, 살리실산과, 디테르펜산, 구리, 망간 및 니켈 등이 함유되어 있다31). 性은 溫 無毒하고, 味는 辛苦하며30), 辛溫發散, 祛風勝濕하는 效能으로 熟地黃, 當歸, 川芎, 續斷, 杜沖, 白芍藥 및 桑寄生등을 配合하여 부인과 임상에서는 産後 身痛과 下肢痛의 치료에 사용해 왔다4). 강활(羌活)과 비교하여 羌之氣淸 行氣而發散營衛之邪, 獨之氣濁 行血而溫養營衛之氣, 羌有發表之功, 獨有助表之力7)이라 하여, 독활에 대한 기존 연구는 독활의 항염증작용32), 항균활성에 대한 연구33) 외 다수34-46)의 연구는 있었지만 독활의 면역활성에 대한 연구는 없었다.
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