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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 두경부암 세포주에서도 이 유전자에 methylation 변이가 있는지를 제한효소 BstUI을 이용한 COBRA assay, direct sequencing 방법으로 분석한 후RT-PCR 방법으로 그 발현 정도를 조사하여 methylation 변이와의 관련성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 5 mM)/X-gal (80 ㎍/㎖)이 함유된 LB plate에 도말하여 vector가 transformation된 white colony만 분리하였다. Ampicilin을 포함한 LB 액체배지에 이들을 배양하여 plasmid DNA를 추출하고 EcoRⅠ을 처리하여 2% agarose gel 상에서 원하는 DNA의 삽입을 확인하고 ABI 3100 (Applied Biosystems) automated DNA sequencer를이용하여 T7 또는 SP6 primer로 염기 서열을 분석하였다.
- PCR의 반응조건은 95℃에서 5분동안 변성한 후, 95℃에서 1분간, 55℃에서 2분간, 72℃에서 2분간으로 30주기 실시하고 마지막으로 72℃에서 7분동안 진행시켰다. PCR의 반응산물은 2% agarose gel에서 전기영동 한 후ethidium bromide로 염색하여 자외선상에서 확인하였다.
- TPEF coding 부위에 속하는 289bp를 증폭하기 위하여 5’-ACA CTT TGC GAG GGC TTT T (S) 및5’-TCT GGT AGC TCT CCC CAT TG (AS)를primer로 사용하였다. RT-PCR의 내부 대조군으로 GAPDH를 사용하였으며 primer는 GAPDH-238S, 5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT와 GAPDH-238AS, 5’-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG로 238bp를 증폭하였다. PCR의 반응조건은 95℃에서 5분동안 변성한 후, 95℃에서 1분간, 55℃에서 2분간, 72℃에서 2분간으로 30주기 실시하고 마지막으로 72℃에서 7분동안 진행시켰다.
- SCC 15와 SCC 25는 0.4 ㎍/㎖ hydrocortisone을 포함한 DMEM/han’s F-12배지에서, FaDU와 RPMI 2650은 MEM 배지에서, CAL27은 DMEM 배지에서, SNU 세포주들은 RPMI 1640 배지에서 모두 10% fetal bovine serum을 첨가하여 5% CO2 농도에서 배양하였다. 이들 세포주로부터 DNA를 분리하기 위하여 Sambrook 등25)의 방법을 이용하였다.
- TPEF 유전자의 methylation된 염기서열을 분석하기 위하여 bisulfite가 처리된 DNA를 COBRA assay에서와 동일한 primer를 사용하여 증폭, 정제한 후 pGEM-T Easy Vector (Promega)에 삽입하고 E. coli JM109에 transformation하였다. 이들을 ampicillin (100 ㎍/㎖)/IPTG (0.
- TPEF유전자의 promoter의 methylation 정도를 조사하기 위해 간암과 폐암에서 비교적 methylation 변이가 빈번하게 일어난 것으로 밝혀진 부위를 PCR 방법으로 증폭하였다. 이때 사용된 DNA는 bisulfite에 의해 변형된 것이며 사용한 primers는 5’-TAG AGT TGT ACG AAT TAG TTA TGG TGT TGT(S) 및 ‘5 -CAT CAA CAA TTC CCC TTA TTT CTC TAA A(AS) 이었다.
- TRIzol reagent (GIBCO BRL, USA)를 사용하여 분리한 total RNA 5 ㎍을 M-MuLV Reverse Transcription System (MBI Fermantoas, Lituania)을 이용하여 cDNA로 만든 후 다음과 같은 primer를 이용하여 PCR을 실시하였다. TPEF coding 부위에 속하는 289bp를 증폭하기 위하여 5’-ACA CTT TGC GAG GGC TTT T (S) 및5’-TCT GGT AGC TCT CCC CAT TG (AS)를primer로 사용하였다.
- 본 연구팀은 Ms AP-PCR 방법을 이용하여 간암, 폐암조직을 대상으로 이러한 연구를 수행하던 중 정상조직과 다르게 hypermethylation 되어 있는 TPEF 유전자의 5’부위를 분리하였고, 이 부위는 TPEF 5’ UTR에서 시작하여 exon 1을 포함하는 전형적인 CpG island의 일부분이었다. TPEF는 Northern master blot 분석을 통하여 성인의 측두엽, 시상, 해마 등 뇌영역과 전립선에서 태아의 forebrain에서 활발히 발현되는 것으로 알려져 있으며24), 구조적으로 2개의 follistatin domain과 1개의 EGF domain을 가지는 transmembrain protein으로, follistatin은 activin과 다수의 TGF-βfamily와 결합하여 그들의 작용을 저해하는 것으로 보고 되고 있다30).
- PCR 반응주기는 95℃에서 5분 동안 변성한 후 95℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간으로 35주기 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분 동안 진행시켰으며 반응산물은 358 bp였다. 이 PCR 반응산물을 resin (JETSORB, Genomed)으로 정제하여 COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) assay27)를 통하여 methylation 변화를 조사하였다. 즉, BstU Ⅰ(New England Biolab)을 처리하여 60℃에서 3시간 반응시켜 2% agarose에서 전기영동하여 CGCG recognition site가 sodium bisulfite 처리 후에도 그대로 CGCG로 유지되어 절단되는지를 관찰하여 methylation 유무를조사하였다(Fig.
- 이 PCR 반응산물을 resin (JETSORB, Genomed)으로 정제하여 COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) assay27)를 통하여 methylation 변화를 조사하였다. 즉, BstU Ⅰ(New England Biolab)을 처리하여 60℃에서 3시간 반응시켜 2% agarose에서 전기영동하여 CGCG recognition site가 sodium bisulfite 처리 후에도 그대로 CGCG로 유지되어 절단되는지를 관찰하여 methylation 유무를조사하였다(Fig. 2).
- 의 방법을 변형하여 genomic DNA의 bisulfite modification을 수행하였다. 즉, genomic DNA 5 ㎍을 bisulfite 반응이 잘 일어나게 RsaI으로 처리하고 에탄올로 침전시킨 뒤 건조 시키고 초순수 50 ㎕ 를첨가하였다. 이를 최종농도 0.
- 지름 100mm의 plate당 1×106)의 세포주를 분주하고 1.0 uM의 농도로 5-AzaC (Sigma, USA)를 매일 10% FBS를 포함하는 DMEM 1640 배지를 교체하면서 3일간 처리하였다. 그 후 5-AzaC를 넣지 않은 동일한 배지로 하루 더 배양한 뒤 PBS (pH 7.
대상 데이터
- SCC 15, SCC 25, FaDU, CAL 27 그리고RPMI 2650 등 5종의 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 구입하였고, SNU 585, SNU 899, SNU 1066, SNU 1076, SNU 1214 등 5종은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구입하였다. 세포주의 기원 및 원발병소는 Table 1에 나타내었다.
- TRIzol reagent (GIBCO BRL, USA)를 사용하여 분리한 total RNA 5 ㎍을 M-MuLV Reverse Transcription System (MBI Fermantoas, Lituania)을 이용하여 cDNA로 만든 후 다음과 같은 primer를 이용하여 PCR을 실시하였다. TPEF coding 부위에 속하는 289bp를 증폭하기 위하여 5’-ACA CTT TGC GAG GGC TTT T (S) 및5’-TCT GGT AGC TCT CCC CAT TG (AS)를primer로 사용하였다. RT-PCR의 내부 대조군으로 GAPDH를 사용하였으며 primer는 GAPDH-238S, 5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT와 GAPDH-238AS, 5’-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG로 238bp를 증폭하였다.
- TPEF유전자의 promoter의 methylation 정도를 조사하기 위해 간암과 폐암에서 비교적 methylation 변이가 빈번하게 일어난 것으로 밝혀진 부위를 PCR 방법으로 증폭하였다. 이때 사용된 DNA는 bisulfite에 의해 변형된 것이며 사용한 primers는 5’-TAG AGT TGT ACG AAT TAG TTA TGG TGT TGT(S) 및 ‘5 -CAT CAA CAA TTC CCC TTA TTT CTC TAA A(AS) 이었다. PCR 반응주기는 95℃에서 5분 동안 변성한 후 95℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간으로 35주기 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분 동안 진행시켰으며 반응산물은 358 bp였다.
이론/모형
- 4 ㎍/㎖ hydrocortisone을 포함한 DMEM/han’s F-12배지에서, FaDU와 RPMI 2650은 MEM 배지에서, CAL27은 DMEM 배지에서, SNU 세포주들은 RPMI 1640 배지에서 모두 10% fetal bovine serum을 첨가하여 5% CO2 농도에서 배양하였다. 이들 세포주로부터 DNA를 분리하기 위하여 Sambrook 등25)의 방법을 이용하였다. 즉, 세포주를 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.
성능/효과
- 2에 나타내었다. 각 세포주 별로 methylation 빈도를 살펴보면, 먼저 FaDU의 경우에는 5개의 clone에서 평균 15.4개(90.6%)에서 methylation 이 확인되어 가장 높은 빈도를 보였으며, RPMI 2650의 경우에는 예상한 바와 같이 4개의 clone에서 평균 1.8개(10.6%)의 CpG site가 methylation 되어 가장 낮은 빈도를 나타내었다. 나머지 세포주에서도 평균 9개(52.
- 두경부암세포주 10례의 TPEF 발현양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과 methylation이 전혀 관찰되지 않은 RPMI 2650에서는 TPEF 발현정도가 매우 높은 것으로 나타났다. 반면 SCC 15, SCC 25 및 SNU 1214에서는 거의 발현되지 않거나 그 정도가 매우 낮음을 알 수 있었다.
- 이러한 발현의 차이가 methylation 변이에 의한 것임을 확인하기 위하여 demethylating agent인 5-AzaC를 처리한 결과 RPMI 2650의 경우 전혀 영향을 받지 않았으나 TPEF가 거의 발현되지 않았던 세포주에서는 모두 발현이 증가하였다. 또한 FaDU (90.6%) 및 SNU 1066 (78.2%)의 경우에도 현저한 발현 증가를 보였으며, 나머지 세포주에서도 5-AzaC에 의해 발현정도가 다소 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과로 미루어 두경부암 세포주에서 TPEF의 methylation 유무와 발현정도 간에 관련성이 있는 것으로 확인되었다.
- 이러한 결과는 두경부암 세포주에서의 methylation 변이가 이전의 간암세포주4/8(50%) 보다 훨씬 높은 빈도로 발생함을 보여준다. 또한 bisulfite sequencing 결과에서도 RPMI 2650을 제외한 모든 세포주에서 clone당 평균 52.9%-90.6%의 CpG site가 methylation되어 있음을 확인하였다. 실제로 이들 세포주의 total RNA를 대상으로 RT-PCR을 행한 결과 RPMI 2650에서 TPEF가 가장 많이 발현되는 것으로 나타났으며, SCC 15 (52.
- 본 연구에서는 10종의 두경부암 세포주에서 TPEF 5’부위의 methylation 분석을 위하여 BstU1을 이용한 COBRA assay로 조사한 결과, RPMI 2650을 제외한 9주의 세포주에서 고밀도의 hypermethylation이 관찰되었다. 이러한 결과는 두경부암 세포주에서의 methylation 변이가 이전의 간암세포주4/8(50%) 보다 훨씬 높은 빈도로 발생함을 보여준다.
- 본 연구의 결과를 종합하면 TPEF는 현재까지 보고된 방광암, 대장직장암, 간암에 이어 두경부암 세포주에서도 methylation 변이에 의해 불활성화 되는 새로운 종양억제 유전자로 추정되며, TPEF promoter의 5’upsteeam 부위의 methylation 밀도와 발현량이 반비례함을 확인하였다. 앞으로 종양조직을 대상으로 한 연구를 실시하여 두경부암의 조기진단 및 치료에 대한 응용가능성을 모색할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 6%의 CpG site가 methylation되어 있음을 확인하였다. 실제로 이들 세포주의 total RNA를 대상으로 RT-PCR을 행한 결과 RPMI 2650에서 TPEF가 가장 많이 발현되는 것으로 나타났으며, SCC 15 (52.9%), SCC 25 (85.9%), SNU 1214 (61.8%)등 세포주에서는 거의 발현이 되지 않았다. 이러한 발현의 차이가 methylation 변이에 의한 것임을 확인하기 위하여 demethylating agent인 5-AzaC를 처리한 결과 RPMI 2650의 경우 전혀 영향을 받지 않았으나 TPEF가 거의 발현되지 않았던 세포주에서는 모두 발현이 증가하였다.
- 2%)의 경우에도 현저한 발현 증가를 보였으며, 나머지 세포주에서도 5-AzaC에 의해 발현정도가 다소 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과로 미루어 두경부암 세포주에서 TPEF의 methylation 유무와 발현정도 간에 관련성이 있는 것으로 확인되었다. 하지만 이러한 결과가 methylation 이외에 다른 negative factor에 의한 영향이거나, 대립형질 소실 등 유전적인 변이에 의한 현상일 수도 있으므로 이에 대한 보완분석이 필요할 것으로 여겨진다.
- 8%)등 세포주에서는 거의 발현이 되지 않았다. 이러한 발현의 차이가 methylation 변이에 의한 것임을 확인하기 위하여 demethylating agent인 5-AzaC를 처리한 결과 RPMI 2650의 경우 전혀 영향을 받지 않았으나 TPEF가 거의 발현되지 않았던 세포주에서는 모두 발현이 증가하였다. 또한 FaDU (90.
후속연구
- 본 연구의 결과를 종합하면 TPEF는 현재까지 보고된 방광암, 대장직장암, 간암에 이어 두경부암 세포주에서도 methylation 변이에 의해 불활성화 되는 새로운 종양억제 유전자로 추정되며, TPEF promoter의 5’upsteeam 부위의 methylation 밀도와 발현량이 반비례함을 확인하였다. 앞으로 종양조직을 대상으로 한 연구를 실시하여 두경부암의 조기진단 및 치료에 대한 응용가능성을 모색할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 이러한 결과로 미루어 두경부암 세포주에서 TPEF의 methylation 유무와 발현정도 간에 관련성이 있는 것으로 확인되었다. 하지만 이러한 결과가 methylation 이외에 다른 negative factor에 의한 영향이거나, 대립형질 소실 등 유전적인 변이에 의한 현상일 수도 있으므로 이에 대한 보완분석이 필요할 것으로 여겨진다.
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