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문제 정의
- 본 연구에서는 52명의 2~6세 치아우식증 환자를 대상으로, 같은 환자에서 우식부위와 비우식치아부위로부터 각각 독립적으로 치태를 채취하여 보다 정확한 PCR방법으로 우"식부위와 비우식부위에서의 S. muCans와 S. sobrinus 분포도의 차이를 비교함으로써 이들 세균과 치아우식증의 연관성을 조사하였다. 52명의 어린이환자에서 S.
- 있었으나3°)어린이에.대한 비교연구가 없었으므로 본 연구에서는 S. mu tans와 S. sobrinus와 치아우식증과의 관계를 관찰하기 위하여 어린이 치아의 우식부위와 비우식부위로부터 치태를 채취한 다음, S. mutans와 S. sobrinus에 특이한 primer를 사용하여 PCR방법으로 이들 세균종의 치태 내 분포를 조사하였다.
제안 방법
- 2~6세인 52명의 치아우식증 환자에서 비우식부위와 우식부위로부터 치태를 채취하여 DNA를 추출한 후 dex와 gtf 유전자에 기초한 S. mu tans 와 S. sobrinus 에 특이한 primer 를 제작한 후 PCR을 시행하여 S. mutans와 S. sobrinus의 분포도를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- sobrinus BT3을 사용하였다. Brain heart infusion(Difco) 액체배지에 표준균주로부터 위에서와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.
- PCRe primer (l~10pmol) 0.5~2同, DNA template (20~60昭/网)2/4, dNTP (0.2mM) 1.6~2以, MgCh (1~ 1.5mM) 1~1.2问, Taq polymerase (Takara: 5 units/问) 0.2-0.25/4, 그리고 나머지는 증류수를 첨가하여 최종 용량을 20~25闻로 조절하였다(Table 2).
- PCR산물은 2% agarose gel상에서 전기영동하였고, gele ethidium bromide (0.5妃/川)로 염색한 후 Gel Doc™ EQ (Bio-Rad)에서 PCR산물을 관찰하고 사진촬영하여 기록하였다.
- PCR에 사용된 각기 다른 primer가 S. mutans나 S. sobrinus를 검출하는데 얼마나 더 효과적인지를 '비교하였다(Table 7). 비우식부위에서 S.
- Primer의 정확성과 효율성을 확인하기 위해 먼저 표준 균주를 사용하여 PCR을 시행한 결과, 이전 연구에서 보고된 것처럼 dexA primer를 사용한 S. mutans PCR산물은 l, 272bp, gtfB primer를 사용한 S. mutans PCR산물은 517bp, 그리고 dex primer와 gtfl primer를 사용한 S. sobrinus의 PCR 산물은 각각 l, 610bp, 712bp로 나타남으로서 (Fig. 1) 위의 primer를 사용하여 환자로부터 얻은 DNA시료에 대한 PCR을진행시켰다.
- 위한 확인용으로 universal primer를 제작하였다幻). S. mu~ tans를 위한 primei■로 S. mutans의 dexA 유전자 염기서열 중에서 S. mutans에만 존재하는 특이 염기서열에 해당하는 부위를 지정하는 forward, reverse prime产)를 제작하였다. S.
- 대조군으로 우식치아와 가능한 멀리 떨어져 있는 구치부에서 치아우식증이 없는 치아를 선택하여 순면으로부터 치은연상 치태를 멸균된 spoon excavator로 채취하였다. 실험군으로 치아우식증의 정도가 C2이상인 치아를 선택한 다음 이들 치아의 우식부위 치태를 멸균된 spoon excavator로 채취하였다.
- 본 실험에서 S. mutans와 S. sobrinus를 최대한 많이 발견하기 위해 dex 유전자와 gtf 유전자에 기초하여 제작한 2가지 primer를 사용하였다. 그 결과 dex와 gtf primer 모두가 S.
- 멸균된 spoon excavator로 채취하였다. 실험군으로 치아우식증의 정도가 C2이상인 치아를 선택한 다음 이들 치아의 우식부위 치태를 멸균된 spoon excavator로 채취하였다. 채취한 치태는 멸균된 1同 phosphate-buffered saline(PB粉이 들어있는 Eppendorf tube에 수집 한 후 DNA 추출을 위해 즉시 실험실로 수송하였다.
- 우식부위와 비우식치아 부위의 치태 내 S. mMams와 S. sobrhms를 검색할 PCR을 위해 primer (Genote산!)를 제작하였다. 우선 사용하는 치태시료 내 DNA의 존재여부를 확인하기
- 치아우식증 환자에서 채취한 각각의 비우식부위와 우식 부위 치태에서 S. mutans와 S. sobrinus 분포도를 조사하였다. S.
- 치태에 존재하는 S. mi泊0S와 S. sobrinus를 PCR로 검색할 때 놓칠 수 있는 확률을 최대한 줄이기 위해, 위에 기술한 primer 이외에도 S. mu切ns를 위해서는 gtfB, S. sobrinus를 위해서는 gtH 유전자에 기초하여 각 세균종에 특이한 primer261 를 제작하였다(Table 1).
- 치태에서 S. mutans와 S. sobrinus 각각의 분포도를 조사하였다. 비우식치아부위에서 채취한 치태의 경우 S.
대상 데이터
- 경희대학교 치과대학 부속치과병원 소아치과에 내원한 2-6 세 어린이 중에서 구내경과 탐침으로 검사하여 C2(C2:상아질까지 진행된 치아우식증)이상의 우식치아를 3개 이상 갖고 있는 환자 중 문진을 통해 최근 14일간 항생제 복용 또는 48시간 내에 전문적 불소도포 시술을 받은 경험이 없는 52명의 어린이를 선별하였다.
- 제작된 primei■가 정상적으로 PCR산물을 만들어 낼 수 있을지와 PCR 조건의 표준화를 위해 표준균주는 S. mutans NCTC 10449와 S. sobrinus BT3을 사용하였다. Brain heart infusion(Difco) 액체배지에 표준균주로부터 위에서와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.
성능/효과
- 1. 어린이 치아우식증 환자에서 S. mutans나 S. sobrinus가 발견된 어린이는 37명(71.2%)이었다.
- 2. 이들 어린이 중에서, S. mutans 또는 S. sobrinus가 비우식부위에서만 발견된 어린이는 3명(5.8%), 우식부위에서만 발견된 어린이는 22명(42.3%), 두 부위 모두에서 발견된 어린이는 12명 (23.1%)이었다.
- 3. S. mutans나 S. sobrinus가 나타난 비우식부위 치태는 15 개(28.8%), 우식부위치태는 34개(65.4%)였다.
- 4. 비우식부위의 경우 S mutans만 출현한 어린이는 52명 중 8명 (15.4%), S. sobrinus만 출현한 어린이는 6명 (11.5%), 두 세균종이 같이 출현한 어린이는 1명 (1.9%)였다.
- 5. 우식부위에서 S. mutans만 출현한 어린이는 52명 중 24명 (46.2%), S. sobrinus만 출현한 어린이는 2명(3.8%), 두 세균 종이 같이 출현한 어린이는 8명 (15.4%)이었다.
- sobrinus 분포도의 차이를 비교함으로써 이들 세균과 치아우식증의 연관성을 조사하였다. 52명의 어린이환자에서 S. mutans나 S. sobrinus가 발견된 어린이는 모두 37명 (71.2%)였다(Table 4). 본 연구와 비슷한 조건에서 치아우식증이 있는 3~5세 일본 어린이 77명으로부터 맹출이 완전히 일어난 치아에서 소독된 칫솔로 수집한 치태 시료를 PCR로 조사한 Okada 등就은 S.
- 6. S. mutans는 gtf에 기초한 primer, S. sobrinus는 dex에 기초한 primer가 PCR에서 효과적으로 각각의 세균을 검출하였다.
- 5%)에서 나타났다. S. sobrinus는 비우식부위에서 7개(13.5%), 우식부위에서 10개 (19.2%)로 나타나, S. mutans가 S. sobrinus보다 분포도가 높을 뿐만 아니라 치아우식증과도 더 관계가 깊은 것으로 생각된다. 이것은 기존에 발표된 여러 연구들의 결과5232628曲와 일치하고 있다.
- sobrinus를 최대한 많이 발견하기 위해 dex 유전자와 gtf 유전자에 기초하여 제작한 2가지 primer를 사용하였다. 그 결과 dex와 gtf primer 모두가 S. mutanst 검출한 경우는 전체 41개 중 30개였고(73.2%), 物유전자를 기준으로 한 primer가 dex primer보다는 민감한 것으로 나타났다. dex와 gtf primer 모두가 S.
- sobrinus도 치아우식증에 중요한 세균이라고 발표하였다. 본 실험에서는 Igarashi 등的이 사용한 것과 같은 primer를 사용하였으나 낮은 S. sobrinus의 분포도를 보였다. 이것은 조사대상자 고유의 차이라고 판단되고, 적어도 우리나라 어린이의 경우는 S.
- sobrinus를 갖고 있는 것으로 나타나 있다. 본 연구가 이들 연구에서 보고된 S. mutans나 S. sobrinus 분포도보다 다소 낮게 나타났다. 채취한 시료양이 이들 연구보다는 다소 적었기 때문에 세균을 일부 검출하지 못했을 가능성을 배제할 수는 없지만, 종족간의 차이일수도 있어 앞으로 보다 다양한 모집단을 대상으로 보다 많은 양의 시료를 채취하여 연구가 계속 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 한편, glucan 합성이외에도 다른 세균에 비해 산성환경에 적응하는 능력(acidurity)이 크다는 것이 MS의 우식원성에 기여하는 요인인데, 차이는 분명 있으나 최근 연구에 따르면 sanguinis streptococci도 산성환경에 처했을 떄 ■적응할 수 있는 기전이 발현되고, 산생성능력도 증가한다는制 사실에 주목할 필요가 있다. 본 연구에서 28.8%의 비우식부위에서도 S. mutans나 S. sobrinus가 발견되었다. Carlsson 등'18의 연구에서도 이들 세균 종이 치아우식증이 없는 어린이에서 본 연구결과보다 높은 96%정도의 분포를 보였다.
- 본 연구에서 S. mutans가 비우식부위의 9개 치태(17.3%), 우식부위에서는 32개 치태(61.5%)에서 나타났다. S.
- 세균의 산생산이 많아진다待. 본 연구에서 모든 우식부위에서 S. mutans나 S. sobrinus가 나타나지는 않았는데, 다른 MS 세균종이 우식부위에 관여하지曲 않았나 생각해 볼 수 있다. S.
- sobrinus를 검출하는데 얼마나 더 효과적인지를 '비교하였다(Table 7). 비우식부위에서 S. mutans가 발견된 9개의 치태 중 7개 (77.8%)는 dexA와 gtfB primer가 동시에 S. mutans를 검출하였다. 그러나 dexA나 gtfB primer만이 검출된 경우도 각각 1개씩으로 나타났다.
- 비우식부위에서 S. sobrinus가 발견된 7개 치태 중에서 dex 와 gtfl primer 모두에 의해 S. sobrinus가 검출된 것은 1개에 불과하였고 대부분 (5개, 71.4%)은 dex primer에 의해서만 검출되었다. 한편 우식부위에서 S.
- sobrinus 각각의 분포도를 조사하였다. 비우식치아부위에서 채취한 치태의 경우 S. mutans만 검출된 것은 52개 중 8개 (15.4%), S. sobrinus만 검출된 것은 6개(11.5%), 두세균종이 함께 검출된 것은 1개(1.9%)였다. 우식부위에서 채취한 치태의 경우; S mutans만 검출된 것은 52개 중 24개(46.
- 어린이의 비우식부위 치태에서 S. mutans 또는 S. sobrinus가 발견된 경우는 52개중 15걔(28.8%), 우식부위에서는 52개중 34개(65.4%)로 나타나, 비우식부위보다 우식부위에서의 분포도가 2배 이상 높게 나타났는데 (Table 5), 이 결과는 MS의 출현이 치아우식증과 관련이 있다는 일반적인 견해와 일치한다. 앞서 언급한 연구들"刼에 비하면 S.
- 그러나 dexA나 gtfB primer만이 검출된 경우도 각각 1개씩으로 나타났다. 우식부위에서 S. mutans가 발견된 32개의 치태 중 23개(71.9%)가 두 개의 primer 모두에 의해 S. mutans가 검출되었다. 두 primer 중 dexA primer에 의해서만 나타난 것이 2개(6.
- 9%)였다. 우식부위에서 채취한 치태의 경우; S mutans만 검출된 것은 52개 중 24개(46.2%), S. sobrinus만 검출된 것은 2개 (3.8%), 두 세균종이 같이 검출된 것은 8개(15.4%)였다 (Table 6).
- 이들 치아우식증 환자 개개인의 치태 채취부위에 따른 MS의 분포도를 조사했을 때는, S. nautans 또는 S. sobrinus가 비우식부위에서만 발견된 어린이는 3명(5.8%), 우식부위에서만 발견된 어린이는 22명(42.3%), 두 부위 모두에서 발견된 어린이는 12명(23.1%)이었다(Table 4).
- 이상의 결과로 미루어 우리나라 어린이의 경우 치아우식증은 MS와 밀접한 연관성이 있으며, MS 중에서도 S. mutans가 중요하다고 판단된다. 한편 S.
- 채취한 부위와 상관없이 이들 52명의 치아우식증 환자에서 MS의 분포도를 조사했을 때 MS가 발견된 어린이는 52명 중 37명 (71.2%)이었고, 전혀 발견되지 않은 어린이는 15명 (28.8%)이었다 (Table 4).
- 4%)은 dex primer에 의해서만 검출되었다. 한편 우식부위에서 S. sobrinus가 발견된 10개 치태 중에서 dex와 gtfl primer 모두에 의해 S. sobrinusA 검출된 것은 4개(40.0%), dex primer에 의해서만 검출된 것은 5 개(50.0%), gtR primer에 의해 검출된 것은 1개(10.0%)에 불과하였다.
후속연구
- 이들은 연구에 참여한 특정집단이 치아우식증을 쉽게 유발하지 않는 생활을 하고 있는데 반해 , MS는 그 사이에 사람들에서 사람들로 빠르게 전파될 수 있기 때문에 나타난 결과라고 추측하였다. 따라서 앞으로 다양한 모집단에서 MS이외의 mitis 또는 salivarius streptococci 등 다양한 세균"洌에 대한 조사도 아울러 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 33) 이와 같이 MS가 치아우식증과 관련성이 있는지에 대한 논리가 정립되지 않은 것은 종족이나 개인에 따라 나타날 수 있는 음식이나 음식섭취방법 등의 차이 때문에 나타난 현상일 수도 있다. 5 33 35>MS가 치 아우식증에 중요하다고 했을 때 MS 중에서 사람에서 많이 나타나는 것으로 알려진 S. mutans와 S. sobrinus 두 세균종 중 어느 것이 더 치아우식증과 연관성을 갖는지에 대해서도아직까지는 분명하지 않아""us 이에 대한 조사와 연구도 또한 필요하다.
- 않는 것이 단점이다. 그러나 앞으로 real-time PCR">과 같은 방법을 사용하면 정 량이 가능해지기 때문에 MS의 분포도뿐 아니라 치태 내 분포정도도 평가할 수 있을 것으로 보이며, 그러면 앞으로 MS와 치아우식증의 관계도 보다 정확하게 밝힐 수 있을 것으로 기 대 한다.
- sobrinus 분포도보다 다소 낮게 나타났다. 채취한 시료양이 이들 연구보다는 다소 적었기 때문에 세균을 일부 검출하지 못했을 가능성을 배제할 수는 없지만, 종족간의 차이일수도 있어 앞으로 보다 다양한 모집단을 대상으로 보다 많은 양의 시료를 채취하여 연구가 계속 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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