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문제 정의
- 기존 사용하고 있는 합성된 진정 약물의 대체 약물로 천궁의 메탄올 추출물의 가능성을 구명하며, 최근 본 교실에서 발표된바 있는 석창포의 진정 작용과 비교하기 위하여 본 연구를 하였는데 항불안 작용의 효과는 staircase test로, 근이완 효과 유무는 rotarod test를 시 행하였다. 천궁의 메탄올 추출물이 GABA 및 Glycine 수용체에 미치는 영향을 구명하기 위해서는 picro toxin, yohimbine, isoniazid, strychnine을 사용해서 발작 양상을 비교 하였으며 , 생체안전성을 확보하기 위하여 MTT test 를 시행하였고, 일반 행동 변화는 Irwin 등3°의 방법을 사용하였다.
- 또한 Vishwakarma 등犯은 생강(Zin giber officinale)에서, Carvalho-Freitas와 Costa%* 광귤나무(Citrus aurantium)등으로부터 얻은 추출물에 진정작용이 있음을 보고하였다. 따라서 부작용이 적으면서 적절한 진정 효과를 가지는 약물을 개발하는 것은 아주 중요한 과제이며 , 본 연구에서는 고래로 우리 선조들이 사용해와 그 안전성 이 검증되어 있는 천궁 추출물의 진정 작용을 구명 하고자 하였다.
가설 설정
- 3. 근육이완 작용을 탐색하기 위한 rotarod 실험에서는 대조군과 차이를 나타내지 않았다.
제안 방법
- 각 마우스를 rotarod 장치 (직경 3 cm, 속도 8 rpm)에서 1분 이상 위치할 때까지 훈련시켰다. 24시간 후에, 천궁 추출물 (10mg/kg)을 투여하고 1시간 후에 rotarod에서 위치하는 시간을 240초까지 측정하였다.
- 천궁 추출물(10mg/kg)을 경구로 투여하고 1시간 후에 3.5mg/kg picrotoxin을 피하주사하고, 그 후 30분 동안 발작이 나타날 때 까지 걸리는 시간을 측정하였다.
- 천궁 추출물(10mg/kg)을 경구로 투여하고 1시간 후에 45mg/kg yohimbine HC1 을 피하주사하고, 그 후 1시간 동안 발작이 나타날 때 까지 걸리는 시간을 측정하였다.
- 천궁 추출물(10mg/kg)을 경구로 투여하고 1시간 후에 300mg/kg isoniazid를 피하주사하고, 그 후 2시간 동안 발작이 나타날 때까지 걸리는 시간을 측정하였다.
- 천궁 추출물 (10mg/kg) 을 경구로 투여하고 한 시간 후에 2mg/kg stry산mine nitrate를 복강내 주사하고, 그 후 1시간 동안 발작이 나타날 때까지 걸리는 시간을 측정하였다.
- 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bro- mide(MTT: Sigma, USA)는 PBS에 5mg/ml로 녹여 02加 filter로 거른 뒤 -20°C에 보관하였고 필요 시 녹여서 사용하였다. MTT용액 20闯를 가하고 4시간 동안 배양 후 각 well의 배양액을 제거하고 형성된 formazan salt에 dimethylsulfox- ide(Duchefa, Netherland) 100闻를 넣어 가볍게 진탕하여 완전히 용해시킨 후 ELISA(enzyme linked immunosor bent assay) reader (Bio-Rad, USA) 를 이용하여 570nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 실험 방법은 변형된 Irwin 방법을 사용하였고, 천궁 추출물 (10mg/kg)을 투여 전 및 투여 후 15, 30, 60, 120 및 240분에 실험용 관찰 cage를 이용하여 다음과 같은 일반 행동을 관찰하였다.
- 마우스에게 천궁추출물 10mg/kg과 30mg/kg을 각각 경구투여하고 1시간 후에 staircase test를 실시하였다. climbing 수는 10mg/kg 투여 시 대조군에서 14.
- 근육이완 작용은 rotarod 장치를 이용하여 측정하였다. 대조군의 경우 회전봉에서 떨어지는데 240초가 소요된 반면, 천궁추출물 (10mg/kg)을 경구로 투여한 경우에도 회전봉에서 떨어지는데 240초가 소요되었다(Table 5, Fig.
- 두개의 개방경로와 두개의 폐쇄경로를 가진 십자경로의 미로 (plus maze)를 50cm높이에 띄워서 실험동물의 불안을 관찰하는 elevated plus maze 검사법", 과 미리 제작된 staircase 박스를 이용해서 올라간 계단수와 뒷다리로 선 수를 측정해서 실험동물의 불안을 관찰하는 staircase test는彈" 경제적이며, 선택적이고 단순하며, 결과에 대해 신뢰할 수 있는데, 본 연구에서는 staircase test를 실시하였다.
- 따라서 천궁추출물이 근육이완 작용을 유발하는지 시험하는 것은 아주 중요한 사실이다. 근이완 작용의 유무를 평가하는 방법으로 rotarod test가 유용한 데 Dunham과 Miya河는 직경 32mm, 5 rpm 의 속도로 회전하는 나무봉에서 180초 이상 위치하는 지를, Tsuda 등께은 직경 30mm, 8 rpm 의 속도에서 240초 이상 위치할 수 있는지를 기준으로 하는 평가방법을 제시하였다, 그 외 Rudzik 등%>은 가는 꼬인 철사줄에 매달리게 했을 때 5초 이내에 뒷발을 걸칠 수 있는지를 관찰하는 traction test를, Randal严은 경사진 스크린 위에서 미끄러지지 않고 4 시간 이상 유지할 수 있는가를 관찰하는 30° inclined screen test를 사용하여 근이 완 작용의 유무를 평가하는 방법을 발표하였다.
- 천궁의 메탄올 수용액 추출물의 진정 작용을 밝히기 위하여 18-22g 웅성 mouse를 대상으로 staircase test를 시행하였고, 근육이완 효과를 검색하기 위하여 rotarod test를 시행하였다.
- 진정 작용의 기전을 구명하기 위하여 GABA 및 glycine 수용체에 미치는 영향을 평가하기위해 picrotoxin, yohimbine, iso niazid, strychnine 등의 약물을 이용하여 발작 유도에 걸리는 시간을 비교 관찰하였다. 또한 생체에서의 안전성을 검증하기 위하여 MTT test 및 Irwin의 행동시험을 시행하여 다음의 결과를 얻었다.
- 비교 관찰하였다. 또한 생체에서의 안전성을 검증하기 위하여 MTT test 및 Irwin의 행동시험을 시행하여 다음의 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 진정제의 근육이완 효과 유무를 평가하기 위해서 Tsuda 등2®은 rotarod test를, Rudzik 등쩨은 traction test를, Randall**은 30° inclined screen test를 사용하였다. 그리고 GABA(Gamma-Amino-Butyric Acid) 및 Glycine 수용체와 연관된 발작을 연구하기 위해서 Usunoff 등, Dunn과 Fielding321, Costa 등과 Bigler** picrotox in, yohimbine, isoniazid, strychnine을 사용하였다. Mosmann的은 세포독성 검사를 위해 MTT(3-〔4, 5-di- methylthiazol-2-yD -2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide) test를 연구하였으며 Irwin 등的, Dixit와 Varma*), Mukherjee 등은 약물 투여 후 실험동물의 일반행동 변화의 관찰 방법을 발표하였다.
- 실험동물은 18-22g 웅성 ICR(The Institute for Cancer Research) 마우스(한림실험동물원)였으며 시약 strychnine, picrotoxin, isoniazid, yohimbine들은 Tocris사(USA)에서구입하였으며 기타 시약은 Sigma사(USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에 사용된 세포는 SK-N-SH cell (human brain)로서 , 한국 세포주 은행에서 분양 받았다. SK-N-SH cell은 RP- MI medium 1640(GibcoBRL, USA)배지에 10% fetal bovine serum(FBS: Bio-whittaker, USA), lOOyg/ml streptomycin(GibcoBRL, USA), lOOunit/ml penicillin (GibcoBRL, USA)을 넣어서 37t!에서, 5% C6 배양기에서 배양하였다.
- 동물은 ICR 마우스 수컷 (체중 18-22g)을 각 군당 4마리씩 사용하였다. 실험 방법은 변형된 Irwin 방법을 사용하였고, 천궁 추출물 (10mg/kg)을 투여 전 및 투여 후 15, 30, 60, 120 및 240분에 실험용 관찰 cage를 이용하여 다음과 같은 일반 행동을 관찰하였다.
이론/모형
- 진정제의 약효와 효능을 평가하기 위하여 선학들의 많은 연구가 있었는데 , 항불안 효과를 평가하기 위해서 Simiand 등은 staircase test를, Pellow오} Fil/은 Elevated Plus Maze(EPM) test를 사용하였다. 진정제의 근육이완 효과 유무를 평가하기 위해서 Tsuda 등2®은 rotarod test를, Rudzik 등쩨은 traction test를, Randall**은 30° inclined screen test를 사용하였다.
- rotarod test를 시 행하였다. 천궁의 메탄올 추출물이 GABA 및 Glycine 수용체에 미치는 영향을 구명하기 위해서는 picro toxin, yohimbine, isoniazid, strychnine을 사용해서 발작 양상을 비교 하였으며 , 생체안전성을 확보하기 위하여 MTT test 를 시행하였고, 일반 행동 변화는 Irwin 등3°의 방법을 사용하였다.
- Rotarod test로 평가하였다. 각 마우스를 rotarod 장치 (직경 3 cm, 속도 8 rpm)에서 1분 이상 위치할 때까지 훈련시켰다.
- 세포의 생존율은 MTT assay를 통해 관찰하였다. 세포를 96-well microplate에 넣고 8시간동안 starvation 배지로 처리한 후 천궁추출물을 투여하고 20시간동안 배양하였다.
성능/효과
- Rearing 수는 10mg/kg 투여 시 대조군에서 9.7회 , 천궁 투여군에서는 5.6회였고(Table 3, Fig. 3), 30mg/kg 투여 시 대조군에서는 8.2회 천궁 투여군에서는 4회였다(Table 4, Fig. 4. ) 10mg/kg과 30mg/kg 모두에서 천궁 투여군이 통계학적으로 유의성 이 있는 항불안 효과를 나타냈다.
- 대조군의 경우 발작유도 시간이 약 147.7초인 반면, 천궁 추출물(10mg/kg)을 경구로 투여한 경우 strychnine0, ] 의한 발작유도 시간이 약 207.8초까지 연장되었으며 이는 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성이 있는 차이였다(Table 9, Fig. 9).
- MTT test 시행결과 대조군의 흡광도 0.24에 비하여 천궁 추출물 10昭/ml, 30昭/诚, 90應/心을 각각 투여한 경우에도 0.25, 0.25, 0.26 흡광도를 각각 나타냄으로서 , 천궁 추출물은 신경세포에 대하여 독성반응을 거의 유발시키지 않았다(Table 10, Fig. 10).
- 본 연구에서 천궁 추출물은 10mg/kg을 마우스에게 경구투여하였을 때 staircase test에서 climbing수에는 대조군에 비하여 큰 차이를 보이지 않았지만, rearing수에 있어서는 대조군에 비하여 천궁 추출물을 투여한 군에서 현저한 감소가 유발되었다.
- 이 결과는 천궁 추출물은 마우스의 일반 탐험 행동에는 영향을 미치지 않으나, 불안은 현저하게 감소시킴을 증명하고 있다.
- 진정 작용을 유발하는 용량의 천궁 추출물을 마우스에 투여한 후 rotarod test를 통하여 근육이완 효과의 유무를 시험한 결과, 천궁 추출물 투여로 인하여 근육이완 효과가 유도되지 않음이 관찰되었다. 이 결과는 천궁 추출물은 benzodiazepine 계통의 진정제에 비하여 아주 선택적으로 진정 효과를 유발함을 제시하고 있다.
- 본 연구의 결과를 분석해 보면 천궁 추출물을 진정 효과를 유발하는 용량으로 마우스에 투여한 경우, picrotoxin, yohim bine 및 isoniazid로 인한 발작 유도시간이 대조군과 유의성 있는 차이를 보이지 않고 있다. 이 결과는 천궁 추출물의 진정 효과 유도는 GABA 수용체를 통해서 나타나는 것이 아니며, 또한 GABA의 합성과는 무관하다는 사실을 시사하는 것으로 생각된다.
- 차이를 보이지 않고 있다. 이 결과는 천궁 추출물의 진정 효과 유도는 GABA 수용체를 통해서 나타나는 것이 아니며, 또한 GABA의 합성과는 무관하다는 사실을 시사하는 것으로 생각된다.
- 이는 약리 작용에 있어서도 서로 다른 작용을 나타낼 수 있음을 제시하고 있다. 실제 본 실험의 연구결과 천궁추출물은 GABA 수용체에는 결합하는 양상을 보이지 않은 반면, glycine 수용체를 통한 효과가 현저히 발현됨을 관찰하였다. 이는 천궁의 성분중 물에 용해되는 많은 수용성 성분들에 의하여 GABA 수용체가 아닌 glycine 수용체를 통해서 진정 작용이 나타남을 제시하고 있다.
- 본 연구의 결과 천궁 추출물은 GABA 수용체와는 관련성이 없고, Glycine수용체와 작용함을 보여주고 있다. 현재 화학 적합성을 통해 만들어진 진정제들인 benzodiazepam계, barbiturate 계, chloral hydrate 계 약물들은 모두 GABA 수용체에 작용하여 진정 효과를 유발하며 , 항히스타민제이면서 진정제로 이용되는 약물은 항히스타민 효과에 부수해서 나타나는 부작용으로서 졸리움을 진정 효과로 이용하는 경우이다.
- 1. Climbing 수는 천궁 주출물 10mg/kg과 30mg/kg 용량으로 경구 투여했을 때 각각에서대조군과 차이가 없었다.
- 2. Rearing 수에서는 천궁추출물 10mg/kg의 용량으로 경구투여했을 때 대조군에 비해서 42%의 감소를 보였으며, 30mg/kg 에서는 51%의 감소를 보였다.
- 4. 천궁 주줄물의 투여는 picrotoxin, isoniazid, yohimbine에의한 발작에서는 큰 변화를 유발하지 않았으나, strychnine 에 의한 발작 유도시간은 41%의 증가를 유발하였다.
- 5. 신경세포에 적용했을 때 특이한 독성 반응을 나타내지 않았으며, 일반 행동에서도 특이한 변화를 유발하지 않았다.
- 요약하면, 천궁의 메탄올 수용액 추출물은 현저한 진정 작용을 유발하며, 그 작용 기전으로서 glycine의 작용을 증가시켜 chloride ion의 세포내 유입으로 인한 억제성 신경전도를 유도한다고 사료된다. 또한 근육이 완 작용도 나타나지 않았으며, 특이한 생체독성도 유발되지 않은 것으로 보아, 향후 치과 임상에서 진정 요법의 한 수단으로서 사용될 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.
후속연구
- 이는 천궁의 성분중 물에 용해되는 많은 수용성 성분들에 의하여 GABA 수용체가 아닌 glycine 수용체를 통해서 진정 작용이 나타남을 제시하고 있다. 향후 천궁의 메탄올 수용액 추출물에 대한 성분의 분리와 구조의 구명이 이루어진다면 어떤 성분에 의하여 진정 효과가 유발되는지 밝혀질 수 있으리라 사료된다.
- 본 연구에서 천궁의 70% 메탄올 추출물이 진정 작용을 유발한 결과는 향후 천궁의 성분 중 진정 효과를 일으키는 성분을 분리하여 단일 성분으로 구성된 새로운 진정제를 개발하는데 중요한 기초가 되리라 사료된다. 현시점에서 생각할 수 있는 가능성 있는 진정 유발 성분으로는, 물과 메탄올에 잘 용해하는 물질들이다.
- 현재 알려진 천궁의 성분은 phthalides, alkaloids 및 acid 등인데皿⑲ 이들 중 물과 메탄올에 잘 용해하는 alka loids 와 acid 등이 진정 효과와 관련이 있으리라 추측된다. 하지만 이들 성분 중 어떤 성분이 진정 효과를 유발시키는지는 다양한 분리 기술을 이용한 장기간의 연구를 통한 단일 성분의 분리가 이루어져야 할 것이다.
- 약물의 작용 측면에서 또 고려해야 할 사항은 반드시 단일 성분이 진정 효과의 유발에 관련이 있다고 단정 할 수 없으며 , 오히려 본 연구에서와 같이 여러 성분이 혼합된 상태로 각각의 성분이 서로 복합적으로 작용함으로써 원하는 진정 작용이 유도되었을 가능성도 있다고 사료된다. 따라서 임상적용의 측면에서는 오히려 단일성분으로 구성된 약물체제보다는 여러 성분이 복합적으로 함유된 천연물 추출물의 유용성이 더 우수할 수 있다.
- 요약하면, 천궁 추출물은 기존의 화학적 진정제와는 그 작용기전이 확연히 상이하며 , 또한 석창포의 작용과 비교할 때도 근육이 완 작용이 존재하지 않으므로, 아주 특이적 인 진정 작용 기전을 가진다고 사료되므로 추가적인 연구와 임상실험 등이 필요할 것으로 생각된다.
- 사료된다. 또한 근육이 완 작용도 나타나지 않았으며, 특이한 생체독성도 유발되지 않은 것으로 보아, 향후 치과 임상에서 진정 요법의 한 수단으로서 사용될 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.
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