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문제 정의
- 이들 ACE저해제들은 대부분이 열에 안정하며, 체 내에 흡수가 용이한 비교적 저분자 물질로 그 저해능력은 혈 압 강하제와 비교하였을 때 비교적 낮은 활성을 나타내지만 대 량으로 항상 섭취하는 식품 중에 존재한다는 점에서 그 유용 성이 기대된다고 하였다. 이에 본 실험에서는 천연물에 존재하는 항균 및 항곰팡이, 항고혈압, 항암 활성에 탁월한 효과를 나타내는 물질을 탐색하기 위해 32종의 생약재를 식품에 사용 가능한 용매인 물과 에탄올로 추출하여 항균, 항고혈압, 항암 활 성을 탐색하였다.
- 이는 경제적으로 큰 손실이 아닐 수 없다. 이에 본 연구에서는 32종의 생약재를 이용하여 항곰팡이 활성을 탐색하였다.
제안 방법
- 본 실험에 사용한 32종의 생약재는 세절 및 분쇄한 후 중량 의 10배량의 증류수와 70% 에탄올을 첨가하여 환류냉각기가 장착된 추출기로 비등점에서 2시간 동안 추출하였다. 물 추출물은 Whatman No.
- 항균 활성 검색에 사용한 균주는 3TC에서 18-24시간 동안 전 배양하여 실험에 사용하였고, 항곰팡이 활성검색에 사용한 균주는 30K에서 72시간 동안 전 배양하여 실험에 사용하였다. 항균 및 항곰팡이 활성 실험 평판배지의 조제는 각각의 생육 배지를 멸균하여 기층용 배지(agar 1.5%)를 제조하였고, 제조한 기층용 배지에 균주를 혼합한 중층용 배지 (agar 0.75%)를 부어 굳혀 제조하였다. 위의 평판배지에 paper disc((f>8 mm, Advantec, Toyo Roshi Co.
- 75%)를 부어 굳혀 제조하였다. 위의 평판배지에 paper disc((f>8 mm, Advantec, Toyo Roshi Co., Tokyo, Japan)를 올려 밀착시킨 후 10% 농도 의 생약재 추출물을 20 gL 첨가하여, 3TC와 3(TC의 incubator에 18-24시간, 48-72시간 동안 각각 배양한 후 paper disc agar diffusion법에 따라 항균 및 항곰팡이 활성을 clear zone 직경 (mm)으로 측정하였다.
- ACE저해활성은 Cushman(lO)의 방법을 응용하여 측정하였다. ACE저해 활성은 1% 시료용액 50pL에 0.
- 32종 생약재의 cytotoxicity 측정은 Goun와 Powell(llt12)5j 실험 결과 및 한국생명공학연구원의, 암 질환용 식품의약 개발에 관한 연구' 보고서 등을 바탕으로 정향, 작약, 지유, 호장근, 감 초, 강황의 6가지 생약재를 선정하였다. 시료제조는 생약재추 출물에 에탄올을 첨가하여 침전시켜 제조하였다.
- MIT assay는 인간에서 유래하는 2가지 종류의 암세포에 대한 cytotoxicity를 Carmichael(13)의 colorimetric MTT assay방법을 응용하여 측정하였다. 즉, SNU-1과 HeLa의 세포를 RPMI- 1640(Sigma) 배지에서 72시간 배양하여 SNU-1 세포는 1X10* cell/well 이 되게 농도를 조정하고, HeLa세포는 1X103 cell/weU로 각각 조정하여 실험하였다.
- MIT assay는 인간에서 유래하는 2가지 종류의 암세포에 대한 cytotoxicity를 Carmichael(13)의 colorimetric MTT assay방법을 응용하여 측정하였다. 즉, SNU-1과 HeLa의 세포를 RPMI- 1640(Sigma) 배지에서 72시간 배양하여 SNU-1 세포는 1X10* cell/well 이 되게 농도를 조정하고, HeLa세포는 1X103 cell/weU로 각각 조정하여 실험하였다. 위 농도의 cell들을 96 well plate에 130|lL씩 분주하고 1mg/mL 농도의 시료를 20 gL 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양하였다.
- 위 농도의 cell들을 96 well plate에 130|lL씩 분주하고 1mg/mL 농도의 시료를 20 gL 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양하였다. 이에 MTT 용액 10rL를 첨가하여 SNU-1 세포는 4시간동안 HeLa세포는 5 시간동안 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 발색시킨 후 PBS buffer 50μL와 20% SDS용액을 50μL씩 분주하여 20h동안 incubation 시킨 후, dimethyl sulfbxide(DMSO)를 사용하여 세포를 완전히 풀어준 뒤 ELISA microplate reader(Emax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540nm에서 확인하였다.
- 시료를 6% 농도로 제조하여 0.2 μ이의 syringe filter로 여과한 후 Sephacryl S-300(Phamacia, Uppsala, Sweden)컬럼에 loading 하여 분획하였다. 용출용매로는 증류수를 사용하였으며, 용출 속도는 L8mL/min으로 분획하였다.
- 32종의 생약재 추출물을 이용하여 6종의 미생물에 대한 항균 활성을 검색하였다. 그 결과 가자 물 추출물과 에탄올 추출물이 Gram 음성 균과 Gram 양성 균에 대해 높은 항균활성을 나타냈 으며, 복분자와 지유 추출물은 L plantarum%: 제외한 5 균종에 대해 좋은 항균활성을 나타내었다.
- 생약재를 농도별로 제조하여 5가지 균종에 대해 항곰팡이 활 성을 측정하였다. 32종 생약재의 추출물을 농도별로 제조하여 항곰팡이 활성을 실험한 결과 황련 물 추출물을 250eig 첨가 하였을때 M.
- 이에 본 실험에서는 32종의 생약재 물 추출물 을 동결 건조한 시료를 10mg/mL의 농도에서 ACE 저해작용 측정한 결과, 파고지가 항고혈압 활성이 가장 좋았고, 그 다음 으로 소목과 죽엽이 높은 항고혈압 활성을 나타내었으며, 그 외에는 30%이하의 ACE저해율을 나타내었다. 다른 생약재와 비교해 볼 때 가장 항고혈압 활성이 높은 파고지를 선정하여 칼럼으로 분획하고 분획물의 ACE저해 활성을 분석하였다.
- 작약, 지유, 호장근, 정향, 감초, 강황의 생약재를 waterextracts, 70% ethanol extracts, ethanol precipitate, ethanol supernatant으로 제조 및 분획한 후, 4가지의 시료를 1 mg/mL의 농도로 제조하여 SNU-1 cells 에 대해 cytotoxicity를 실시하였다. 그 결과 대체적으로 water extracts, ethanol precipitate에서 cytotoxicity활성이 좋게 나타났다.
- 작약, 지유, 호장근, 정향, 감초, 강황의 생약재를 water extracts, 70% ethanol extracts, ethanol precipitate, ethanol supernatant으로 제조 및 분획한 후, 4가지의 시료를 1 mg/mL의 농도로 제조하여 HeLa cells에 대해 세포독성을 조사하였다. 그 결과, 대체적으로 water extracts, ethanol precipitate에서 cytotox-icity활성이 좋게 나타났다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 32종의 생약재는 항균활성 실험 결과를(9) 참고하여 190여종의 생약재에서 선정하였으며, 실험재료로 사용한 생약재는 금산약초시장에서 건조된 상태로 구입하여 사용하였다 (Table 1).
- 항균 및 항곰팡이 활성실험에 사용한 균주는 Escherichia coliKCTC 1682, Bacillus subtilis ATCC 14593, Staphylococcus aureus ATCC 12692, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15522, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Lactobacillus plantarum ATCC 14917 균주와 Aspergillus niger ATCC 62751, Aspergillus oryzae ATCC 16507, Trichoderma reesei ATCC 26921, Penicillium rugullosum IFO 4683, Mucor miehei KFRI 01011 균주로서 KFRI(한국식품개발연구원)에서 분양받아 사용하였다. 각각의 균주들은 BHI, tryptic soy, malt extract 및 potato dextrose(Difco, Detroit, MI, US A) 의 각 배지에 전배양하여 실험에 사용하였다.
- 항균 및 항곰팡이 활성실험에 사용한 균주는 Escherichia coliKCTC 1682, Bacillus subtilis ATCC 14593, Staphylococcus aureus ATCC 12692, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15522, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Lactobacillus plantarum ATCC 14917 균주와 Aspergillus niger ATCC 62751, Aspergillus oryzae ATCC 16507, Trichoderma reesei ATCC 26921, Penicillium rugullosum IFO 4683, Mucor miehei KFRI 01011 균주로서 KFRI(한국식품개발연구원)에서 분양받아 사용하였다. 각각의 균주들은 BHI, tryptic soy, malt extract 및 potato dextrose(Difco, Detroit, MI, US A) 의 각 배지에 전배양하여 실험에 사용하였다.
- 항균 활성 검색에 사용한 균주는 3TC에서 18-24시간 동안 전 배양하여 실험에 사용하였고, 항곰팡이 활성검색에 사용한 균주는 30K에서 72시간 동안 전 배양하여 실험에 사용하였다. 항균 및 항곰팡이 활성 실험 평판배지의 조제는 각각의 생육 배지를 멸균하여 기층용 배지(agar 1.
- 32종 생약재의 cytotoxicity 측정은 Goun와 Powell(llt12)5j 실험 결과 및 한국생명공학연구원의, 암 질환용 식품의약 개발에 관한 연구' 보고서 등을 바탕으로 정향, 작약, 지유, 호장근, 감 초, 강황의 6가지 생약재를 선정하였다. 시료제조는 생약재추 출물에 에탄올을 첨가하여 침전시켜 제조하였다.
- 실험에 사용한 세포는 SNU-1(KCLB, 0003)과 HeLa(KCLB, 10002)로서 KCLB(한국세포주은행)로부터 분양 받아 사용하였다. 사용한 배지는 56℃ water bath에서 30min동안 inactivation 처리한 FBS 10%(Wv)와 항생제(1% penicillin-streptomycin) l%(v/v), sodium bicarbonate 0.
- 실험에 사용한 세포는 SNU-1(KCLB, 0003)과 HeLa(KCLB, 10002)로서 KCLB(한국세포주은행)로부터 분양 받아 사용하였다. 사용한 배지는 56℃ water bath에서 30min동안 inactivation 처리한 FBS 10%(Wv)와 항생제(1% penicillin-streptomycin) l%(v/v), sodium bicarbonate 0.2%(w/v), HEPES 0.475%(w/v), L-glutamine 0.03%(w/v)을 첨가하여 RPMI-1640배지(Sigma, St. Louis, MO, USA) 1 L를 제조하여 사용하였다. 세포배양은 37℃, 5% CO2 incuvator에서 T-75 culture flask(BD Biosciences, Bedford, USA)에 배양하였다.
이론/모형
- 이에 본 실험에서는 32종의 생약재를 대해 SNU-1 cells와 HeLa cells의 cytotoxicity# MTT assay방법에 준하여 실시하였다. MTT assay방법은 살아있는 세포의 mitochondria dehydro- genase에 의해 청색 fbimazan으로 변환되는 원리를 이용한 것 이며, 살아있는 세포의 증식이나 독성검사에 활용하는 방법으로서 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma USA)시약을 PBS buf*에 5mg/m# 농도로 제조하여 Caimichael 등(24)의 방법에 의해 색소의 강도를 ELISA reader로 측정하는 방법이다.
성능/효과
- 생약재의 추출수율은 Table 1과 같다. 물 추출물의 경우 브 릭스가 5.0 이상인 생약재는 가자, 갈근, 맥문동, 산수유 둥으 로 4종 이었고, 3.045에 달하는 생약재는 구기자, 당귀, 오미 자, 오수유, 진피 등 5종으로 나타났으며, 20-3.0브릭스인 생으# 재는 감초, 복분자, 애엽, 작약, 파고지, 황련, 황기 등 7종으로 나타났고, 그 외의 생약재는 2.0 브릭스 미만의 적은 수율을 나타내었다. 70% 에탄올 추출물의 경우에는 가자, 정향, 당귀가 5.
- 0 브릭스 미만의 적은 수율을 나타내었다. 70% 에탄올 추출물의 경우에는 가자, 정향, 당귀가 5.4, 4.4, 4.0 브릭스로 수율이 매우 높았으며, 그 다음으로 수 율이 높은 생약재는 진피, 맥문동, 산수유, 호장근, 오미자, 오 수유, 구기자, 천궁, 감초, 강황, 지유, 파고지, 황기, 갈근이 2.1-3.7브릭스로 70% 에탄올 추출수율이 높았다. 그 외에는 2브릭 스 미만으로 추출 수율이 매우 낮은 것으로 나타났다(Table 1).
- 그 외에는 2브릭 스 미만으로 추출 수율이 매우 낮은 것으로 나타났다(Table 1). 본 실험의 결과에서 물과 70% 에탄올에서 추출수율이 가장 높은 생약재는 가자로 나타났으며, 정향은 물 추출물에서는 수 율이 낮았으나, 70%에탄올에서는 수율이 매우 높은 것으로 나타났다. 이는 정향 중에 정유성분이 풍부하기 때문인 것으로 사료된다.
- 32종의 생약재 추출물을 이용하여 6종의 미생물에 대한 항균 활성을 검색하였다. 그 결과 가자 물 추출물과 에탄올 추출물이 Gram 음성 균과 Gram 양성 균에 대해 높은 항균활성을 나타냈 으며, 복분자와 지유 추출물은 L plantarum%: 제외한 5 균종에 대해 좋은 항균활성을 나타내었다. 이외에도 소목과 황련의 추출물이 E.
- 그 결과 가자 물 추출물과 에탄올 추출물이 Gram 음성 균과 Gram 양성 균에 대해 높은 항균활성을 나타냈 으며, 복분자와 지유 추출물은 L plantarum%: 제외한 5 균종에 대해 좋은 항균활성을 나타내었다. 이외에도 소목과 황련의 추출물이 E. coli를 제외한 B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, S. typhimurium, L #arum의 균에 대해 좋은 항균활성을 나타내 었으며, 정향 추출물은 E. a#종에 대해서는 약한 항균활성을 보인 반면 B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, S. typhimurium의 균종에 대해서는 좋은 항균활성을 나타내었다. 대체적으로생약재 물 추출물의 경우 P.
- typhimurium의 균종에 대해서는 좋은 항균활성을 나타내었다. 대체적으로생약재 물 추출물의 경우 P. aeruginosa, S. typhimurium균주의 Gram 음성 균에 대해 항균활성이 좋았고, B. subtilis, S. aureus 균주의 Gram 양성 균에 대해 좋은 항균활성을 나타내었다. 그 에 반해 E.
- #의 Gram 음성 균과 Gram 양성 균인 L pkm-Ssn균주에 대해서는 항균활성이 낮은 것으로 나타났다. 생으# 재 에탄올 추출물의 항균활성 결과는 물 추출물의 항균활성결 과에 비해 월등히 좋은 활성을 나타내었다. 이는 20여종의 생약 재를 물과 에탄올을 사용하여 추출하고 항균활성을 실험한 결과 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 2-10배 높은 항균활성을 나타낸 Park 등(19)의 연구결과와 일치한다.
- 이는 20여종의 생약 재를 물과 에탄올을 사용하여 추출하고 항균활성을 실험한 결과 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 2-10배 높은 항균활성을 나타낸 Park 등(19)의 연구결과와 일치한다. 특히 가자, 복분자, 정향, 지유, 소목, 강황, 황련 등의 13가지 생약재 추출물에서 높은 항균활성을 나타내었다. 가자 에탄올 추출물의 경우 물 추출 물의 결과와 같이 E.
- aureus,S. typhimurium, L plantarume] 6가지 균주에 대해 좋은 항균활 성올 나타냈으며, 복분자, 작약, 정향, 지유의 추출물은 L plan- tamrne 제외한 5가지 균종에 대해 높은 항균 활성을 나타내었다. 또한 소목 추출물의 경우에는 E.
- typhimurium, L plantarume] 6가지 균주에 대해 좋은 항균활 성올 나타냈으며, 복분자, 작약, 정향, 지유의 추출물은 L plan- tamrne 제외한 5가지 균종에 대해 높은 항균 활성을 나타내었다. 또한 소목 추출물의 경우에는 E. coli 균주를 제외한 B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, S. typhimurium, L pkmtarum균종에서 높은 항균 활성을 보였으며, 이외에 강황, 파고지, 석 곡, 오미자, 육두구, 호장근 추출물에서 비교적 좋은 항균활성을 나타내었다. 에탄올 주줄물에서도 E.
- typhimurium, L pkmtarum균종에서 높은 항균 활성을 보였으며, 이외에 강황, 파고지, 석 곡, 오미자, 육두구, 호장근 추출물에서 비교적 좋은 항균활성을 나타내었다. 에탄올 주줄물에서도 E. coli, L plantarum 균주에 대해서는 좋지 않은 항균력을 보였으며, 물 추출물의 경우와 같이 에탄올 추출물도 Gram 음성 균인 P. aeruginosa, S. typhimu- , #에 대해 좋은 항균활성을 나타냈으며, B. subtilis, S. aureus의 Gram 양성 균에서도 좋은 항균활성을 나타내었다. 또한 E.
- aureus의 Gram 양성 균에서도 좋은 항균활성을 나타내었다. 또한 E. coli균과 L. plantarum 균주에 대해서는 좋지 못한 항균활성을 나타내었다. 이는 항균력에 있어서 향신료나 생약재의 종류에 따라 다르며, 한 가지 생약재의 그 추출물도 일정 항균효과를 보이는 것이 아니라 미생물의 균종에 따라 그 민감도가 달라진다 고 보고한 결과와 같다(14).
- 이러한 실험결과는 Lee 등(21)과 Chung(22), Hong(23)의 연구에서도 동일한 결과를 찾아볼 수 있었다. 본 연구에서는 생약재의 물 추출물에 비해 에탄올추출물에서 많은 종류가 항균활성을 나타내었지만, 가장 좋은 항균활성을 나타낸 가자의 경우 항균활성 실험결과 큰 차이는 없었다. 이는 추출공정에서 보다 쉽고 빠르게 추출할 수 있다는 장점을 갖고 있으며, 그 효율도 뛰어나 산업화 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 생약재를 농도별로 제조하여 5가지 균종에 대해 항곰팡이 활 성을 측정하였다. 32종 생약재의 추출물을 농도별로 제조하여 항곰팡이 활성을 실험한 결과 황련 물 추출물을 250eig 첨가 하였을때 M. miehei 균주에 대해서 9 mm의 clear zone을 나타내었다. 또한 계피 에탄올 추출물은 500이하의 첨가량에서는 활성이 나타나지 않았으며, 파고지 에탄올 추출물이 125 pg의 가장 적은 양으로 항곰팡이 활성을 나타내었다.
- miehei 균주에 대해서 9 mm의 clear zone을 나타내었다. 또한 계피 에탄올 추출물은 500이하의 첨가량에서는 활성이 나타나지 않았으며, 파고지 에탄올 추출물이 125 pg의 가장 적은 양으로 항곰팡이 활성을 나타내었다.
- reeseie 5가지 균종에 대해서 각각 24, 20, 29, 18, 24mm의 clear zone 수치의 항곰 팡이 활성을 나타내었다. 이 외에 파고지 추출물은 A niger, M. miehei, P. rwgwWoss/n균종에 대해 각각 14, 29, 13 mm의 clear zone을 나타냈으며, 감초 주줄물에서는 A. niger 균주에 대해 항곰팡이 활성올 나타내었고, 육두구, 호장근 및 황련 추출물 에서는 M. miehei 균주에 대해 항곰팡이 활성을 나타내었다. 또한 초두구 추출물에서는 T.
- miehei 균주에 대해 항곰팡이 활성을 나타내었다. 또한 초두구 추출물에서는 T. reesei 균주에 대해 좋은 항곰팡 이 활성을 나타내었다.
- 생약재를 농도별로 제조하여 5가지 균종에 대해 항곰팡이 활 성을 측정하였다. 32종 생약재의 추출물을 농도별로 제조하여 항곰팡이 활성을 실험한 결과 황련 물 추출물을 25이# 첨가 하였을 때 M. miehei 균주에 대해서 9 mm의 clear zone올 나타내었다. 또한 계피 에탄올 추출물은 500gg 이하의 첨가량에서는 활성이 나타나지 않았으며, 파고지 에탄올 추출물이 125 jig의 가장 적은 양으로 항곰팡이 활성을 나타내었다.
- miehei 균주에 대해서 9 mm의 clear zone올 나타내었다. 또한 계피 에탄올 추출물은 500gg 이하의 첨가량에서는 활성이 나타나지 않았으며, 파고지 에탄올 추출물이 125 jig의 가장 적은 양으로 항곰팡이 활성을 나타내었다.
- 이러한 ACE의 저해인자 로서는 저분자 peptide들과 그 유도체들, 차(#)에 존재하는 catechin과 메밀의 rutin같은 polyphen이 성분들이 대표적으로 알려져 있다(16). 이에 본 실험에서는 32종의 생약재 물 추출물 을 동결 건조한 시료를 10mg/mL의 농도에서 ACE 저해작용 측정한 결과, 파고지가 항고혈압 활성이 가장 좋았고, 그 다음 으로 소목과 죽엽이 높은 항고혈압 활성을 나타내었으며, 그 외에는 30%이하의 ACE저해율을 나타내었다. 다른 생약재와 비교해 볼 때 가장 항고혈압 활성이 높은 파고지를 선정하여 칼럼으로 분획하고 분획물의 ACE저해 활성을 분석하였다.
- 선택한 파고지 생약재를 Sephacryl S-300 HR cohinm으로 분 획한 결과 3개의 fraction을 얻을 수 있었다. 이 3개의 분획물 을 5, 2.5, 1.25, 0.625 mg/mL의 농도로 제조하여 ACE저해 활 성을 실험한 결과 Fr 1의 5 mg/mL 농도에서 81.80%로 가장 좋은 ACE저해 활성을 보였으며, Fr 2.에서 Fr 3.으로 갈수록 ACE저해 활성이 낮아졌다. 이는 파고지 물 추출물에서는 저분 자물질 보다 고분자물질에서 ACE저해 활성이 높다는 것을 알 수 있었다.
- 작약, 지유, 호장근, 정향, 감초, 강황의 생약재를 waterextracts, 70% ethanol extracts, ethanol precipitate, ethanol supernatant으로 제조 및 분획한 후, 4가지의 시료를 1 mg/mL의 농도로 제조하여 SNU-1 cells 에 대해 cytotoxicity를 실시하였다. 그 결과 대체적으로 water extracts, ethanol precipitate에서 cytotoxicity활성이 좋게 나타났다. 또한 SNU-1 cells에 대해서 정 향(Eugenia a/vmaticum)의 water extract가 1 mg/mL의 농도에서 43.
- 그 결과 대체적으로 water extracts, ethanol precipitate에서 cytotoxicity활성이 좋게 나타났다. 또한 SNU-1 cells에 대해서 정 향(Eugenia a/vmaticum)의 water extract가 1 mg/mL의 농도에서 43.58%로 좋은 세포독성을 나타내었고, 호장근(Polygonum aviculare)^] ethanol precipitatee 분획물에서는 44.53%의 세포 독성올 나타내었다(Fig. 4).
- 작약, 지유, 호장근, 정향, 감초, 강황의 생약재를 water extracts, 70% ethanol extracts, ethanol precipitate, ethanol supernatant으로 제조 및 분획한 후, 4가지의 시료를 1 mg/mL의 농도로 제조하여 HeLa cells에 대해 세포독성을 조사하였다. 그 결과, 대체적으로 water extracts, ethanol precipitate에서 cytotox-icity활성이 좋게 나타났다.
- 또한 HeLa cells에 대해서 정향의 ethanol precipitate분획물의 1 mg/mL 농도에서 69.60%의 좋은 세포독성올 나타내었고, 지유의 ethanol precipitate분획물의 1 mg/mL 농도에서도 55.03%의 세포독성을 나타냈었다. 또한 호장근의 water extract에서는 52.
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