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제안 방법
- Escherichia coZi(ATCC 25922)와 Staphylococcus amus(KCCM 12103)를 시험균주로 선정하여 접종하였으며, 그 외의 시료들은 자체내의 자연균총을 분석하였다.
- 황색포도상구균의 경우도 식품공전에 수록된 방법에 준하여 10% NaCl을 첨가한 tiyptic soy broth(TSB, Difco, Detroit, MI, USA)에 증균한 후 만니톨 식염한천배지로 분리한 다음 nutrient agar(NA, Difco, Detroit, MI, USA)에서배양하고 생성된 집락에 그람 염색을 실시하였다. 그람 염색결과 그람양성구균에 대하여 혈청 응집반응을 실시함으로써 황색 포도상구균을 확인하였다.
- 배양액을 film 사이에 접종한 후 35℃에서 배양하여 24시간 후에 적 자색으로 염색되어 나타나는 콜로니가 황색포도상구균이다. 그러나 황색포도상구균의 경우 때때로 적자색 이외의 검정색이 나 녹색 계열의 균체가 나오거나 식품입자 등의 불순물로 인하여 적자색 균체의 확인이 어려운 경우가 있어, 2차 확정용 디스크를 24시간 후에 삽입하여 동일한 온도에서 1-3시간의 추 가 배양을 하여 분홍색으로 나타나는 pink zone이 관찰되는 균 체를 황색포도상구균으로 계수하였다.
- , Redmond, USA)를 사용하여 작성하고 이로부터 얻은 상관계수(r), 기울기(slope),절편(intercept)으로부터 실험군 간의 상 관관계를 분석하였다. 기울기 값이 1에 근접하는 정도와 절편 값이 0에서 벗어나는 정도를 분석하였다. P-value는 t-test를 통해 두 실험군 간의 유의성 확인을 위하여 산출하였다.
- 확산 집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천 배지 3-5mL를 가하여 중첩시켰다. 냉각 응고시킨 petri dish 를 거꾸로 하여 35℃에서 244&시간 동안 배양한 후 1 평판당 30-300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계수하였다. 대장균군은 수 단계의 연속한 동일희석도의 검체를 유당부 이온 발효관에 접종하여 대장균군의 존재 여부를 시험하고 그 결과로부터 확률론적인 대장균군의 수치를 산출하여 이것을 최확수로 표시하는 방법인 최확수법을 이용하였다.
- 효모 및 곰팡이의 측정방법은 총 세균수 측정방법에 준하여 시험하였다. 단, 배지는 멸균된 10% 주석산을 무균적으로 가하여 pH를 3.5로 조정한 potato dextrose agar(PDA, Ditto, Detroit,MI, USA)를 사용하여 25℃에서 5-7일간 배양한 후 발생한 집락수를 계산하였다. 황색포도상구균의 경우도 식품공전에 수록된 방법에 준하여 10% NaCl을 첨가한 tiyptic soy broth(TSB, Difco, Detroit, MI, USA)에 증균한 후 만니톨 식염한천배지로 분리한 다음 nutrient agar(NA, Difco, Detroit, MI, USA)에서배양하고 생성된 집락에 그람 염색을 실시하였다.
- 대장균군과 대장균, 황색포도상구균의 정량분석은 일반세균과 효모, 곰팡이의 정량분석과 동일한 방법으로 액상 부위를 수집한 후 각 시료에 102, 103, 104, 105, 106, 107 CFU/mL가 되도록 대장균(대장균군과 대장균의 정량분석)과 황색포도상구균(황색포도상구균의정량분석)을 접종한 후 1일간 37℃ 에서 저장한 다음 시료를 채취하여 건조필름 제조사의 실험방법에 의한 건조필름법과 기존의 식품공전상의 전통적인 미생물 시험법을 실시하여 분석하였다. 단, 햄을 사용하여 효모를 정량할 경우에는 햄 중량의 9배가 되는 멸균 증류수를 stomacher plastic bag에 넣고 stomacher를 사용하여 120초간 균질화하고 액상 부위에 102, 103, 104, 105, 106, 107 CFU/mL가 되도록 효모를 접종한 후 3일간 2NC에서 저장한 다음 시료를 채취하여 분석하였다.
- 대장균군과 대장균, 황색포도상구균 분석의 경우 식품 시료에 각각의 균을 접종하여 사용하였다. 대장균군과 대장균, 황색포도상구균의 정량분석은 일반세균과 효모, 곰팡이의 정량분석과 동일한 방법으로 액상 부위를 수집한 후 각 시료에 102, 103, 104, 105, 106, 107 CFU/mL가 되도록 대장균(대장균군과 대장균의 정량분석)과 황색포도상구균(황색포도상구균의정량분석)을 접종한 후 1일간 37℃ 에서 저장한 다음 시료를 채취하여 건조필름 제조사의 실험방법에 의한 건조필름법과 기존의 식품공전상의 전통적인 미생물 시험법을 실시하여 분석하였다. 단, 햄을 사용하여 효모를 정량할 경우에는 햄 중량의 9배가 되는 멸균 증류수를 stomacher plastic bag에 넣고 stomacher를 사용하여 120초간 균질화하고 액상 부위에 102, 103, 104, 105, 106, 107 CFU/mL가 되도록 효모를 접종한 후 3일간 2NC에서 저장한 다음 시료를 채취하여 분석하였다.
- 현재 산업적인 측면에서 빠르고 정확한 실험결과를 얻어야 하는 경우가 많아짐에 따라 건조필름 배지의 수요증가가 예상되므로, 이에 대비하여 기존의 전통적인 미생물시험법과 건조필름법 간의 비교 및 타당성 연구가 선행되어야 할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 햄, 우유, 아이스크림 등 축산식품과 어묵, 게맛살 둥 수산식품을 대상으로 일반세균, 대장균군(coliform), 대장균(Escherichia coll), 효모(yeast), 곰팡-이 (mold), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)둥 식품 안전성 평가의 지표가 되는 미생물의 정량시험을 전통적인 미생물 시험법과 건조필름법을 이용하여 실시하고 두 방법간의 상관관계를 비교 분석하였다.
- 일반세균수의 측정을 위해 사용한 PAC는 2장의 film으 로 구성되어 하부 film에는 수용성 겔과 탈수된 영양성분으로 덮여 있고 상부 Him에는 겔화 물질과 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)로 덮여있다. 배양액을 film 사이에 접종하고 32℃에서 24-48시간 동안 배양한 후 생성된 적색 콜로니를 일반세균으로 계수하였다. 대장균군 수의 측정을 위해 사용한 PCC는 2개의 film 사이에 violet red bile agar(VRBA, Difco, Detroit, MI, USA) 배지가 탈수되어 있으며 대장균군은 배지에 첨가되어 있는triphenyltetrazolium을 환원시킴으로써 적색 콜로니를 형성하고 lactose를 발효시켜 가스를 생성한다.
- 이 가스는 film에 포집되어 콜로니 주위에 하나 또는 하나 이상의 작은 가스방 울을 형성한다. 배양액을 film 사이에 접종한 후 3VC에서 배 양하여 24시간 후에 가스방울이 붙어 있는 적색 콜로니를 계수하였다. 대장균 수의 측정을 위해 사용한 PEC에는 5-bromo4-chloro-3-indolyl-p-D-glucuronide (BCIG)가 첨가되어 있어 대장 균은 P-glucuronidaseel 의해 BCIG가 분해됨으로써 가스방울이 붙어 있는 청색 콜로니로 관찰된다.
- 식품시료에 존재하는 일반세균과 효모, 곰팡이의 정량분석을 위해 식품시료를 37C에서 일정 기간 동안 저장하면서 12시간 간격으로 채취하였다. 우유 등의 액상식품은 여과지(Whatman No.
- 그 때에 가스발생을 인정한 발효관을 대장균 양성이라고 판정하였다. 이 양성관으로부터 식품공전에 수록된 최확수표에 따라 검체 100mL 중의 대장균수를 산출하였다. 효모 및 곰팡이의 측정방법은 총 세균수 측정방법에 준하여 시험하였다.
- 축 · 수산식품 중 어묵, 게맛살, 아이스크림, 우유, 햄 시료에 대하여 두 가지 미생물 시험법을 각각 실시하였다. 일반세균수 분석에는 plate count agar법과 Petrifilm™ aerobic count plate 법을 비교하였고, 대장균군과 대장균의 분석에는 most probable num- her(MPN) 법과 Petrifilm™ coliform count plate 및 Petrifilm™ E. coZi/coliform count plate법을 각각 비교하였으며, 효모와 곰팡이의 분석에는 potato dextrose agar법과 Petrifilm패 yeast and mold count plate법을 비교하였다. 황색포도상구균의 분석에는 coagulase 시험법과 Petrifilm™ staph express count plate법을 비교하였다.
- 일반세균수 측정을 위한 시료는 식품 시료에 따라 29-50개를 사용하였는데 PAC법에 의해 분리된 세균수의 log,,, 값을 X축으로 하고 PCA법에 의해 분리된 세균수의 log10값을 y축으로 하여 두 방법에 의해 측정된 일반세균수를 plotting함으로써 회귀직선을 구하였다. 이렇게 구한 회귀직선의 기울기, 절편과 이로부터 구한 상관계수와 P 값, 일반세균수의 logl(1 평균값과 분리능력올 Table 1과 Fig.
- 전통적인 방법인 최확수법과 PEC법을 이용하여 대장균수를 측정하여 두 방법을 비교하였다. 대장균수를 측정하기 위해 사용한 시료는 식품 시료에 따라 12-24개를 사용하였다.
- 수산식품에 존재하는 미생물을 대상으로 분석하였다. 축 · 수산식품 중 어묵, 게맛살, 아이스크림, 우유, 햄 시료에 대하여 두 가지 미생물 시험법을 각각 실시하였다. 일반세균수 분석에는 plate count agar법과 Petrifilm™ aerobic count plate 법을 비교하였고, 대장균군과 대장균의 분석에는 most probable num- her(MPN) 법과 Petrifilm™ coliform count plate 및 Petrifilm™ E.
- 2 filter membrane)# 이용하여 여과한 후 고형성분이 제거된 액상성분을 시료로 사용하였다. 페이스트상인 아이스크림, 고형식품인 어묵, 게맛살과 햄은 식품 중량의 9배가 되는 멸균 증류수를 첨가하여 stomacher plastic bag(Nasco Whirl-pak filter bag, USA)에 넣고 stomacher(Aes Mix-2, France)를 사용하여 120초간 균질화한 후 액상부위를 수거하여 미생물시험을 실시하였다.
- 효모 및 곰팡이의 측정을 위해 사용한 PYM에는 항생물질과 지시약이 첨가된 영양성분을 포함하는 film 형태로 되어 있어, 효모와 곰팡이를 하나의 배 지에서 동시에 측정할 수 있는 선택성을 가진다. 핑크에서 녹 색의 빛깔을 나타내며 작고 가장자리 부분이 명확히 구분되는 것을 효모균으로 계수하였고, 다양한 색상으로 나타나며 큰 공 간을 차지하고 가장자리 부분이 명확히 구분되지 않는 것을 곰 팡이균으로 계수하였다. 황색포도상구균의 정량분석을 위해 사용한 STX에는 황색포도상구균이 생산하는 staphylococcal 내열 성 핵산가수분해효소(TNase)를 특이적으로 검출할 수 있도록 하여 특이성을 높이고 시험기간을 단축시킨 배지이다.
- 5로 조정한 potato dextrose agar(PDA, Ditto, Detroit,MI, USA)를 사용하여 25℃에서 5-7일간 배양한 후 발생한 집락수를 계산하였다. 황색포도상구균의 경우도 식품공전에 수록된 방법에 준하여 10% NaCl을 첨가한 tiyptic soy broth(TSB, Difco, Detroit, MI, USA)에 증균한 후 만니톨 식염한천배지로 분리한 다음 nutrient agar(NA, Difco, Detroit, MI, USA)에서배양하고 생성된 집락에 그람 염색을 실시하였다. 그람 염색결과 그람양성구균에 대하여 혈청 응집반응을 실시함으로써 황색 포도상구균을 확인하였다.
- coZi/coliform count plate법을 각각 비교하였으며, 효모와 곰팡이의 분석에는 potato dextrose agar법과 Petrifilm패 yeast and mold count plate법을 비교하였다. 황색포도상구균의 분석에는 coagulase 시험법과 Petrifilm™ staph express count plate법을 비교하였다. 5가지 축.
- 기존의 전통적인 방법에 의한 미생물 시험결과와 건조필름법을 사용하여 얻은 결과와의 상관관계는 선형회귀분석을 이용하여 구하였다. 회귀직선은 exc이 2000 software package(Microsoft Corp., Redmond, USA)를 사용하여 작성하고 이로부터 얻은 상관계수(r), 기울기(slope),절편(intercept)으로부터 실험군 간의 상 관관계를 분석하였다. 기울기 값이 1에 근접하는 정도와 절편 값이 0에서 벗어나는 정도를 분석하였다.
대상 데이터
- 구입하여 본 실험에 사용하였다. 대장균군과 대장균, 황색포도상구균 분석의 경우 식품 시료에 각각의 균을 접종하여 사용하였다. 대장균군과 대장균, 황색포도상구균의 정량분석은 일반세균과 효모, 곰팡이의 정량분석과 동일한 방법으로 액상 부위를 수집한 후 각 시료에 102, 103, 104, 105, 106, 107 CFU/mL가 되도록 대장균(대장균군과 대장균의 정량분석)과 황색포도상구균(황색포도상구균의정량분석)을 접종한 후 1일간 37℃ 에서 저장한 다음 시료를 채취하여 건조필름 제조사의 실험방법에 의한 건조필름법과 기존의 식품공전상의 전통적인 미생물 시험법을 실시하여 분석하였다.
- 두 방법을 비교하였다. 대장균수를 측정하기 위해 사용한 시료는 식품 시료에 따라 12-24개를 사용하였다. 두 방법에 의해 측정된 대장균수를 plotting하여 구한 회귀직선의 기울기, 절편과 이로부터 구한 상관계수와 P 값, log 평균값과 분리능력을 Table 3에 나타내었다.
- 본 연구에 사용된 식품 시료는 축산식품, 수산식품으로 구분하여 축산식품에는 아이스크림 (ice cream), 우유(milk), 햄 (ham)을 사용하였고, 수산식 품에는 어묵 (fish paste)과 게맛살(imitation crab meat)을 사용하였다 전통적인 미생물 시험법에 사용된 모든 배지는 Difco사(Detroit, MI, USA) 제품을 구입하여 사용하였으며, 건조필름법을 이용한 미생물 분석을 위한 배지는 한국 3M 주식회사로부터 공급 받았다. 건조필름배지는 Petrifilm™ aerobic count plate(PAC, 3M), Petrifilm™ coliform count plate(PCC, 3M), Petrihlm패 E.
- 본 연구에 사용한 식품 시료는 시중에서 판매, 유통중인 제품을 구입하여 본 실험에 사용하였다. 대장균군과 대장균, 황색포도상구균 분석의 경우 식품 시료에 각각의 균을 접종하여 사용하였다.
- . 수산식품에 존재하는 미생물을 대상으로 분석하였다. 축 · 수산식품 중 어묵, 게맛살, 아이스크림, 우유, 햄 시료에 대하여 두 가지 미생물 시험법을 각각 실시하였다.
- 황색포도상구균 수 측정을 위한 시료는 각각 30개씩을 사용하였다. 분석을 위해 전통적인 방법인 coagulase 시험법과 STX 법을 이용하였는데, 두 방법에 의해 측정된 황색포도상구균수를 plotting하여 구한 회귀직선의 기울기, 절편과 이로부터 구한 상관계수와 P 값, log 평균값과 분리능력을 Table 5에 나타내었다.
데이터처리
- 기울기 값이 1에 근접하는 정도와 절편 값이 0에서 벗어나는 정도를 분석하였다. P-value는 t-test를 통해 두 실험군 간의 유의성 확인을 위하여 산출하였다. 모든 통 계처리의 유의성은 p<0.
- 각 시료에 대한 미생물시험은 미생물당 3반복하여 평균을 구 해 얻은 CFU/mL를 log10값으로 전환하여 통계 처리하였다. 기존의 전통적인 방법에 의한 미생물 시험결과와 건조필름법을 사용하여 얻은 결과와의 상관관계는 선형회귀분석을 이용하여 구하였다.
- 값으로 전환하여 통계 처리하였다. 기존의 전통적인 방법에 의한 미생물 시험결과와 건조필름법을 사용하여 얻은 결과와의 상관관계는 선형회귀분석을 이용하여 구하였다. 회귀직선은 exc이 2000 software package(Microsoft Corp.
이론/모형
- 건조필름 제조사인 3M 주식회사의 실험방법에 따라 실시하였다. 일반세균수의 측정을 위해 사용한 PAC는 2장의 film으 로 구성되어 하부 film에는 수용성 겔과 탈수된 영양성분으로 덮여 있고 상부 Him에는 겔화 물질과 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)로 덮여있다.
- 대장균군수 측정을 위한 시료는 식품 시료에 따라 12-36개를 사용하였는데 전통적인 방법인 최확수법과 PCC법을 사용하였다. 두 방법에 의해 측정된 대장균군수를 plotting하여 구한 회귀직선의 기울기, 절편과 이로부터 구한 상관계수와 P 값, log 평균값과 분리능력을 Table 2와 Fig.
- 냉각 응고시킨 petri dish 를 거꾸로 하여 35℃에서 244&시간 동안 배양한 후 1 평판당 30-300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계수하였다. 대장균군은 수 단계의 연속한 동일희석도의 검체를 유당부 이온 발효관에 접종하여 대장균군의 존재 여부를 시험하고 그 결과로부터 확률론적인 대장균군의 수치를 산출하여 이것을 최확수로 표시하는 방법인 최확수법을 이용하였다. 대장균의 경우엔 시험용액 10 mL, 1 mL 및 0.
- 분석을 위해 전통적인 방법인 coagulase 시험법과 STX 법을 이용하였는데, 두 방법에 의해 측정된 황색포도상구균수를 plotting하여 구한 회귀직선의 기울기, 절편과 이로부터 구한 상관계수와 P 값, log 평균값과 분리능력을 Table 5에 나타내었다. P 값은 0.
- 식품 시료에 대한 미생물 분석은 식품공전(3)에 수록된 기존의 전통적인 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 일반세균수의 경우 비선택배지인 표준한천배지 내에서 발육할 수 있는 중온균의 수를 측정하는 표준 평판법에 의해 산출하였다.
- 일반세균수의 경우 비선택배지인 표준한천배지 내에서 발육할 수 있는 중온균의 수를 측정하는 표준 평판법에 의해 산출하였다. 시험용액을 0.
- 이 양성관으로부터 식품공전에 수록된 최확수표에 따라 검체 100mL 중의 대장균수를 산출하였다. 효모 및 곰팡이의 측정방법은 총 세균수 측정방법에 준하여 시험하였다. 단, 배지는 멸균된 10% 주석산을 무균적으로 가하여 pH를 3.
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