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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 대장균군 및 대장균의 정성 실험에 있어서 기존의 실험방법을 대체하여 건조필름을 이용할 수 있는지의 여부를 평가하기 위하여 각 균체 농도별로 검출율을 조사하여 비교하였다.
제안 방법
- 대장균군 및 대장균의 정성실험에 건조필름을 이용할 수 있는지를 평가하였다. 대장균군의 정성실험에 있어서 lactose broth 배양법의 경우는 검출율이 가장 높은데 반하여 비교적 선택성이 낮고, 검출에 48시간이 소요되며, 실험 시마다 배지를 제조하여야 하는 등 번거로운 조작을 필요로 하였다.
- 대장균군 및 대장균의 검출 실험은 일반적으로 식품공전의 방법에 따라서 수행한다(식품의약품안전청 2007). 대장균군의 정성실험에서는 Durham관을 넣은 lactose broth에 시험액을 접종하고 35℃에서 48시간 동안 배양한 후 가스 생성 여부를 확인하고 의심이 가는 시험관에서 균주를 취하여 확인 실험을 행하거나, 멸균된 페트리접시에 시험액 1 ㎖를 가하고 50℃ 정도로 식힌 desoxycholate lactose agar 배지를 가하여 굳힌 다음 35℃ 항온기에서 24시간 동안 배양하고 의심이 가는 집락을 선발하여 확인 실험을 행한다. 그러나 lactose broth에서는 대장균군뿐만 아니라 살모넬라를 비롯한 유당을 발효하여 가스를 생산하는 모든 균이 검출되므로 선택성이 매우 낮고, 배지의 제조가 번거롭고, 배지를 제조하는데 시간이 오래 걸리며, 검출에도 48시간이라는 시간이 소요된다.
- 6인 대수기에 도달할 때까지 항온진탕배양기에서 진탕배양하여 균액을 준비하였고 배양액은 냉장보관하면서 사용하였다. 보관되었던 균주 배양액을 균체 농도가 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 및 0.125 cfu/㎖가 되도록 희석하였으며, 대장균군 검출의 경우 대장균군 검사용 건조필름, desoxycholate lactose agar, lactose broth에, 대장균 검출의 경우 대장균 검사용 건조 필름, EC broth에 각 희석액 1 ㎖씩을 접종하고 24～48시간 배양하면서 균의 증식 여부를 확인하였다.
- 식품공전상의 대장균 검출법인 Durham관을 넣은 EC broth 배양법과 건조필름법을 비교하였다.
- 식품공전상의 대장균군 검출법인 desoxycholate lactose agar 평판배양법 및 Durham관을 넣은 lactose broth 배양법과 건조 필름 배양법을 비교하였다.
대상 데이터
- pneumoniae subsp. pneumoniae KCCM40890과 대장균 E. coli KCCM11234를 선정하여 실험하였으며, 냉동 건조된 형태로 사단법인 한국종균협회 한국미생물보존센터에서 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 균주는 nutrient broth(Difco, USA)에서 1일간 배양하여 활성화시킨 후, 냉장상태에서 평판 배지에 보관하면서 사용하였다.
- 실험대상 균주 3종을 10 ㎖ nutrient broth에 접종하여 12시간 배양한 후, 100 ㎖ nutrient broth에 재접종하고 OD가 약 0.5～0.6인 대수기에 도달할 때까지 항온진탕배양기에서 진탕배양하여 균액을 준비하였고 배양액은 냉장보관하면서 사용하였다. 보관되었던 균주 배양액을 균체 농도가 8, 4, 2, 1, 0.
- 실험에 사용된 desoxycholate lactose agar, lactose broth, EC broth는 Difco사(USA)의 제품을, 건조필름은 3M사(USA)의 PetrifilmTM을 사용하였다.
데이터처리
- 각 배지별 검출율의 유의적 차이는 SPSS(Version 12.0)를 이용하여 χ2-검정으로 분석하였다.
성능/효과
- E. coli의 검출에 있어서 EC broth 배양법은 검출율은 높으나 선택성이 떨어지며 실험조작이 번거로운 반면, 건조필름법은 검출율이 다소 낮으나 시료액의 균체 농도가 1 cfu/㎖ 이상에서는 33% 이상의 검출율을 보이므로 3개의 배지에 접종하여 실험할 경우 시료 중에 대장균의 존재 여부를 확인할 수 있는 수준이며, 또한 선택성이 높고, 별다른 준비나 조작을 필요로 하지 않으므로 누구나 쉽게 대장균을 검출하는데 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 단지 건조필름법은 균주에 대한 선택성이 높아서 손상된 균체의 검출이 어려웠으며, 손상된 균체가 증식하는데 보다 많은 시간이 소요되므로 정확한 실험을 위해서는 대략 36시간 정도의 배양이 필요하였다.
- coli KCCM11234의 경우, 거의 모든 농도에서 3가지 방법을 이용한 검출율이 유의적인 차이를 보였다. Lactose broth 배양법의 검출율이 모든 농도에서 가장 높았으며, desoxycholate lactose agar 평판배양법, 건조필름법의 순으로 검출율이 높았다(Table 1). 이는 건조필름법, desoxycholate lactose agar 평판 배양법, lactose broth 배양법의 순으로 선택성이 높기 때문으로 생각되며, 선택성이 높은 건조필름의 경우는 손상된 세포의 재생이 더욱 어렵기 때문인 것으로 추정된다.
- pneumoniae subsp. pneumoniae KCCM40890 모두에 대하여 lactose broth 배양법의 검출율이 가장 높았으며, desoxycholate lactose agar 평판배양법, 건조필름법의 순으로 검출율이 높았다. Lactose broth 배양법의 경우는 검출율이 가장 높은데 반하여 비교적 선택성이 낮고, 검출에 48시간이 소요되며, 실험 시마다 배지를 제조하여야 하는 등 번거로운 조작을 필요로 한다.
- pneumoniae subsp. pneumoniae KCCM40890의 경우 58.3%의 검출율을 보이므로, 최대 3개의 배지에 접종하여 실험할 경우 시료 중에 대장균군의 존재 여부를 확인할 수 있는 수준이며, 선택성이 높고, 별다른 준비나 조작을 필요로 하지 않으므로 쉽게 대장균군을 검출하는데 사용할 수 있었다. 대장균의 정성실험에 있어서 EC broth 배양법은 검출율은 높으나 선택성이 떨어지며 실험조작이 번거로운 반면 건조필름법은 검출율이 다소 낮다.
- coli KCCM11234는 거의 모든 농도에서 EC broth 배양법의 검출율이 건조필름법의 검출율보다 높았다. 그러나 시료액의 균체 농도가 1 cfu/㎖까지는 2가지 방법 모두 33% 이상의 검출율을 보였기 때문에 시료당 3개의 배지에 접종하여 실험할 경우 시료 중에 존재하는 E. coli의 검출이 가능하였다.
- coli의 경우는 다른 균에 비하여 냉장, 냉동 및 건조에 대한 내성이 낮아서 세포의 손상이 더 크기 때문에 검출율이 상대적으로 낮은 것으로 판단된다. 그러나 시료액의 균체 농도가 1 cfu/㎖까지는 건조필름법이 34.3%, desoxycholate lactose agar 평판배양법이 77.1%, lactose broth 배양법이 82.9%로 3가지 방법 모두 33% 이상의 검출율을 보이기 때문에 시료당 3개의 배지에 접종하여 실험을 행할 경우 시료 중에 존재하는 E. coli의 검출이 가능하였다.
- aerogenes KCCM12177의 경우는 거의 모든 농도에서 3가지 방법을 이용한 검출율의 유의적인 차이가 발견되지 않았다(Table 2). 더욱이 균체 농도가 1 cfu/㎖까지는 건조필름법이 67.4%, desoxycholate lactose agar 평판배양법이 69.8%, lactose broth 배양법이 80.0%로 3가지 방법 모두 50% 이상의 높은 검출율을 보이고 있기 때문에 각각 시료당 2개의 배지에 접종하여 실험을 행할 경우 시료 중에 존재하는 E. aerogenes의 검출이 가능하였다.
- 대장균의 정성실험에 있어서 EC broth 배양법은 검출율은 높으나 선택성이 떨어지며 실험조작이 번거로운 반면 건조필름법은 검출율이 다소 낮다. 시료액의 균체농도가 1 cfu/㎖ 이상에서는 37.1%의 검출율을 보이므로 3개의 배지에 접종하여 실험할 경우 시료 중에 대장균의 존재 여부를 확인할 수 있는 수준이며, 선택성이 높고, 별다른 준비나 조작을 필요로 하지 않으므로 쉽게 대장균을 검출하는데 사용할 수 있었다. 단지 건조필름법은 균주에 대한 선택성이 높아서 손상된 균체의 검출이 어려웠으며 손상된 균체가 증식하는데 보다 많은 시간이 소요되므로 정확한 실험을 위해서는 대략 36시간 정도의 배양이 필요하였다.
후속연구
- 반면에 건조필름법은 검출율이 다소 낮지만 시료액의 균체농도가 1 cfu/㎖ 이상에서는 33～50% 이상의 검출율을 보이므로 최대 3개의 배지에 접종하여 실험을 행할 경우 시료 중에 대장균군의 존재 여부를 확인할 수 있는 수준이었으며, 선택성이 높고, 별다른 준비나 조작을 필요로 하지 않으므로 누구나 쉽게 대장균군을 검출하는데 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 이와 같은 사실을 종합해 볼 때 건조필름법은 대장균군의 정성실험을 행하는데 있어서 현장에서도 손쉽게 실시할 수 있는 방법으로 대장균군의 검출에 널리 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 단지 건조필름법은 균주에 대한 선택성이 높아서 손상된 균체의 검출이 어려웠으며, 손상된 균체가 증식하는데 보다 많은 시간이 소요되므로 정확한 실험을 위해서는 대략 36시간 정도의 배양이 필요하였다. 이와 같은 사실을 종합해 볼 때 건조필름은 대장균의 정성실험을 행하는데 있어서 현장에서도 손쉽게 실시할 수 있는 방법으로 기존의 방법을 대체하여 대장균의 검출에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 단지 건조필름법은 균주에 대한 선택성이 높아서 손상된 균체의 검출이 어려웠으며 손상된 균체가 증식하는데 보다 많은 시간이 소요되므로 정확한 실험을 위해서는 대략 36시간 정도의 배양이 필요하였다. 전반적인 상황으로 판단해 볼 때 건조필름은 대장균군 및 대장균의 정성실험을 행하는데 있어서 현장에서도 손쉽게 실시할 수 있는 방법으로 기존의 방법을 대체하여 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.
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