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문제 정의
- 본 연구에서는 SEM을 2-nitrobenzaldehyde(2-NBA)로 유도체화 시킴으로서 분자량을 높여줄 뿐만 아니라 ultraviolet light에 활성을 갖게하여 기존 연구에서 문제 되었던 상관관계(F), 낮은 회수율, 낮은 검출한계 등과 같은 분석방법의 유효성을 확보하였다. 따라서 본 연구에서는 식품관련 안전관리를 위하여 HPLC triple column system을 이용하여 병마개 가스켓과 식품에서의 SEM의 분석법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 2-NBA-SEM을 정성확인하기 위해 LC/MS를 이용하여 분석 올 했다. 이때 사용한 기기는 VMian사(210, Varian Co.
- 6 mm, 5 um)로 20분간 이동시켜 MF 컬럼에 2-NBA-SEM의 머무름 시간(tQ동안 focusing column에 흡착시키고 drain시켰다. 2-NBA-SEM의 분석을 위해 Pump 2에서 10 mM potassium phosphate: ACN = 8 :2의 용액 을 역 방향(back flush mode)으로 흘려 분석 컬럼(Capcellpak C18, MG 250 mm X1.5 mm, 5nm)으로 이동시켜 분석했다. 검출은 UV-detector 266nm에서 실시했으며 분석시간은 60분이고 시료당 3 반복으로 분석했다.
- HPLC/PDA에 의한 2-NBA-SEM의 분석은 Fig. 1과 같이 autosampler(Model 3023, Shiseido Co., Ltd, Tokyo, Japan)와 UV/Vis(Model 3002), PDA(Model 2013)가 장착된 LC system 에서 capcell pak column을 triple 형태로 사용하였다. 시료 100uL를 주입하고 Pump 1에서 0.
- Semicarbazide(SEM)을 정밀히 달아 증류수에 녹여 각각의 농도가 0.5, 1.0, 10, 100, 1,000, 2,000, 및 8, 000ng/mL이 되도록 희석하여 각각의 농도의 유도체화 용액 100 gL 씩 첨가하여 균질화 시킨 다음 잘 밀봉한 후 항온수조 37℃에서 16시간 반응시킨 후 실온으로 냉각하여 표준용액으로 만들어서 검량 선을 작성하였다.
- 5 mm, 5nm)으로 이동시켜 분석했다. 검출은 UV-detector 266nm에서 실시했으며 분석시간은 60분이고 시료당 3 반복으로 분석했다.
- 모든 시료에서 SEM의 존재를 확인하기 위해 크로마토그램 유형을 기준으로 표준물질과 시료의 peak의 머무름 시간을 확인했고, 2-NBA-SEM 시료의 정성을 위하여 LC/MS를 사용 Richard 등(12)의 방법에 따라서 시료의 2-NBA-SEM 시료 peak 와 표준물질 peak의 mass spectrum을 비교하였다. ESI(Negative) 에서 Scan mode로 m/z 100-200의 mass range로 측정한 결과 Fig.
- 125 M 차아염소산나트륨 용액 10mL 첨 가하고 강하게 진탕하고 2-NBA 100 pL 첨가하여 균질화 시킨 다음, 항원수조 3KC에서 B시 간반응시켰다. 반응이 끝나면 실온 온도로 냉각한 후 10 mL ethyl acetates 2회 첨가 회수하여 가온 질소 농축 후 50% 메탄올 4 m2로 정용하여 HPLC 및 LC/MS의 분석용 시료로 했다.
- 다시 말해서 PVC 가스켓이나 식품에서 SEM 의 분석에 대한 명확한 방법이 확립이 되지 않은 상태이다. 본 연구에서는 SEM을 2-nitrobenzaldehyde(2-NBA)로 유도체화 시킴으로서 분자량을 높여줄 뿐만 아니라 ultraviolet light에 활성을 갖게하여 기존 연구에서 문제 되었던 상관관계(F), 낮은 회수율, 낮은 검출한계 등과 같은 분석방법의 유효성을 확보하였다. 따라서 본 연구에서는 식품관련 안전관리를 위하여 HPLC triple column system을 이용하여 병마개 가스켓과 식품에서의 SEM의 분석법을 확립하고자 하였다.
- , USA)의 LC/MS이며 1200 L mass selective detector가 연결된 system이다. 시료에서 2-NBA-SEM 확인에는 표준액의 total ionization chrmmatogram(TIC)과의 머무름 시간 및 mass spec-trum을 비교하여 동질성 여부를 확인했다.
- 125 M 차아염소산나트륨 10 mL/와 증류수 10mL를 첨가한 다음 강하게 진탕하여 원심분리(4℃, 20min, 21,000rpm) 한 후, 맑은 물 충을 취했다. 위 과정을 2회 반복하여 합한 액충에 dichloromethane 10mL< 첨가하여 진탕한 후 수용성 식품과 동일한 방법으로 전처리 하였다.
- 일본식품위생법주해 (Pharmaceutical Society of Japam)(10)의 방법과 Thierry 방법(11)을 응용하여 gasket 0.5g을 10 mg tet-rahyd2fijran(THF)에 용해시킨 후 증류수 10mL씩 2회 가하여 폴 리머를 석출시킨 후 여과했다. 물 층을 40mL vial에 회수하여 빛이 들어가지 않도록 한 후 시료 0.
- 이는가스켓 제조시의 반응 및 조건에 기인하는 것으로 생각된다. 한편 식품중 SEM의 회수율 시험에서는 수용성 식품과 지용성 식품으로 제품을 달리하였고 수용성 식품은 알코올성 식품과 비 알코올성 식품으로 구분하여 회수율을 조사하였다. SEM 을 첨가한 후 SEM의 회수율을 측정한 결과는 Table 3과 같다.
대상 데이터
- 기타 일반시약은 특급시약을 사용했다. PVC gasket 은 원재료 5종을 생산자로부터 제공받아 얇게 절단하여 시험용으로 사용했으며, 분석 방법을 확인하기위해 시중에 유통중인 제품을 선택했다. 유통 제품중 재질시험에 사용된 제품은 20종이며, 식품은 식품군별로 구분하여 7종을 선택하였다.
- 분석대상 SEMe Sigma(Sigma Co., Ltd, USA)제품을 사용했고 dichloromethane 및 ethyl acetate는 Merk (Merit Co., Ltd, Germany)시약을 사용했으며, 2-nitrobenzaldehyde(2-NBA), dim-ethylsulfoxide(DMSO)은 Sigma(Sigma Co., Ltd, USA) 제품을 사용했다. 기타 일반시약은 특급시약을 사용했다.
- PVC gasket 은 원재료 5종을 생산자로부터 제공받아 얇게 절단하여 시험용으로 사용했으며, 분석 방법을 확인하기위해 시중에 유통중인 제품을 선택했다. 유통 제품중 재질시험에 사용된 제품은 20종이며, 식품은 식품군별로 구분하여 7종을 선택하였다. 이들 제품은 백화점 및 할인 마트에서 구매하여 사용했다.
- 유통 제품중 재질시험에 사용된 제품은 20종이며, 식품은 식품군별로 구분하여 7종을 선택하였다. 이들 제품은 백화점 및 할인 마트에서 구매하여 사용했다.
성능/효과
- Table 2와 같다. 각 PVC 가스켓에 함유되어있는 SEM 이 최대로 검출된 함량은 잼의 경우 5771.30ng/g, 소스 2461.06 ng/g, 유아용식품 1270.30 ng/g 및 쥬스 812.20 ng/g 순으로 높았다. 그러나 이들 가스켓에서 검출된 SEM의 평균 함량은 각각 640.
- 20 ng/g 순으로 높았다. 그러나 이들 가스켓에서 검출된 SEM의 평균 함량은 각각 640.04, 691.35, 1024.42, 457.77 ng/g이었으며, 또한 각각의 식품군에서 SEM함량의 표준편차(SD)는 각 식품의 PVC 가스켓에서의 농도차이가 큰 것을 알 수 있었다. 즉 본 실험을 통하여 같은 유형의 식품에 사용되는 PVC 가스켓이라도 가스켓 마다 SEM의 농도차이가 크다는 것을 알 수 있었다.
- 2와 같다. 그림에서와 같이 2-NBA-SEM의 머무름 시간(tR)49.83로 나타났으며 측정한 표준물질의 tR들이 0.17에 4.40% 사이의 상대표준편차(RSD, %)를 보이고 있어서 2-NBA-SEM peak의 재현성이 우수함을 알 수 있었다.
- 3과 같다. 그림에서와 같이 이온의 Gagment를 보면 TIC(total ion chromatogram)가 m/z 209, 192, 177, 166, 149, 134의 pattern을 보여 표준물질과 시료에서 2-NBA-SEM 각 이온 간의 ratio가 m/z 209 이온을 base peak로 보았을 때 134/ 209(61-63%), 166/209(70%), 192/209(73-75%)이었으며, 이는 2-NBA-SEM 시료와 표준물질의 ratio가 동일하게 나타나 시료의 2-NBA-SEM과 표준물질이 같은 물질임을 확인할 수 있었다.
- 그림에서와 같이 표 품의 LC/MS 크로마토그램과 시료에서의 크로마토그램의 피크 위치와 패턴이 동일함을 알 수 있었다. 또한 PVC gasket 시료와 식품 시료에서도 표준물질과 같은 m/z ratio가 동일하게 나타나 같은 물질임을 확인할 수 있었다.
- 75 검출한계는 2ng/g 이상이라고 보고했다. 이상의 실험결과 triple column system을 이용한 HPLC 분석은 가장 낮은 검출한계를 보였으며, 이는 식품에서 낮은 농도로 존재하는 SEM을 검출하기에 적절한 방법이라 생각된다.
- 제조업자로부터 받은 PVC 가스켓에 SEM을 첨가하였을 때 triple column system을 이용하여 나타난 회수율은 Table 1에서 보는 바와 같이 92.12-98.71%이고 상대표준편차(RSD, %)는 1.01-7.67%로 높은 회수율을 보였으며, 비교적 좋은 재현성을 나타냈으며, 이는 적절한 전처리 방법을 사용했음을 알 수 있었다. Hoenicke 둥(13)은 가축 등을 대상으로 독특한 회수율 방법 올 사용했는데 nitrofUrazone을 먹이에 포함시킨 후 일정기간 사육 시켜 육질에 SEM의 회수율을 구하였으며, 이때 회수율은 10-30%로 나왔으나 이는 nitrofiirazone을 섭취하면 nitrofUrazone의 대사물질인 SEM이 체내에 상당히 많은 양이 잔류한다는 것을 알 수 있다.
- 25);">)는 각 식품의 PVC 가스켓에서의 농도차이가 큰 것을 알 수 있었다. 즉 본 실험을 통하여 같은 유형의 식품에 사용되는 PVC 가스켓이라도 가스켓 마다 SEM의 농도차이가 크다는 것을 알 수 있었다. 이는가스켓 제조시의 반응 및 조건에 기인하는 것으로 생각된다.
- SEM 을 첨가한 후 SEM의 회수율을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 표에서와 같이 수용성 식품에서의 회수율은 90.00-97.33%로 높은 회수율을 보였으며 지용성 식품에서의 회수율은 83.45-93.33% 로 수용성 식품의 회수율에 비해서 다소 낮았으나 비교적 좋은 결괴를 보였다. 이는 HPLC triple column system을 이용했기 때문에 방해 피크의 간섭을 최대한 받지 않은 조건으로 분석한 것에 기인하는 것으로 생각된다.
후속연구
- 이상의 실험 결과 SEM을 분석하기 위하여 HPLC triple column system을 이용하였을 때 PVC 가스켓과 식품에서의 SEM의 회수율이 기존 연구에 비해 좋은 결과를 보였으며, 검출 한계가 0.48 ±0.08ng/mL고로 낮게 나타나 이는 향후 SEM 의 PVC 가스켓으로부터 다양한 식품으로의 이행 연구에 도움을 줄 것으로 생각한다.
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