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문제 정의
- 또한 Bigi 등 (24)은 glutaraldehydes. 가교 결합시켜 젤라틴 필름의 기계적인 특성을 향상시키고, 그 필름의 열적 성질을 연구하였다. Sobral 둥(25)은 sorbitol의 작용에 따라 bovine hide와 pigskin 젤라틴 가식성 필름에 있어 수분 투과도, 기계적 및 열적 특성에 관하여 연구하였다.
- 본 연구에서는 항균활성을 지니는 기능성 생고분자 필름을 제조하기 위한 전 단계로 키토산과 젤라틴을 이용하여 혼합비 율별로 키토산/젤라틴 혼합용액의 항균활성을 측정하였다. 사용된 균주는 그램 양성(Bacillus cereus ATCC 14579, Listeria monocytogenes ATCC 15313) 및 그「램음성 (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis IFO 3313) 세균 4종류이고, paper diffusion method와 optical density method로 항균효과를 나타내는 키토산/젤라틴 혼합용액의 최적 혼합비율 및 키토산 의 최소저해농도를 측정하였다.
제안 방법
- 키토산과 젤라틴을 이용하여 기능성 혼합필름 을 제조하기 위한 혼합비율에 따른 혼합용액의 항균활성에 관한 연구는 아직까지 미흡한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 키토산과 젤라틴을 이용하여 혼합비율에 따라 혼합용액을 제조하여 paper difliision method를 통해 항균활성 여부 및 최대 적정 혼합비율을 측정하였고, optical density method로 항균활성을 나타내는 키토산의 최소저해농도를 측정하였다. 또한 향후 대량생산을 위해 resin으로 제조한 다음, 이 resin을 이용하여 압출 성형기(extruder)로 항균활성을 지니는 생고분자 필름 개발 및 대량생산 시스템 공정 확립에 그 기초 자료로 활용하 고자 한다.
- 4, L6mL씩 첨가시켰다. 또한 균액과 시료가 첨가된 NB 및 BHI 배지를 37℃에서 72시간 동안 진탕배양 시키면서, 1일 동안은 4시간 간격, 2-3일은 8시간 간격으로 미생물의 생육정도를 UV-VIS Spectrophotometer(OPRON-3000, HANSON Tech. Co., Korea)를 이용하여 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 혼합 용액 OmL 첨가한 것을 공시균(control)A로 하였고, 공시균 보다 흡광도가 낮은 것을 저해활성이 있는 것으로 판단하였다.
- 혼합 용액 OmL 첨가한 것을 공시균(control)A로 하였고, 공시균 보다 흡광도가 낮은 것을 저해활성이 있는 것으로 판단하였다. 또한 대조균으로 묽은 2%(v/v) acetic acid(초산)의 항균활성을 관찰하기 위하여 균액이 접종된 NB 및 BHI 배지에 2% acetic acid를 0.4mL씩 첨가하여 상기와 같은 방법으로 최소저해농도를 측정하였다.
- 이 키토산 및 젤라틴 용액을 hot plate stirrer에서 80-90℃ 로 가열교반 시켜 각각의 3%(w/w) 키토산 용액과 젤라틴 용 액을 제조하였다. 또한 제조된 각각의 3%(w/w) 키토산 및 젤 라틴 용액을 Table 2와 같은 혼합비율에 따라 혼합용액을 조제 하였다. 즉, 혼합비율별로 조절된 각각의 혼합용액들은 균질기 를 이용하여 6, 000rpm에서 2분간 중합반응 시킨 후 hot plate stirrer에서 80-9UC로 재가열교반 시켜 혼합용액을 제조하였다(Fig.
- 사용된 균주는 그램 양성(Bacillus cereus ATCC 14579, Listeria monocytogenes ATCC 15313) 및 그「램음성 (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis IFO 3313) 세균 4종류이고, paper diffusion method와 optical density method로 항균효과를 나타내는 키토산/젤라틴 혼합용액의 최적 혼합비율 및 키토산 의 최소저해농도를 측정하였다. 또한 키토산의 용매로 사용된 2%(v/v) 초산의 항균효과를 측정하였다. 혼합비율별로 제조된 키토산/젤리틴 혼합용액을 이용하여 paper diffusion method로 paper disc(8 mm)에 50 pL, 75 μL/씩 분주시 켜 항균활성을 측정한 결과, 저해환의 크기는 8mm에서 18.
- , Japan) 시켰다. 멸균된 NB 및 BHI 배지에 활성 시킨 균액을 각각 ImL를 접종하고, B. cereus, E. coli 및 S. enteritidis 균들에는 혼합비율별로 혼합용 액을 각각 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mL씩 첨가하였고, L. monocytogenese: 여러 번의 예비실험을 통해 혼합용액을 각각 0, 1.0, 1.2, 1.4, L6mL씩 첨가시켰다. 또한 균액과 시료가 첨가된 NB 및 BHI 배지를 37℃에서 72시간 동안 진탕배양 시키면서, 1일 동안은 4시간 간격, 2-3일은 8시간 간격으로 미생물의 생육정도를 UV-VIS Spectrophotometer(OPRON-3000, HANSON Tech.
- 그런 다음 신속히 1-2분 이내에 멸 균수 25㎕를 각각 분주하여 4T에서 1시간 방치한 후 37P에서 뒤집어서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 paper disc 주변 에 저해환이 형성되면 항균활성이 있는 것으로 판단하였고, 그 저해환의 직경크기를 vernier caliper(Mitutoyo Co., Japan)로 측정하였다.
- 본 연구에서는 항균활성을 지니는 기능성 생고분자 필름을 제조하기 위한 전 단계로 키토산과 젤라틴을 이용하여 혼합비 율별로 키토산/젤라틴 혼합용액의 항균활성을 측정하였다. 사용된 균주는 그램 양성(Bacillus cereus ATCC 14579, Listeria monocytogenes ATCC 15313) 및 그「램음성 (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis IFO 3313) 세균 4종류이고, paper diffusion method와 optical density method로 항균효과를 나타내는 키토산/젤라틴 혼합용액의 최적 혼합비율 및 키토산 의 최소저해농도를 측정하였다. 또한 키토산의 용매로 사용된 2%(v/v) 초산의 항균효과를 측정하였다.
- 9 g을 가한 뒤, 준비된 묽은 2%(v/v) acetic acid 용액 및 80-9(FC로 가열된 증류수 1000 mL를 채웠 다. 이 키토산 및 젤라틴 용액을 hot plate stirrer에서 80-90℃ 로 가열교반 시켜 각각의 3%(w/w) 키토산 용액과 젤라틴 용 액을 제조하였다. 또한 제조된 각각의 3%(w/w) 키토산 및 젤 라틴 용액을 Table 2와 같은 혼합비율에 따라 혼합용액을 조제 하였다.
- 그리고 분양 받은 균주들은 3회 이상 계대배양 시 켜 균을 활성 시킨 후 사용하였다. 즉, 공시 균주의 slant media 상에 배양된 균주를 무균실내에서 1 백금이를 취하여, 멸균된 nutrient broth(T4B), brain heart infusion(BHI) 액체배지에 각각 접종하고, 37P에서 24시간 동안 왕복식 진탕배양기(SSI 603 Shinsaeing, Korea)에서 120rpm으로 배양하여 Table 1과 같이 활성화 시켰다.
- 항균활성 측정은 paper diffusion method(26)에 따라 측정하였다. 즉, 멸균된 petri dish에 nutrient agar(NA)와 brain heart infusion agar(BHIA) 배지를 약 20mL씩 분주하여 응고시키고, 그 위에 0.85%(w/v) 멸균생리식염수로 100배 희석된 시험균액 ImL과 이미 제조된 soft agar(Difco 214010, USA) 9mL를 잘 혼합시켜 분주 후 응고시켰다. 그리고 멸균된 filter paper disc(8 mm in diameter, Toyo, Japan)를 화염멸균 된 핀셋을 이용하여 시험용 평판 배지 위에 을려놓고, paper disc의 가운데 부분을 가볍게 눌러 밀착시킨 후 혼합비율별로 제조된 혼합용액 50 pL, 75 μL를 각각 흡수시켰다.
- 또한 제조된 각각의 3%(w/w) 키토산 및 젤 라틴 용액을 Table 2와 같은 혼합비율에 따라 혼합용액을 조제 하였다. 즉, 혼합비율별로 조절된 각각의 혼합용액들은 균질기 를 이용하여 6, 000rpm에서 2분간 중합반응 시킨 후 hot plate stirrer에서 80-9UC로 재가열교반 시켜 혼합용액을 제조하였다(Fig. 1).
- 최소저해농도 측정은 NB 및 BHI 배지 용액을 제조하여 삼 각플라스크에 60 mW 분주한 다음, 12代에서 15분간 고압멸 균(MLS-3020, SANYO Co., Japan) 시켰다. 멸균된 NB 및 BHI 배지에 활성 시킨 균액을 각각 ImL를 접종하고, B.
- , Korea)를 이용하여 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 혼합 용액 OmL 첨가한 것을 공시균(control)A로 하였고, 공시균 보다 흡광도가 낮은 것을 저해활성이 있는 것으로 판단하였다. 또한 대조균으로 묽은 2%(v/v) acetic acid(초산)의 항균활성을 관찰하기 위하여 균액이 접종된 NB 및 BHI 배지에 2% acetic acid를 0.
대상 데이터
- 또한 키토산 용매인 acetic acid, 필름의 가소제로 사용한 이yoei•이 및 NaCle 각각 Showa Chemical Co.(Japan), Samchun Pure Chemical C이Korea)에서 구입하였고, 물은 증류수(distilled water)를 사용하였다.
- (Korea)로부터 구입하였고, 젤리강도(jelly strengthe]- 240-260 bloom인 젤라틴은 UNIGEL Co.(Ko咬)에서 구입하였다. 또한 키토산 용매인 acetic acid, 필름의 가소제로 사용한 이yoei•이 및 NaCle 각각 Showa Chemical Co.
- 항균활성 실험에서 사용된 미생물은 일반적인 식품부패 및 병원성 세균으로 4가지 균주들을 사용하였다. 그램양성(B血血s cereus ATCC 14579, Listeria monocytogenes ATCC 15313) 및 그램음성(Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis IFO 3313) 세균들은 (사)한국종균협회 부설 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양 받았다. 그리고 분양 받은 균주들은 3회 이상 계대배양 시 켜 균을 활성 시킨 후 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 키토산(average molecular weight 40 KDa, degree of deacetylation 90%)은 목포시에 소재한 Bio-Tech. Co.
- 키토산은 젤라틴과 달리 증류수에서 용해성이 좋지 않기 때문에 2%(v/v) acetic acid를 용매로 사용하였다. 먼저 키토산 및 젤라틴의 최종농도가 각각 3%(w/w)가 되도록 용질 3 g을 칭량 하고, 가소제인 glycerol 0.
- 항균활성 실험에서 사용된 미생물은 일반적인 식품부패 및 병원성 세균으로 4가지 균주들을 사용하였다. 그램양성(B血血s cereus ATCC 14579, Listeria monocytogenes ATCC 15313) 및 그램음성(Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis IFO 3313) 세균들은 (사)한국종균협회 부설 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양 받았다.
데이터처리
- 혼합비율에 따른 혼합용액의 항균활성에 따른 저해환의 크 기 및 최소저해농도의 값들은 평균값과 표준편차로 나타내었 고, 각 실험 평균값의 유의적인 차이 검정은 SAS(Statistical Analysis System)통계 package(27)를 이용하여, Duncan's Multiple Range Test로 검증하였다.
이론/모형
- 항균활성 측정은 paper diffusion method(26)에 따라 측정하였다. 즉, 멸균된 petri dish에 nutrient agar(NA)와 brain heart infusion agar(BHIA) 배지를 약 20mL씩 분주하여 응고시키고, 그 위에 0.
- 6mg이었다. 혼합비율별로 제조된 키 토산/젤리틴 혼합용액을 이용하여 항균활성을 나타내는 키토산의 최소저해농도를 optical density method로 측정하였다. 그 결 괴", B.
성능/효과
- 혼합비율별로 제조된 키 토산/젤리틴 혼합용액을 이용하여 항균활성을 나타내는 키토산의 최소저해농도를 optical density method로 측정하였다. 그 결 괴", B. cereus, L. monocytogenes, E. coli 및 S. enteritidis에 대한 키토산의 최소저해농도는 각각 0.1461 mg/mL, 0.2419mg/ mL, 0.0980 mg/mL 및 0.0490 mg/mL로 측정되었다. 또한 2%(v/ v) 초산 자체의 최소저해농도를 측정한 결과, B.
- B. cereus, L. monocytogenes, E. coli 및 S. enteritidise 대하여 항균활성을 나타내는 키토산의 첨가농도가 증가됨에도 불구하고 오히려 항균활성이 감소하는 특성을 나타내었다. Sudar- shan 등(31)은 첨가되는 키토산에 의해 균주의 응집이 많이 .
- 0490 mg/ mL로 나타났다. E. c湖와 S. enteritidis는 그램음성 세균으로 lipopolysaccharide층으로 이루어진 외막과 얇은 peptidoglycan으 로 이루어진 세포벽을 가지고 있고, DNA homolog般에서 E. coli 와 S. enteritidis는 50%의 유사성을 지닌 장내질환 세균들이기 때문에 키토산에 대한 항균활성도가 비슷할 것이라 기대했지 만, 본 실험결과로 균주 특성에 따라 키토산의 항균력에 차이가 있음을 확인할 수 있었다.
- 혼합용액 l.OmL를 첨가한 경우 4시간까지는 다른 처리구들과 큰 차이를 보이지 않았지만, 그 이후에는 키 토산의 농도가 낮음에도 불구하고 L. 也坨Wogezies에 대하여 가장 높은 항균활성을 나타내었다. Fig.
- Paper disc에 혼합비율별로 각각 75 μL를 분주한 경우(B)는 키토산의 함량이 10%(8. cereus, E. coli, S. enteritidis), 20%(Z. monocytogenes) 이상으로 증가함에 따라 50 μL를 분주했을 때 와 마찬가지로 항균활성이 서서히 증가하는 경향을 나타내었고, 키토산/젤라틴 혼합용액의 혼합비율이 chitosan/gelatin = 7/3 에서 E. c湖에 대하여 저해환의 크기가 18.07mm로 가장 큰 항균활성을 나타내었다. L.
- monocytogeg는 키토산의 농도가 30%에서 항균활성을 나타내 었지만, 그 저해환의 크기가 뚜렷하지 않았다. 따라서 B. cereus, E. coli 및 S. enteritidis 균주들에 대하여 항균활성을 나타내는 혼합용액의 혼합비율은 chitosan/gelatin = 2/8이였고, 그때 항균 활성을 나타내는 키토산의 절대량은 0.3 mg으로 측정되었다. 또한 L.
- monocytogeg는 키토산의 농도가 30%에서 항균활성을 나타내 었지만, 그 저해환의 크기가 뚜렷하지 않았다. 따라서 B. cereus, E. coli 및 S. enteritidis 균주들에 대하여 항균활성을 나타내는 혼합용액의 혼합비율은 chitosan/gelatin = 2/8이였고, 그때 항균 활성을 나타내는 키토산의 절대량은 0.3 mg으로 측정되었다. 또한 L.
- 4 mL를 첨가한 처리구에서 가장 높은 항균활성을 나타내었다. 따라서 S. enteritidis어洌 대한 키토산의 최소저해농도는 0.0490 mg/ mL로 나타났다. E.
- 0490 mg/mL로 측정되었다. 또한 2%(v/ v) 초산 자체의 최소저해농도를 측정한 결과, B. cereus, L. monocytogenes, E. co”에 대해서는 control과 비교시 유의적인 항균효과는 나타나지 않았다. 반면에 S.
- 발 생할수록 항균활성이 크게 나타난다고 보고하였는데, 미생물 세포벽과 결합한 키토산의 농도가 증가함에 따라 미생물 사이의 반발력이 발생하여 균주의 응집현상이 방해되었기 때문이 다(32). 또한 묽은 초산 자체의 최소저해농도를 측정한 결과, B. cereus, L. monocytogenes, E. co〃에 대해서는 control과 비교 시 유의적인 차이가 없는 것으로 항균효과는 나타나지 않았다. 반면에 S.
- 07 mm로 측정되었다. 먼저 paper disc에 혼합비율별로 각각 50pL를 분주한 경우(A)를 살펴보면, 키토산의 농도가 0%에서 10%(B. cereus, E. coli, S. enteritidis), 20%(Z. monocytogenes) 까지는 전혀 항균활성을 나타내지 않았지만, 그 농도가 20%(B. cereus, E. coli, S. enteritidis), 30%(Z. monocytogenes) 이상으로 높아질수록 항균활성이 서서히 증가하는 경향을 보였다. L.
- 이렇게 키토산이 항균효과를 나타내는 것은 키토산을 초산 수용액에 용해시킴으로써 아미노기가 초산과 조염 결합하여 암 모늄염(-NHJ)의 형태로 되기 때문에 항균활성을 갖는다. 즉, 용해되지 않은 키토산은 항균효과가 발휘되지 못하며 유기 또는 무기산에 의해 용해되어야만 항균효과가 나타날 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한 키토산은 지구상에 존재하는 많은 biopolymer들 중에서도 매우 드물게 polycationic amine을 가지고 있기 때문에 세균의 세포벽에 존재하는.
- 키토산과 젤리틴의 혼합비율에 따른 혼합용액의 항균활성을 paper diflbsion method로 측정한 결과, Fig. 2(A, B)에서와 같이 혼합용액을 50 hL, 75 gL로 흡수시켰을 때 저해환의 크기는 8- 18.07 mm로 측정되었다. 먼저 paper disc에 혼합비율별로 각각 50pL를 분주한 경우(A)를 살펴보면, 키토산의 농도가 0%에서 10%(B.
- 07mm로 측정되었다. 키토산의 농도가 0%에서 10%(8. cereus, E. coli, S. enteritidis), 20%(Z. momcytogenes)까지는 전혀 항균활성을 나타내지 않았 지만, 그 농도가 20%(B. cereus, E. coli, S. enteritidis), 30%(L monocytogenes) 이상으로 높아질수록 항균활성이 서서히 증가하는 경향을 보였다. L.
- 또한 키토산의 용매로 사용된 2%(v/v) 초산의 항균효과를 측정하였다. 혼합비율별로 제조된 키토산/젤리틴 혼합용액을 이용하여 paper diffusion method로 paper disc(8 mm)에 50 pL, 75 μL/씩 분주시 켜 항균활성을 측정한 결과, 저해환의 크기는 8mm에서 18.07mm로 측정되었다. 키토산의 농도가 0%에서 10%(8.
후속연구
- 따라서 본 연구에서는 키토산과 젤라틴을 이용하여 혼합비율에 따라 혼합용액을 제조하여 paper difliision method를 통해 항균활성 여부 및 최대 적정 혼합비율을 측정하였고, optical density method로 항균활성을 나타내는 키토산의 최소저해농도를 측정하였다. 또한 향후 대량생산을 위해 resin으로 제조한 다음, 이 resin을 이용하여 압출 성형기(extruder)로 항균활성을 지니는 생고분자 필름 개발 및 대량생산 시스템 공정 확립에 그 기초 자료로 활용하 고자 한다.
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