[논문]감초 추출물이 항생제 내성균주의 항균활성에 미치는 영향

이지원; 지영주; 유미희; 임효권; 황보미향; 이인선

감초 추출물이 항생제 내성균주의 항균활성에 미치는 영향
Antimicrobial Effect of Extract of Glycyrrhiza uralensis on Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.37 no.3 = no.181, 2005년, pp.456 - 464

이지원 (계명대학교 식품가공학과) , 지영주 (계명대학교 식품가공학과) , 유미희 (계명대학교 식품가공학과) , 임효권 (계명대학교 식품가공학과) , 황보미향 (계명대학교 식품가공학과) , 이인선 (계명대학교 전통미생물자원개발 및 산업화연구센터)

초록
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본 연구에서는 최근 전세계적으로 문제가 되고 있는 항생제 내성균에 대해 그 항균효과를 천연의 약용식물을 이용하여 분자생물학적 수준에서 비교해보고 천연항균제의 개발에 우선하여 직접 식품에 첨가하여 그 효과를 검색하고자 하였다. 병원내감염의 주된 원인균으로 알려진 황색포도상구균(Staphylococcusaureus)은 여러 항균제에 대하여 내성을 획득함으로써 질병의 치료를 어렵게 한다는 점에서 매우 심각한 문제이다. 이러한 내성균은 다양한 방법으로 동 식물에 빠르게 전파되고 있으므로 소비자가 내성균을 지닌 식품을 섭취해 잠재적인 내성균을 보유하게 되는 결과를 낳게 된다. 이러한 항생제 내성 황색포도상구균(Methicillin Resistant S. aureus, MRSA)에 대해 천연 약용 식물 중 우수한 항균력을 가지는 감초를 순차 분획하여 각 분획물을 이용한 MRSA에 대한 항균 활성을 알아본 결과 hexane, chloroform 분획물에서 항균활성을 나타냈으며, 동일농도의 생육저해비교 실험에서 대부분의 내성균주에 대해 대조군과 유사한 효과를 나타낸 penicillin에 비해 감초분획물이 대수기를 넘는 억제효과를 나타내었으며 이 중 chloroform 분획물이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 또한 RT-PCR을 통하여 표준균주와 내성균주의 내성 정도와 내성 유전자를 관찰해본 결과 KCCM 40510은 내성획득유전자인 mecA, mecRI, mecI, femA에 발현이 높게 나타나 고도내성균임을 알 수 있었으며, 고도내성을 나타내는 균주를 이용하여 감초의 chloroform 분획물을 농도별로($50,\;100,\;250\;{\mu}/mL$) 처리한 결과 농도 의존적으로 유전자 발현이 억제됨을 볼 수 있었다. 특히 고도내성균주인 KCCM 40510은 메티실린 내성을 상승시키는 mecA 유전자의 발현을 억제시키는 mecRI 유전자의 pathway와 상응하는 것으로 보여지므로 감초가 이러한 고도내성균에 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 SEM을 통한 형태학적 관찰을 통해 분획물 처리 시 세포벽이 파괴되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 이러한 감초추출물을 직접 식품에 첨가하여 내성 균주에 대한 억제 효과도 확인한 결과 추출물 200mg/100mL 농도에서 포도상구균에 대해 항균효과를 나타내는 것을 볼 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Antimicrobial drug-resistance is natural response to antimicrobial stress based on selection, which weakens chemotherapy effect. Introduction of large numbers of chemotherapeutic agents to clinical practice has generated strains of microorganisms that survive and multiply in vivo with high-drug concentrations. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), bacteria found in normal daily life, can be easily ingested through milk vegetables, and meats, etc. MRSA emerged in many port of the world, increasing complex clinical problems. Therefore, new agents are needed to treat MRSA. Glycyrrhiza uralensis was extracted using 80% MeOH to investigate its antimicrobial activity against MRSA stains KCCM 11812, 40510, and 40512 through bacterial measurement, disc diffusion, and O.D. methods, MIC values, MRSA gene expression investigation, and scanning electron microscope observation. Results revealed MecA, Mecl, MecRI, and FemA were the most highly manifested MRSA genes. Methanolic extract of G. uralensis significantly inhibited MRSA and thus could be used in development of antibacteria.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 최근 전세계적으로 문제가 되고 있는 항생제 내성균에 대해 그 항균효과를 천연의 약용식물을 이용하여 분 자생물학적 수준에서 비교해보고 천연항균제의 개발에 우선하여 직접 식품에 첨가하여 그 효과를 검색하고자 하였다. 병원 내감염의 주된 원인균으로 알려진 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)^ 여러 항균제에 대하여 내성을 획득함으로써 질병의 치료를 어렵게 한다는 점에서 매우 심각한 문제이다.
이에 본 연구에서는 감초 추출물을 이용한 내성균주의 항균 효과를 확인하고 내성 조절 유전자의 발현억제 정도를 비교하며 나아가 사람, 동물 등의 질병 치료뿐만 아니라 농 . 수산물 수확과 생산성 증가에 항 생제가 이용되므로 이를 직접 식품에 적용하여 내성 균주에 대한 천연 항균제로서의 이용 가능성을 제시하고자 한다.

제안 방법

MRSA(KCCM 40510)에 시료를 처리하여 18시간 후의 세포벽의 변화를 주사전자 현미경을 통해 관찰하였다. 각종 배양된 세포균주 배양액을 0.
0%첨가 후 1기압, 12FC에서 15분간 멸균하고 60℃ 정도로 냉각한 후 멸균된 petri-dish에 약 15mL씩 분주하였다. TSA배지에 멸균된 glass load로 균을 도말하였고 균이 도말된 배지의 표면 위에 멸균된8 mm paper disc(diameter 8 mm, Adantec Co., Japan}를' 올려 놓은 다음 syringe filter(0.2 μm)로 제균 시킨 추출물을 50 |丄씩 주입하여 최종농도가 1, 5, lOtng/disc가 되게 완전히 흡수시킨 후 37℃ incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위의 inhibition zone의 직경을 측정하였다.
5U Takara Ex. Taq polymerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP를 첨가하여 각각의 primer에 맞는 조건으로 실시하였다.
각 균을 TSB 액체 배지 10mL에 1 백금이 취해서 37℃ shaking incubator에 키워 3일 계대한 다음, 흡광도 625nm에서 72시간 동안의 생장올 측정하였다. 이는 균주의 최고 활성을 확 인 할 수 있고, 또한 활성이 높은 시기에 계대 배양함으로써 좀 더 높은 활성을 유지함과 동시에 균의 활성이 가장 높은 시 기에 항균력 test를 할 수 있게 한다.
감초 추출액의 조제는 감초 200禮 세절하여 시료의 10배 정도의 MeOH를 첨가한 뒤 24시간 3회 추출하였다. 추출액은 Whatman No.
이때 사용한 배지는 총균수 비교를 위해 standard plate count agar(PCA, Oxoid Ltd, Basingstoke, England)와 황색포도상 구균의 비교를 위해 mannitol salt agar(MSA, Ditto, Detroit, USA)배지를 사용하였다. 또한 균을 처리 하지 않은 그룹도 위와 같이 5그룹으로 나누어 동일한 방법으로 실험을 하였다.
침전물에 75% 에탄올을 첨가 하여 제거한 후 diethyl pyrocarbonate(DEPC) 처리된 증류수를 첨가하여 65℃ 수조에서 10분간 반응시켜 침전물을 녹였다. 분리된 RNA는 spectrophotometer와 1% formaldehyde agarosegel 전기영동을 이용하여 정량하고 확인하였다.
일반적으로 시장에서 판매되고 있는 상추(LacMca 闻加a)를 사용하여 실제 식품속의 내성균주에 대해 감초 추출물이 갖는 항균활성을 식품공전(32)상의 위생법을 이용하여 실험하였다. 실험은 크게 상추에 균(KCCM 40510)을 처리 한 것과 균을 처리 하지 않은 그룹으로 나누어 실험하였으며 먼저, 균을 처리 한 그룹을 다시 감초 추출물 농도별로 5군으로 나누어 상추25 g에 균 IX 104 eWIOOmL을 처리 한 후 3분 뒤에 0.85% 멸 균 생리식염수(225 mL)에 3분간 담근 후 5분간 균질화 시킨 뒤 10단계 희석법으로 희석하여 생균수를 비교측정하였다. 이때 사용한 배지는 총균수 비교를 위해 standard plate count agar(PCA, Oxoid Ltd, Basingstoke, England)와 황색포도상 구균의 비교를 위해 mannitol salt agar(MSA, Ditto, Detroit, USA)배지를 사용하였다.
추출물의 항균력 검색은 disc diffusion method 법을 실시하였다. 우선 균주는 해당 평판배지에 균주를 streaking하여 배양 한 후 배양된 각 균주 1백금이를 취해 10mL TSB에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 활성화 시킨 후 3일 계대 배양 후spectrophotometer(UNIKON 922, Kontron, Italy)를 이용하여 625 nm에서 측정하여 O.D.가 0.5(McFarland nephelometer)가 되 게 하여 균수를 1.5X108 cfti/mLS. 사용하였다.
10-15분간 세척하였다. 이를 1% OsO₄ (2% OsO₄:buffer=l : 1)로 1시간동안 후고정한 다음 일련의 ethanol 탈수과정과 isoamyl acetate로 치환과정을 거쳐 critical point diyer(Hitachi-HCP-2, Tokyo, Japan) 로 건조시키고 순금을 300 mm 두께로 도포한 후 주사전자현미경 (Hitachi S-450, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
최소생육저해농도는 Kudo 둥(31)의 방법을 수정하여 측정하였다. 탁도 0.
탁도 0.5를 맞춘 균을 TSB 10mL에 100叵 분주하고 감초 분획물을 syringe filter(0.2 gm pore size)로 제균 시 킨 다음, 농 도 50, 100, 250, 500, 및 1000mg/mL로 처리하여 37℃ shaking incubator에서 키우면서 흡광도 625 nm에서 48시간 동안 생육억제능을 측정하였다.
최소생육저해농도는 Kudo 둥(31)의 방법을 수정하여 측정하였다. 탁도 0.5를 맞춘 균을 TSB 액체배지에 100皿 접종한 후 syringe filter(0.2 |xm pore size)로 제균한 시료를 농도별로 처리 하여 37℃ incubator에서 24시간 배양 후 육안으로 관찰하였을 때 미생물이 증식되지 않는 농도를 M1C로 결정하였다.
표준균주 ATCC 25923과 내성균주 KCCM 11812, 40510,40512를 억제하기 위한 항균활성을 검색하기에 앞서 4균주들 의 생육도를 조사하였다. 이는 균주의 최고 활성을 확인할 수 있고, 또한 활성이 높은 시기에 계대 배양함으로써 좀 더 높은 활성을 유지함과 동시에 균의 활성이 가장 높은 시기에 항균 력 test* 할 수 있게 한다.

대상 데이터

감초 메탄올추출물을 20배 (w/v)의 증류수에 녹인 후 "-hexane(hexane), chloroform(CHCl3), ethylacetate(EtOAc) 및 butanol(BuOH)을 순차적으로 3회 반복 추출하여 Fig. 1과 같이 각 용 매별로 계통 분획하였고 남은 수용성 층은 농축하여 water 분 획으로 감압농축하여 동결건조로 남은 유기용매를 휘발시킨 뒤 -201에 보관하면서 실험에 사용하였다.
8과 같다. 균수를 측정하는데 사용한 배지는 일반세균을 검출 하는 PCA배지와 S aureus 검출 유무 를 확인 하는 MSA배지를 사용하였다. MSA배지는 S.
본 실험에서 사용한 균주 Staphylococcus aureus는 표준균주 ATCC 25923, 내성균주 KCCM 11812, 40510, 및 40512를 한국미 생 물보존센터 로부터 분양받아 사용하였고, 각각의 균들etryptic soy broth(TSB, Difco, Detroit, USA)에 1 백금이 접종하여 3회 계대배양 후 성장 최적 조건에서 사용하였으며, 생균수 측정을 위한 배지는 tryptic soy agar(TSA)를, 세균을 희석하기위한 희석수로는 멸균 증류수를 사용하였다.
85% 멸 균 생리식염수(225 mL)에 3분간 담근 후 5분간 균질화 시킨 뒤 10단계 희석법으로 희석하여 생균수를 비교측정하였다. 이때 사용한 배지는 총균수 비교를 위해 standard plate count agar(PCA, Oxoid Ltd, Basingstoke, England)와 황색포도상 구균의 비교를 위해 mannitol salt agar(MSA, Ditto, Detroit, USA)배지를 사용하였다. 또한 균을 처리 하지 않은 그룹도 위와 같이 5그룹으로 나누어 동일한 방법으로 실험을 하였다.
감초 추출액의 조제는 감초 200禮 세절하여 시료의 10배 정도의 MeOH를 첨가한 뒤 24시간 3회 추출하였다. 추출액은 Whatman No. 2 여과지로 여과한 후 감압 농축하였으며 최종 적으로 각각의 농축물은 멸균한 10% DMSO(dimethylsulfoxide)용액을 용매로 하여 사용하였다.

이론/모형

3. Antimicrobial effect of G uralensis fractions (hexane, CHCl3) using disc diffusion method.
Total RNA는 내성균주를 18시간 배양하여 분리하였다. TRI reagent(Molecular Research Center, Inc.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 배양된 균주에서 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.
그러나 액체배지배양 법에서 혼탁도의 측정은 균의 증식양상은 관찰할 수 있으나 정확한 항균정도를 확인할 수 없었다. 이를 보완하기 위해 일반적으로 시장에서 판매되고 있는 상추Qactuca sativa)를 사용하여 실제 식품속의 내성균주에 대해 감초 추출물이 갖는 항균활 성을 식품공전 상의 방법(33)을 이용하여 항균효과를 관찰하였다.
일반적으로 시장에서 판매되고 있는 상추(LacMca 闻加a)를 사용하여 실제 식품속의 내성균주에 대해 감초 추출물이 갖는 항균활성을 식품공전(32)상의 위생법을 이용하여 실험하였다. 실험은 크게 상추에 균(KCCM 40510)을 처리 한 것과 균을 처리 하지 않은 그룹으로 나누어 실험하였으며 먼저, 균을 처리 한 그룹을 다시 감초 추출물 농도별로 5군으로 나누어 상추25 g에 균 IX 104 eWIOOmL을 처리 한 후 3분 뒤에 0.
추출물의 항균력 검색은 disc diffusion method 법을 실시하였다. 우선 균주는 해당 평판배지에 균주를 streaking하여 배양 한 후 배양된 각 균주 1백금이를 취해 10mL TSB에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 활성화 시킨 후 3일 계대 배양 후spectrophotometer(UNIKON 922, Kontron, Italy)를 이용하여 625 nm에서 측정하여 O.
항생제 내성 균주에 대한 감초 추출물의 항균작용을 검색하기 위해 액체 배지 희석법을 이용하여 시료의 최소억제농도 (MIC)를 측정하였다. 그 결과, Table 2와 같이 표준균주인 ATCC 25923의 경우 0.

성능/효과

4는 감초 분획물중 항균효과에서 활성을 나타낸 hexane, CHCl3 분획물을 가지고 내성균주의 생육억제 정도를 관찰한 결과이다. 48시간동안 100ug/mL의 동일한 농도의 시료로 저 해정도를 비교 관찰한 결과, 4균주 모두에서 hexane, CHCl, 분 획물이 대수기를 지난 시점까지 고른 저해능을 보였으며, ATCC 25923균주는 24시간이후에 생육증식이 회복되었으며, KCCM 11812는 12시간, KCCM 40510과 40512는 24시간 이후에 증식 이 회복되는 경향을 나타냈다. 또한 내성균주가 아닌 ATCC 25923균주는 penicillin에 대해 생육저해능이 확인되는 반면 나머지 내성균주에 대해서는 생육저해능이 확인되지 않았으며, 분획물을 처리 하지 않은 대조군과 유사한 경향을 나타내었다.
PCR결과를 통해 가장 뚜렷한 내성을 보이는 KCCM 40510 올 SEM(Scanning electron microscope: 주사전자현미경)올 통하여 30, 000배율에서 관찰해 본 결과, Fig. 1에서 보는 것과 같이 균의 형태가 뚜렷한 포도상구균임을 볼 수 있었다. 여기에 감 초의 CHC₁₃ 분획물 의 농도를 250ug/mL 처리한 후, 이것을 30, 000배율에서 관찰한 결과 Fig.
RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)를 이용하여 내성발현유무를 살펴본 결과 Fig. 5에서 보는 것과 같이 표준균주 ATCC 25923을 비롯하여 내성균주 KCCM 11812, 40510, 40512에서는 mecA, meet, mecRI, 湖유전자를 볼 수 없었으나, KCCM 40510에서는 4가지 유전자가 뚜렷하게 나타나는 것을 볼 수 있었다.
항생제 내성 균주에 대한 감초 추출물의 항균작용을 검색하기 위해 액체 배지 희석법을 이용하여 시료의 최소억제농도 (MIC)를 측정하였다. 그 결과, Table 2와 같이 표준균주인 ATCC 25923의 경우 0.18mg/mL 범위로 MIC가 측정되었고, 내성균주들에 대해서 0.20, 0.22mg/m丄로 측정되었다. 특히 내성균주 중 KCCM 40510 균주에서 대체로 높은 MIC값을 보였다.
내성 균주의 중식억제를 위한 감초 추출물의 최소 농도가 penicillin보다 효과가 좋음을 확인하였다. 그러나 액체배지배양 법에서 혼탁도의 측정은 균의 증식양상은 관찰할 수 있으나 정확한 항균정도를 확인할 수 없었다.
1XI02 cfU/mL로 크게 감소하였다. 따라서 추출물의 농도를 높게 할수록 균수가 감소하는 항균효과를 확인할 수 있었으며 그 외 균처리를 하지 않은 군에서도 균처리를 한 것과 비슷한 효과를 볼 수 있었다.
표준균주인 ATCC 25923은 유 도기가 거의 없이 대수기가 10시간 정도로 다른 균들의 15-20 시간에 비해 상당히 빠른 것을 볼 수 있었고 대수기 이후에는 균의 활성이 거의 없었다. 또 내성균주인 KCCM 11812, 40510 의 경우 0-10시간 정도의 유도기를 거친 후 대수기가 나타나는 것을 볼 수 있었으며, KCCM 40512의 경우에는 다른 균들 에 비해 균의 활성이 천천히 일어나 유도기가 짧으며 유도기 이후 대수기 때는 균이 급격하게 활성을 나타냄을 볼 수 있었다.
aureus, MRSA)에 대해 천연 약용 식물 중 우수한 항균력을 가지는 감초를 순차 분획하여 각 분획물을 이용한 MRSA에 대한 항균 활성을 알아본 결과 hexane, chloroform 분획물에서 항균활성을 나타냈으며, 동일농 도의 생육저해비교 실험에서 대부분의 내성균주에 대해 대조 군과 유사한 효과를 나타낸 penicillin에 비해 감초분획물이 대 수기를 넘는 억제효과를 나汀내었으며 이 중 chloroform 분획물이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 또한 RT-PCR을 통하여 표준균주와 내성균주의 내성 정도와 내성 유전자를 관찰해 본 결과 KCCM 40510은 내성획득유전자인 mecA, mecRI, mecl, 龙湖에 발현이 높게 나타나 고도내성균임을 알 수 있었으며, 고도내성을 나타내는 균주를 이용하여 감초의 chloroform 분획 물을 농도별로(50, 100, 250 ng/mL) 처리한 결과 농도 의존적 으로 유전자 발현이 억제됨을 볼 수 있었다. 특히 고도내성균 주인 KCCM 40510은 메티실린 내성을 상승시키는 mecA 유전 자의 발현을 억제시키는 mecRI 유전자의 pathway와 상응하는 것으로 보여지므로 감초가 이러한 고도내성균에 효과가 있음을 알 수 있었다.
특히 고도내성균 주인 KCCM 40510은 메티실린 내성을 상승시키는 mecA 유전 자의 발현을 억제시키는 mecRI 유전자의 pathway와 상응하는 것으로 보여지므로 감초가 이러한 고도내성균에 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 SEM을 통한 형태학적 관찰을 통해 분 획물 처리 시 세포벽이 파괴되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 이러한 감초추출물을 직접 식품에 첨가하여 내성 균주에 대한 억제 효과도 확인한 결과 추출물 200mg/100mL 농도에서 포 도상구균에 대해 항균효과를 나타내는 것을 볼 수 있었다
095X103 cfU/mL로 황색 포도상구균에 대한 결과와 유사하게 일반세균 의 수도 감소했다. 또한 균을 처리 하지 않은 군에서도 위와 비슷한 양상을 보여 내성균주에 대한 감초 추출물의 농도가 200mg/l00mL 이상에서 항균효과가 있는 것으로 확인되며, 내성균주 뿐만이 아니라 일반세균에도 항균효과가 있는 것으로 생각되어 진다(data not shown).
감초 분획물로 항균효과를 검색한 결과 Table 3에서 보는 것과 같이 EtOAc, BuOH, aqueous 층에서는 inhibition zone이 전혀 나타나지 않아 이들 용매충에서는 항균효과가 확인 되지 않았다. 반면, CHC₁₃ 층에서는 표준균주와 내성균주 모두 1 mg/ disc 농도에서는 11-14 mm, 2mg/disc에서는 13-16 mm® 나타냈 고, hexane 충도 1 mg/disc 농도에서는 11-13 mm, 2mg/disc에서 알 수 있고 동일농도에서 천연항균물질인 감초 분획물 보다 저 해능이 우수하지 못했다. 즉, 감초 분획물이 항생제보다 낮은 농도로 항균효과를 가짐을 알 수 있다.
1에서 보는 것과 같이 균의 형태가 뚜렷한 포도상구균임을 볼 수 있었다. 여기에 감 초의 CHC₁₃ 분획물 의 농도를 250ug/mL 처리한 후, 이것을 30, 000배율에서 관찰한 결과 Fig. 7에서 보는 것과 같이 감초 처리로 인하여 포도상구균의 형태가 세포벽이 파괴되는 등, 세포의 모양이 흐트러져 원래 구균의 형태를 유지하지 못하고 있는 것을 볼 수 있었다. 따라서 감초 분획물이 내성균주의 형태를 파괴시켜 메티실린 내성을 감소시키는데 효과가 있는 것으로 생각되어 진다.
특히, KCCM 40510균주의 경우 36시간까지 균의 증식을 저해 하였는데 결과에서도 보듯이 동일 농도의 양성대조군 penicillin 보다 더 나은 저해능을 보였다. 이것은 NCCLS 기준에 의하면 penicillin 내성을 MIC 0.1 gg/mL 이상으로 정의하고 있는데 (36,37) 본 실험은 MIC 기준보다 1,000배 높은 농도의 penicillin 에서도 균주의 생육이 가능한 것으로 보아 고도내성균주임을 알 수 있고 동일농도에서 천연항균물질인 감초 분획물 보다 저 해능이 우수하지 못했다. 즉, 감초 분획물이 항생제보다 낮은 농도로 항균효과를 가짐을 알 수 있다.
메탄올로 추출한 감초 파우더를 극성이 다른 용매 hexane 및 chloroform, ethyl acetate, butan이로 분획했을 때 수득량은 다음과 같다. 이들올 메탄올 추출물에 대해 차지하는 비율로 환산하면 butanol 19.15%, chloroform 17.30%, hexane 14.65%, ethylacet전e 1.95%, aqueous 10.55% 순으로 높게 나타났다.
식물에 빠르게 전파되고 있으므로 소비자가 내성균을 지닌 식품을 섭취해 잠재적인 내성균 을 보유하게 되는 결과를 낳게 된다. 이러한 항생제 내성 황색포도상구균(Methicillin Resistant S. aureus, MRSA)에 대해 천연 약용 식물 중 우수한 항균력을 가지는 감초를 순차 분획하여 각 분획물을 이용한 MRSA에 대한 항균 활성을 알아본 결과 hexane, chloroform 분획물에서 항균활성을 나타냈으며, 동일농 도의 생육저해비교 실험에서 대부분의 내성균주에 대해 대조 군과 유사한 효과를 나타낸 penicillin에 비해 감초분획물이 대 수기를 넘는 억제효과를 나汀내었으며 이 중 chloroform 분획물이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 또한 RT-PCR을 통하여 표준균주와 내성균주의 내성 정도와 내성 유전자를 관찰해 본 결과 KCCM 40510은 내성획득유전자인 mecA, mecRI, mecl, 龙湖에 발현이 높게 나타나 고도내성균임을 알 수 있었으며, 고도내성을 나타내는 균주를 이용하여 감초의 chloroform 분획 물을 농도별로(50, 100, 250 ng/mL) 처리한 결과 농도 의존적 으로 유전자 발현이 억제됨을 볼 수 있었다.
이에 4가지 유전자가 모두 발견된 고도내성균인 KCCM 40510 을 감초의 분획물 중 가장 효과가 좋았던 CHC₁₃ 분획물을 농 도별로(50, 100, 250ng/mL) 처리하여 관찰한 결과 Fig. 6에서 보는 것과 같이, 항생제 내성유전자 成函의 경우 감초 분획물 의 처리 농도가 높을수록 발현이 억제되는 것을 볼 수 있고, mecR유전자를 유도시키는 mecR/유전자 또한 농도 의존적으로 발현이 억제 되는 것을 볼 수 있다. 또한 세포벽 조성에 관여 하여 메티실린 내성에 연관이 있는 ㎛以유전자도 농도 의존적 으로 발현이 억제되고 있음올 알 수 있다.
일반세균 검출의 결과를 보면, 균을 처리한 대조군은 3.42X 104 chi/mL에서 감초추출물 200mg/100mL 처리시 5.095X103 cfU/mL로 황색 포도상구균에 대한 결과와 유사하게 일반세균 의 수도 감소했다. 또한 균을 처리 하지 않은 군에서도 위와 비슷한 양상을 보여 내성균주에 대한 감초 추출물의 농도가 200mg/l00mL 이상에서 항균효과가 있는 것으로 확인되며, 내성균주 뿐만이 아니라 일반세균에도 항균효과가 있는 것으로 생각되어 진다(data not shown).
또한 RT-PCR을 통하여 표준균주와 내성균주의 내성 정도와 내성 유전자를 관찰해 본 결과 KCCM 40510은 내성획득유전자인 mecA, mecRI, mecl, 龙湖에 발현이 높게 나타나 고도내성균임을 알 수 있었으며, 고도내성을 나타내는 균주를 이용하여 감초의 chloroform 분획 물을 농도별로(50, 100, 250 ng/mL) 처리한 결과 농도 의존적 으로 유전자 발현이 억제됨을 볼 수 있었다. 특히 고도내성균 주인 KCCM 40510은 메티실린 내성을 상승시키는 mecA 유전 자의 발현을 억제시키는 mecRI 유전자의 pathway와 상응하는 것으로 보여지므로 감초가 이러한 고도내성균에 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 SEM을 통한 형태학적 관찰을 통해 분 획물 처리 시 세포벽이 파괴되는 것을 확인할 수 있었다.
22mg/m丄로 측정되었다. 특히 내성균주 중 KCCM 40510 균주에서 대체로 높은 MIC값을 보였다.
또한 내성균주가 아닌 ATCC 25923균주는 penicillin에 대해 생육저해능이 확인되는 반면 나머지 내성균주에 대해서는 생육저해능이 확인되지 않았으며, 분획물을 처리 하지 않은 대조군과 유사한 경향을 나타내었다. 특히, KCCM 40510균주의 경우 36시간까지 균의 증식을 저해 하였는데 결과에서도 보듯이 동일 농도의 양성대조군 penicillin 보다 더 나은 저해능을 보였다. 이것은 NCCLS 기준에 의하면 penicillin 내성을 MIC 0.
Table 4에서 보는 것과 같이 감초 분획물 중 EtOAc, BuOH, aqueous 층이 1 mg/mL의 높은 농도에서도 항균이 전혀 나타나 지 않았다. 표준균주인 ATCC 25923은 hexane, CHCl3, penicillin 에서 MIC가 0.1 mg/mL로 내성균주에 비해 낮게 나타났으며, 내성균주들은 hexane에서 MIC가 0.25 mg/mL로 동일하게 나타났고, CHCl3 층에서는 hexane 층보다 낮은 0.10-0.12 mg/mL로 나타나 chci3 층에서 항균효과가 더 좋음을 보였다. 특히 chci3 층이 penicillin보다 2.
유도기는 0-10시 간까지로 나타났으며 대수기는 15-20시간 사이로 나타났으며 그 이후로는 사멸기가 나타났다. 표준균주인 ATCC 25923은 유 도기가 거의 없이 대수기가 10시간 정도로 다른 균들의 15-20 시간에 비해 상당히 빠른 것을 볼 수 있었고 대수기 이후에는 균의 활성이 거의 없었다. 또 내성균주인 KCCM 11812, 40510 의 경우 0-10시간 정도의 유도기를 거친 후 대수기가 나타나는 것을 볼 수 있었으며, KCCM 40512의 경우에는 다른 균들 에 비해 균의 활성이 천천히 일어나 유도기가 짧으며 유도기 이후 대수기 때는 균이 급격하게 활성을 나타냄을 볼 수 있었다.
또한 SEM을 통한 형태학적 관찰을 통해 분 획물 처리 시 세포벽이 파괴되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 이러한 감초추출물을 직접 식품에 첨가하여 내성 균주에 대한 억제 효과도 확인한 결과 추출물 200mg/100mL 농도에서 포 도상구균에 대해 항균효과를 나타내는 것을 볼 수 있었다
황색포도상구균 결과(Fig. 9)에서 추출물을 처리 하지 않은 배지의 경우에는 균이 많이 증식하여 배지가 전체적으로 황색 을 띄는 것을 볼 수 있었고 추출물의 농도를 0-1,000mg/100 mL으로 처리했을 때 균수에서의 차이를 살펴보면, 대조구에 균 처리 후 상추의 균의 수는 I.54X 104 cfU/mL로 증식했고, 추출 물을 0mg/100mL 처리했을 때 균의 수는 2.56X10, cfa/mLS-세척만으로도 어느정도의 균수가 줄어드는 것을 알 수 있었다. 또 200 mg/100 mL처리 했을 때 균의 수는 7.

후속연구

그러나 오래 전부터 이용되어 온 생약제들은 기본적 으로 인체 안전성을 가지고 있고, 굳이 정제하거나 순수 분리 하는 과정을 생략한다고 해도 본질적으로 인체에 유용한 생리 활성 유효성분과 식품보존성 물질이 함유되어 있어 동시에 이 중의 효과를 줄 수 있을 것으로 기대된다(30). 이런 면에서 한 약재 추출물에 관한 연구들이 최근 들어 많이 수행되고 있으며, 이러한 연구들을 기초로 하여 앞으로 천연보존제의 개발도 이루어질 수 있을 것으로 예상한다. 이에 본 연구에서는 감초 추출물을 이용한 내성균주의 항균 효과를 확인하고 내성 조절 유전자의 발현억제 정도를 비교하며 나아가 사람, 동물 등의 질병 치료뿐만 아니라 농 .

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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