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문제 정의
- 돈육 포장공정은 공정상에 살균처리 과정이 없어 작업이 진행되면서 생산된 포장육의 오염은 원료도체보다 증가하는 것으로 보고 되었다(12), 저온성 세균인 L monocytogenes는 작업장 실내온도인 1SC에서 충분히 증식 가능하고 여러 작업환경 으로부터 교차오염이 발생하기 때문이며 HACCP 도입 등 위생관리 강화가 요구되는 작업장이다. 본 연구는 돈육 포장공정 에서 위생적으로 중요한 L monocytogenes를 지표균으로 하여 작업장 및 유통 환경에서의 온도와 시간을 control point로 하 여, 돈육에 오염된 L. monocytogenes의 성장을 예즉할 수 있는 모델을 개발하고 돈육포장 공정 및 유통단계에서의 과학적인 식품위생관리 기준 설정 근거를 제시하고자 하였다.
- 본 연구는 냉장돈육에서의 식중독 원인균이면서 냉장온도에서 성장이 가능한 L. moyfcgees에 대한 효과적인 위생관리를 위하여 온도 시간관계 측면에서 돈육 포장공정 및 유통조건 하에서의 L. monocytogenes 성장예즉 모델을 제시하였다. 최근 성장예측모델 개발은 과거의 배지 등을 이용한 방법이 아닌 실제 해당식품에 직접 접종하여 모델을 개발하는 방향으로 전환 되고 있다(24).
제안 방법
- 동결 보존된 분리균주를 냉장온도에서 녹인 후 TSB에 접종하여 25"C에서 24시간 동안 전배양하고 tryptic soy agar(TSA: Difco, Detroit, MI, USA)에 도말하여 24시간 배양하였다. 평판상에 성장한 균을 백금이로 사용하여 멸균생리식염수에 현탁하여 (:에서 IQOOOXg로 5분 동안 원심분리하여 cell pellet를 얻고 이를 salt peptone(0.85% NaCl, 0.05% Bacto peptone)으로 2회 세척한 후 0.1% peptone water 3 L에 용해시켜 활성배양액 을 제조하였다. Colorimeter(DR 100 Colorimeter, HACH Co.
- 1% peptone water 3 L에 용해시켜 활성배양액 을 제조하였다. Colorimeter(DR 100 Colorimeter, HACH Co., USA)를 이용하여 제조된 배양액의 균수를 5.0XI07~1.0X108 cfu/mL로 조절하였다. 이 배양액을 I.
- 표면살균 처리된 돈육을 1L의 시험균액에 침지하여 100 rpm 으로 30분 동안 shaking하면서 돈육에 시험균을 접종하였으며, 이후 표면에 견고하게 접종되지 않은 균을 제거하기 위하여 멸균 증류수를 이용하여 3회 이상 세척하고 clean bench에서 건조시킨 후 실험설계에 따른 조건별로 배양하였다. 이때 일부 돈육은 배양시키지 않고 바로 시험하였으며 이를 계수하여 초기균수를 산정하였다.
- , USA)를 이용하여 plating한 후 25P에서 48시간 배양하였다. 배양 후 grid를 이용하여 area당 20~40개의 전형적인 집락이 있는 균수를 개수한 후 대칭이 되는 area의 균수와 합산하여 균수를 산줄하였다. 최종 성장실험결과는 SAS(Statistical Analysis System, Ver 8.
- Gompertz equation의 변수인 A, C, B, Me Guass-Newton iteration을 적용시킨 SAS의 non-linear regression 프로그램을 활용하여 산출하였다. 이 산출된 A, C, B, M을 이용하여 Table 1(14)의 식에 의거 대수성장율(EGR: exponential growth rate, Log(cfu/g)/hr), 세대시간(GT: generation time, hr), 잠복기간(LPD: lag phase duration, hr), 최대 균수(MPD: Maximum population density, Log(cfu/g/hr))를 계산하였다(15, 16). 한편 B, M의 경우는 SAS의 Response surface analysis에 의해 온도에 따른 회귀 방정식을 산출하였다.
- Table 3의 Gompertz 값 B와 M을 이용하여 온도를 주요 환경인자로 선정한 surface-response 분석 결과는 Table 4와 같다. 모델적합성(9)이 M값의 경우 0.9482, B값의 경우는 0.9266으로 높게 나타났으며, 또한 M, B 값 모두 통계적으로 모두 유의하였다0gees의 성장정도를 주정하기 위하여 냉장돈육에서의 L. monocytogenes 성장예측 모델을 다음식과 같이 개발하였다.
- 개발된 모델에 대한 검증방법은 두 가지로 나눌 수 있는데 그 하나는 특정한 조건에서의 미생물의 증식값을 기존의 다른 모델과 비교하는 방법이고 다른 하나는 특정한 조건에서의 개발된 모델의 증식값과 직접 실험에 의한 결과 값을 비교하는 방법이다. 본 연구에서는 개발된 모델에 대한 검증방법으로 GT, LPD, EGR에 대한 실험값(observed)과 예측값(predicted)을 비교하였다. 그 결과는 Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 균주는 돈육포장 공정(강원도 소재)에서분리, 동정한 야생균주(native type) L. monocytogenes KL 101 을 사용하였다. 시료에서 분리된 L.
- , Hazelwood,USA)를 이용한 확인시험에서도 Listeria monocytogenes로 판명 되었으며 혈청형 실험결과 l/2a로 확인되었다. 본 연구에서는 돈육포장 공정중의 Listeria monocytogenes의 성장을 예즉하기 위하여 실제 가공 현장 환경조건에 적응된 야생균주를 사용하였다. 분리된 균주는 10% glycerol을 첨가한 tryptic soy broth (TSB: Difco, Detroit, MI, USA)에 넣어 -70。(2의 급속냉동고 (VWR 4503C, VWR Co.
- 본 연구에서는 돈육포장 공정중의 Listeria monocytogenes의 성장을 예즉하기 위하여 실제 가공 현장 환경조건에 적응된 야생균주를 사용하였다. 분리된 균주는 10% glycerol을 첨가한 tryptic soy broth (TSB: Difco, Detroit, MI, USA)에 넣어 -70。(2의 급속냉동고 (VWR 4503C, VWR Co., USA)에 동결 보존하여 사용하였다.
- 돈육은 안심을 서울지역의 일반시장 정육점에서 냉장육 상태로 두께 0.5 cm, 가로, 세로 각각 5 cm의 크기로 구입하였으며 돈육에 부착되어 있는 자연균총을 제거하기 위하여 Ukuku 등(13)에서 사용한 방법을 활용하였다. 구입한 돈육은 70% 에 탄올을 이용하여 10℃의 shaking incubator 에서 100rpm으로 1분간 표면 살균처리 한 후 clean bench에서 내부공기를 순환시키며 15분 정도 방치하여 표면의 수분을 제거한 후 시료로 사용하였다.
- 5 cm, 가로, 세로 각각 5 cm의 크기로 구입하였으며 돈육에 부착되어 있는 자연균총을 제거하기 위하여 Ukuku 등(13)에서 사용한 방법을 활용하였다. 구입한 돈육은 70% 에 탄올을 이용하여 10℃의 shaking incubator 에서 100rpm으로 1분간 표면 살균처리 한 후 clean bench에서 내부공기를 순환시키며 15분 정도 방치하여 표면의 수분을 제거한 후 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 배양 후 grid를 이용하여 area당 20~40개의 전형적인 집락이 있는 균수를 개수한 후 대칭이 되는 area의 균수와 합산하여 균수를 산줄하였다. 최종 성장실험결과는 SAS(Statistical Analysis System, Ver 8.1, Coiy, NC, USA)의 ANOVA Duncan 검정(p<0.05)을 이용하여 통계적인 유의성을 검증하였다.
- 의 성장곡선은 실험설계에 따른 성장실험결과를 바탕으로 Gompertz equation에 의해 생성하였다. Gompertz equation의 변수인 A, C, B, Me Guass-Newton iteration을 적용시킨 SAS의 non-linear regression 프로그램을 활용하여 산출하였다. 이 산출된 A, C, B, M을 이용하여 Table 1(14)의 식에 의거 대수성장율(EGR: exponential growth rate, Log(cfu/g)/hr), 세대시간(GT: generation time, hr), 잠복기간(LPD: lag phase duration, hr), 최대 균수(MPD: Maximum population density, Log(cfu/g/hr))를 계산하였다(15, 16).
- /noRocytogefies의 성장균수(Log cfWg)를 산출하였다. 최종적으로 개발된 모델에 대한 검증eSmith-Simpson 등(17)에서 사용한 방법을 이용하여 GT, LPD, EGR에 대한 실험값(observed)과 예측값(predicted)의 비교를 통하여 실시하였다.
이론/모형
- 돈육에서의 L. 의 성장곡선은 실험설계에 따른 성장실험결과를 바탕으로 Gompertz equation에 의해 생성하였다. Gompertz equation의 변수인 A, C, B, Me Guass-Newton iteration을 적용시킨 SAS의 non-linear regression 프로그램을 활용하여 산출하였다.
- 한편 B, M의 경우는 SAS의 Response surface analysis에 의해 온도에 따른 회귀 방정식을 산출하였다. 이 회귀방정식을 Gompertz equation에 적용하여 온도와 시간에 따른 L. /noRocytogefies의 성장균수(Log cfWg)를 산출하였다. 최종적으로 개발된 모델에 대한 검증eSmith-Simpson 등(17)에서 사용한 방법을 이용하여 GT, LPD, EGR에 대한 실험값(observed)과 예측값(predicted)의 비교를 통하여 실시하였다.
- 병원성미생물의 성장에 관한 모델은 probability-based model 과 kinetics-based model의 두 가지로 구분된다. Probabilitybased modele 주로 포자형성균에 적용하며, kinetics-based modele 비포자형성균에 적용하는데(20), 따라서 본 연구에서는 비포자형성균인 L. monocytogenese 대해서 kinetics-based model을 사용하였다. Kinetics-based model에는 square root, linear Arrhenius, non-linear Arrhenius model 등이 있으며, 이들 모델 중 square root model이 가장 광범위하게 연구되어 왔다.
- 위의 모델들은 온도 등 단순한 인자만을 이용하는 모델이지만 이들 모델에 비하여 여러 환경인자를 고려하기 위하여 polynomial 또는 response surface regression 등통계적인 접근을 시도하고 있으며, 여기에 “best-fit”를 나타내기 위한 non-linear regression의 접목으로 여러 다양한 인자들을 동시에 고려할 수 있는 모델 생성이 가능하게 되었다. 이러한 모델 생성에 대표적으로 이용되고 있는 것이 Gompertz equation(Table 1)이며, 본 연구에서도 이식을 이용하였다. 미생물 성장관련 인자는 돈육을 대상으로 한 Mann 등(22)의 연구결과를 바탕으로 온도와 시간으로만 선정하였다.
- 이러한 모델 생성에 대표적으로 이용되고 있는 것이 Gompertz equation(Table 1)이며, 본 연구에서도 이식을 이용하였다. 미생물 성장관련 인자는 돈육을 대상으로 한 Mann 등(22)의 연구결과를 바탕으로 온도와 시간으로만 선정하였다. 하지만 온도의 조건은 미생물 성장에 적정한 온도가 아닌 작업장의 낮은 온도를 이용하였고, 온도와 시간만으로 성장예측 모델을 만든 Buchanan 등(23)의 방법을 참조하였다.
- 미생물 성장관련 인자는 돈육을 대상으로 한 Mann 등(22)의 연구결과를 바탕으로 온도와 시간으로만 선정하였다. 하지만 온도의 조건은 미생물 성장에 적정한 온도가 아닌 작업장의 낮은 온도를 이용하였고, 온도와 시간만으로 성장예측 모델을 만든 Buchanan 등(23)의 방법을 참조하였다.
성능/효과
- monocytogenes KL 101 을 사용하였다. 시료에서 분리된 L. monocytogenes KL 101의 생화학적 성상은 GPI(Gram Positive Identification) card를 사용하여 Vitek(Vitek Jr. System, bioMerieux Vitek, Inc., Hazelwood, USA)으로 판정한 결과 대조균으로 사용한 L monocytogenes ATCC 15313과 일치하였으며 hemolysis와 Staphylococcus wrei/s와의 CAMP 실험에서 양성을 나타냈다. 또한 VIDAS(mini VIDAS System, bioMerieux Vitek, Inc.
- , Hazelwood, USA)으로 판정한 결과 대조균으로 사용한 L monocytogenes ATCC 15313과 일치하였으며 hemolysis와 Staphylococcus wrei/s와의 CAMP 실험에서 양성을 나타냈다. 또한 VIDAS(mini VIDAS System, bioMerieux Vitek, Inc., Hazelwood,USA)를 이용한 확인시험에서도 Listeria monocytogenes로 판명 되었으며 혈청형 실험결과 l/2a로 확인되었다. 본 연구에서는 돈육포장 공정중의 Listeria monocytogenes의 성장을 예즉하기 위하여 실제 가공 현장 환경조건에 적응된 야생균주를 사용하였다.
- 20℃(:를 제외한 대부분의 온도에서는 접종 후 3시간까지는 성장경향을 나타내지 않았으며 일부 온도 범위에서는 약간씩 감소하는 것으로 나타났다. 특히 0℃의 경우는 처음부터 감소하는 것으로 나타났으며, 5℃와 1(FC의 경우, 18시간 이후부터는 각각의 온도 범위별로 증가하는 경향을 나타냈는데, 특히 48시간 이후의 증식은 통계적으로 유의한 수준이었다. 이는 실험에 이용한 L.
- monocytogenes는 10℃ 이하의냉장 저장 중인 여러 식육 및 가공식품에서 성장하는 것으로 알려져 있다(18, 19). 따라서 돈육의 저장 및 유통과정에서 냉장 온도를 잘 관리하더라도 시간 경과에 따라서 L monocytogenes는 증식이 가능하므로, 돈육생산단계에서의 안전성 확보와 유통과정상의 위생적인 취급의 중요성을 확인할 수 있었다. 한편 15℃ 20℃FC의 경우도 18시간 이후부터는 성장이 크게 증가하는 것으로 나타났다.
- LPD는 미생물이 새로운 환경에 적응하고 성장을 시작하기 위하여 주위환경에 적용하는 기간으로 볼 수 있다. 본 연구에서 LPD는 5℃(:에서 가장 높은 43.3시간을 나타냈고, 온도가 증가할수록 점차 감소하여 2(TC에서는 16.5시간을 나타냈다(Table 3). 이러한 결과는 표준균주를 사전에 5℃에서 pre-incubation시 킨 후 다시 5℃ tryptose phosphate broth에서 LPD 값을 측정한 Buchanan 등(23)의 결과인 36.
- 1~3에서 보는 바와 같이 실험값과 예측값이 어느 정도 일치를 하고 있어 모델에 대한 신뢰성이 높은 것으로 판단된다. 즉, CT의 경우 상관계수(r) = 0.99324, 모델 적합성 (R2)= 0.9865로, LPD의 경우는 r= 0.99835, R2 = 0.9967, EGR의 경우는 r = 0.99291, 2=0.9859로 나타났고 GT, LPD, EGR 모두 통계적으로 유의하였다0.01).
- 최근 성장예측모델 개발은 과거의 배지 등을 이용한 방법이 아닌 실제 해당식품에 직접 접종하여 모델을 개발하는 방향으로 전환 되고 있다(24). 이러한 관점에서 볼 때 본 연구는 최초로 돈육에 예측미생물학 기법을 적용한 것으로 볼 수 있으며 더욱이 표준균주가 아닌 돈육포장공정에서 분리한 야생균주를 이용하였다는 점에서 그 의미가 크다고 할 수 있다. 하지만 본 성장예측모델의 실제 적용에 있어서는 몇 가지 한계를 지니고 있다.
- 하지만 몇몇 한계에도 불구하고 본성장예측 모델은 우선적으로 냉장돈육 포장공정에 HACCP 시스템 적용시 Critical Control Point 및 한계기준 설정에 활용될 수 있다(6, 25, 26), 또한 미생물위해성평가(Microbial risk assessment) 수행과정에서 exposure assessment를 위한 simulation model에 접목하면 원료 돈육생산에서 유통에 이르는 전 과정에서 온도-시간 조건별 L monocytogenes 성장 가능성 주정이 가능하며, 이를 근거로 냉장돈육 유통과정의 위생관리 온도 및 시간설정에 활용이 가능할 것으로 보인다. 또한 본 모델에서는 초기 오염균수를 실제 오염수준보다 높은 수준의 균량을 접종하였지만 이전의 성장예측모델과 관련한 연구보고(27, 28)에서 모델 개발에 영향이 없는 것으로 밝혀져 본 모델의 경우에도 초기 오염균수에 관계없이 적용이 가능한 것으로 보인다.
후속연구
- 이는 앞서 언급된 것과 같이 Mann등(21)의 연구결과와 다른 가공식품과 달리 돈육포장공정의 경우 열처리나 식품첨가물의 첨가 등이 없는 단순 공정으로 이루어지기 때문에 미생물성장과 관련하여 온도와 시간만을 중요인자로 선정하였다. 하지만 돈육의 pH나 수분활성도 등도 중요한 영향인자로 작용할 수 있을 것으로 보이며 어느 정도의 영향을 미칠지는 현재로서는 정확하게 결론지울 수 없으므로 추후 이러한 인자에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다. 또한 (FC의 경우에서는 성장이 나타나지 않았으므로 이온도에서의 본 모델의 적용은 어려울 것으로 보인다.
- 하지만 몇몇 한계에도 불구하고 본성장예측 모델은 우선적으로 냉장돈육 포장공정에 HACCP 시스템 적용시 Critical Control Point 및 한계기준 설정에 활용될 수 있다(6, 25, 26), 또한 미생물위해성평가(Microbial risk assessment) 수행과정에서 exposure assessment를 위한 simulation model에 접목하면 원료 돈육생산에서 유통에 이르는 전 과정에서 온도-시간 조건별 L monocytogenes 성장 가능성 주정이 가능하며, 이를 근거로 냉장돈육 유통과정의 위생관리 온도 및 시간설정에 활용이 가능할 것으로 보인다. 또한 본 모델에서는 초기 오염균수를 실제 오염수준보다 높은 수준의 균량을 접종하였지만 이전의 성장예측모델과 관련한 연구보고(27, 28)에서 모델 개발에 영향이 없는 것으로 밝혀져 본 모델의 경우에도 초기 오염균수에 관계없이 적용이 가능한 것으로 보인다.
- 이는 기존에 개발된 모델에서는 대상 미생물의 특성에 맞는 다양성과 변이성이 충분히 고려되지 않았기 때문이다. 본 연구에서 제시한 모델도 확률적 개념이 아닌 point estimate로 나타나므로 미생물의 다양성과 변이성을 충분히 반영하지 못한 제한성이 지적될 수 있다. 확률적 개념 도입을 위해서는 대상 미생물이 노출되는 환경조건에 따른 다양한 반응에 대한 실험적 자료 확보가 필요 한데, 여러 준비과정을 거쳐야 하는 어려움이 있겠으나 모델의 신뢰성을 높이기 위해서는 반드시 추진해야 할 과제인 것으로 판단된다
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