본 연구에서는 E. coli. Salmonella, Shigella, Vibrio 등 4속의 주요 식중독유발 그람 음성 세균들을 대상으로 반복성 염기서열인 REP DNA sequence를 응용한 REP-PCR을 실시하였다. 이전의 보고에서 이들 4속의 식중독 유발세균 중 각각 혹은 일부를 대상으로 반복성 염기서열을 이용한 PCR을 적용한 사례는 있지만 그때 적용한 primer, PCR 반응조건 및 전기영동조건 등이 다양하였다. 그러므로 본 연구에서는 이와같은 4속의 세균들에 대하여 최적화된 동일한 primer와 PCR 반응조건 및 전기영동조건을 표준조건으로서 적용하였다. 그 결과로서 모든 4속의 식중독 세균 균주마다 REP-PCR 후 생성되는 fingerprinting pattern에서 속마다 1-3개의 공통적이며 독특한 band가 생성되는 것이 확인되어 이러한 pattern을 이용한 속 수준의 분리 동정과 그와 같은 주요 band들 이외의 부수적인 band들을 고려하여 종 수준까지의 분리도 가능함을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통하여 반복적 DNA 염기서열을 이용한 REP-PCR이 주요 식중독 세균의 분리 동정 방법으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한 본 연구를 통하여 얻은 결과는 더 많은 속(genus)의 식중독세균을 대상으로 한 새로운 분리 동정 방법을 확립하기 위하여 사용될 수 있을 것이다.
본 연구에서는 E. coli. Salmonella, Shigella, Vibrio 등 4속의 주요 식중독유발 그람 음성 세균들을 대상으로 반복성 염기서열인 REP DNA sequence를 응용한 REP-PCR을 실시하였다. 이전의 보고에서 이들 4속의 식중독 유발세균 중 각각 혹은 일부를 대상으로 반복성 염기서열을 이용한 PCR을 적용한 사례는 있지만 그때 적용한 primer, PCR 반응조건 및 전기영동조건 등이 다양하였다. 그러므로 본 연구에서는 이와같은 4속의 세균들에 대하여 최적화된 동일한 primer와 PCR 반응조건 및 전기영동조건을 표준조건으로서 적용하였다. 그 결과로서 모든 4속의 식중독 세균 균주마다 REP-PCR 후 생성되는 fingerprinting pattern에서 속마다 1-3개의 공통적이며 독특한 band가 생성되는 것이 확인되어 이러한 pattern을 이용한 속 수준의 분리 동정과 그와 같은 주요 band들 이외의 부수적인 band들을 고려하여 종 수준까지의 분리도 가능함을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통하여 반복적 DNA 염기서열을 이용한 REP-PCR이 주요 식중독 세균의 분리 동정 방법으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한 본 연구를 통하여 얻은 결과는 더 많은 속(genus)의 식중독세균을 대상으로 한 새로운 분리 동정 방법을 확립하기 위하여 사용될 수 있을 것이다.
Dispersed repetitive DNA elements in genomes of microorganisms differ among and within species. Because distances between repetitive sequences vary depending on bacterial strains, genomic fingerprinting with interspersed repetitive sequence-based probes can be used to distinguish unrelated organisms...
Dispersed repetitive DNA elements in genomes of microorganisms differ among and within species. Because distances between repetitive sequences vary depending on bacterial strains, genomic fingerprinting with interspersed repetitive sequence-based probes can be used to distinguish unrelated organisms. Among well-known bacterial repetitive sequences, Repetitive Extragenic Palindromic (REP) sequence has been used to identify environmental bacterial species and strains. We applied REP-PCR to detect and differentiate four major Gram-negative food-borne bacterial pathogens, E. coli, Salmonella, Shigella, and Vibrio. Target DNA fragments of these pathogens were amplified by REP-PCR method. PCR-generated DNA fragments were separated on 1.5% agarose gel. Dendrograms for PCR products of each strain were constructed using photo-documentation system. REP-PCR reactions with primer pairs REP1R-I and REP2-I revealed distinct REP-PCR-derived genomic fingerprinting patterns from E. coli, Salmonella, Shigella, and Vibrio. REP-PCR method provided clear distinctions among different bacterial species containing REP-repetitive elements and can be widely used for typing food-borne Gram-negative strains. Results showed established REP-PCR reaction conditions and generated dendrograms could be used with other supplementary genotyping or phenotyping methods to identify isolates from outbreak and to estimate relative degrees of genetic similarities among isolates from different outbreaks to determine whether they are clonally related.
Dispersed repetitive DNA elements in genomes of microorganisms differ among and within species. Because distances between repetitive sequences vary depending on bacterial strains, genomic fingerprinting with interspersed repetitive sequence-based probes can be used to distinguish unrelated organisms. Among well-known bacterial repetitive sequences, Repetitive Extragenic Palindromic (REP) sequence has been used to identify environmental bacterial species and strains. We applied REP-PCR to detect and differentiate four major Gram-negative food-borne bacterial pathogens, E. coli, Salmonella, Shigella, and Vibrio. Target DNA fragments of these pathogens were amplified by REP-PCR method. PCR-generated DNA fragments were separated on 1.5% agarose gel. Dendrograms for PCR products of each strain were constructed using photo-documentation system. REP-PCR reactions with primer pairs REP1R-I and REP2-I revealed distinct REP-PCR-derived genomic fingerprinting patterns from E. coli, Salmonella, Shigella, and Vibrio. REP-PCR method provided clear distinctions among different bacterial species containing REP-repetitive elements and can be widely used for typing food-borne Gram-negative strains. Results showed established REP-PCR reaction conditions and generated dendrograms could be used with other supplementary genotyping or phenotyping methods to identify isolates from outbreak and to estimate relative degrees of genetic similarities among isolates from different outbreaks to determine whether they are clonally related.
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문제 정의
이를 바탕으로 식중독 유발 미생물의 분리 . 동정 기술을 확 립하고자 한다.
따라서 본 연구에서는, 높은 분리능을 가지고 있어 미생물의 형태적, 생리학적 특성을 근거로한 분리 . 동정을 체계화시킬 수 있을 뿐만 아u라 실험의 재현성과 경제성의 측면에서도 많은 장점을 갖고 있는 REP DNA sequence® 응용한 REP-PCR 을 이용하여 E.
제안 방법
, Shigella spp., Vibrio spp의 total DNA를 각각 주줄하였다. Table 1과 Table 2에 나타난 바와 같이 4속의 귶주들을 5 mg TSB 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕배양 후, 15,000 ipm으로 5분간 원심분리하여 균체를 수확한 다음, 1 ml의 1 M NaCl을 넣어서 2회 세척한 후, 다시 원심분리하여 균체를 수확한 후 700 μL의 lXTE(10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) 용액 에 현탁시켰다.
한편 REP-PCR 반응 조건은 94℃에서 7분간 가열한 후, denatur- ation을 94℃에서 1분, annealing을 4SC에서 1분, 그리고 exten- sion을 72℃ 3분으로 30 cycle 반복하였고, 마지막에 7TC에서 3분간 더 반응시킨 두], 4℃에서 30분간 방치시켰다. PCR 산물 은 1.5% agarose(lXTAE) gel에서 120V로 1시간 전기영동하고 ethidium bromide(5 ug/mL)로 염 색 한 후 transilluminator로 확인 하였다. 산물의 크기는 1 kb DNA Ladder(Gibco-BRL laboratories, NY, USA)를 사용하여 측정하였다.
국내 , 외에서 발생한 Shigella속에 의한 식중독중 S. sonnet 의한 식중독 발생 보고가 가장 큰 비율을 차지하므로(6) 본 연구에서는 속에 속하는 4개 표준균주와 다양한 source로 부터 분리된 10개 S. sonnei 분리균주를 대상으로 REP-PCR을 실시하였다. 그 결과 200bp에서 7.
따라서 본 연구에서는, 높은 분리능을 가지고 있어 미생물의 형태적, 생리학적 특성을 근거로한 분리 . 동정을 체계화시킬 수 있을 뿐만 아u라 실험의 재현성과 경제성의 측면에서도 많은 장점을 갖고 있는 REP DNA sequence® 응용한 REP-PCR 을 이용하여 E. coli, Salmonella, Shigella, Vibrio 등 4속의 주요 그람 음성 식중독유발 세균의 동일속 혹은 종내 균주간 유 전적 다양성을 분석하고 상호 유전적 근연관계를 조사하였다. 또한 다양한 source로부터 분리된 동일한 4속의 분리균주들에 도 REP-PCRe 적용하여 표준균주들과 상호 비교 분석을 통해
우리 나라는 삼면이 바다로 둘러싸여 있어서 식품소재 중 수 산물이 차지하는 비중이 높은데, 어 - 패류를 중심으로 한 수산 물의 경우 그 특성상 위해미생물에 의한 오염 확률이 높으며, 수산물의 대표적 병원성 세균이라고 할 수 있는 V para- haemolyficns의 경우, 이로 인한 식중독 사고가 매년 끊임없이 발생하고 있다. 따라서 본 연구에서는 일반적으로 병원성 Vibrio 속에 속하는 1개 V. cholerae 표준균주, 1개 V. mimicus 표준균 주, 2개 V. parahaemolyticus 표준균주등의 4개 표준균주와 바 지락, 홍합 둥 다양한 패류로부터 분리된 14개 V. parahaemolyticus 분리균주를 대상으로 REP-PCR을 실시하였다. 그 결과 300bp에서 5.
, MA, USA)에서 증폭시켰다. 본 연구에서 위의 4속의 식중독유발 세균들은 REP1R-K5'-ⅢICGICGICATCIGGC-3, ) 와 REP2-I(5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3)의 primer set를 이용하여 중합반응을 실행하였다(19). 한편 REP-PCR 반응 조건은 94℃에서 7분간 가열한 후, denatur- ation을 94℃에서 1분, annealing을 4SC에서 1분, 그리고 exten- sion을 72℃ 3분으로 30 cycle 반복하였고, 마지막에 7TC에서 3분간 더 반응시킨 두], 4℃에서 30분간 방치시켰다.
이를 바탕으로 식중독 유발 미생물의 분리 . 동정 기술을 확 립하고자 한다.
Table 1과 Table 2에 나타난 바와 같이 4속의 귶주들을 5 mg TSB 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕배양 후, 15,000 ipm으로 5분간 원심분리하여 균체를 수확한 다음, 1 ml의 1 M NaCl을 넣어서 2회 세척한 후, 다시 원심분리하여 균체를 수확한 후 700 μL의 lXTE(10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) 용액 에 현탁시켰다. 현탁된 세포에 100μ1의 lysozyme(2 mg/mL)과 30|iL의 RNase A(10mg/mL)를 넣어서 37W에서 20분간 방치 한 후, lysozyme으로 분해가 안됐을 경우 60 μL의 SDS(10%)를 가하였다. 이 현탁액에 100 μL으! sarkosyl(10%)과 60jjL의 proteinase K(10mg/mL)를 가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
대상 데이터
실험에 사용된 4속(Salmonella, E. coli, Shigella, Vibrio 등)의 표준균주는 Table 1에 나타내었다. 또한 다양한 source로부터 분리된 4속의 분리균주는 Table 2에 나타내었다.
또한 다양한 source로부터 분리된 4속의 분리균주는 Table 2에 나타내었다. 이들 균주들을 사용전 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories, MI, USA) 및 tryptic soy agar(TSA, Difco Laboratories, MI, USA)에 수회 계대배양하여 사용하였다.
데이터처리
각 균주간 band pattern의 비교를 위하여 동일한 크기의 band 는 동일 부위의 증폭 band로 가정하여 band의 유무에 따라 1과 0으로 구분하여 Bio-Gene software(version 96, Vilber Lour- mat, Mame la vallee, France) 프로그램에 입력한뒤, UPGMA (unweighted paired group methods with arithmetic average)법(20)을 이용하여 dendrogram을 작성하였으며, Dice coefficient (21, 22)를 근거로 유사도 값을 구하였다.
성능/효과
각 DNA fingerprint의 연관성 분석 결고}", 실험균주들은 genetic similarity 90% 수준에서 16개의 type을 나타내었고(Fig. 4, PanelB), VIP-I3(K parahaemolyticus V5)고} VIP-I4(E parahaemolyticus V6)이 같은 type이고, 또한 VIF-16(¥ parahaemolyticusVⅢ)과 VIP-I13(E parahaemolyticus VI18)이 같은 type으로 확 인되었다. 또한 V.
enter- itidis 등의 6개 표준균주와 다양한 육제품에서 분리한 Salmonella spp. 6개 분리균주를 대상으로 REP-PCR을 실시한 결과 350 bp 에서 4.0kb 범위에 걸쳐 4-15개의 band가 증폭되었다(Fig. 2, Panel A). 이 중 S enteritidis 표준균주의 경우 4-7개의 band로 다른 종보다 적은 band수로 증폭되었다.
E. coli O157:H7을 포함하는 7개의 E. coli 표준균주와 다양한 source로부터 분리된 10개의 E. coli 분리균주를 대상으로 REP-PCR을 실시한 결과, 300 bp에서 4.5 kb 범위에 걸쳐 5-14개의 band가 증폭되었다(Fig. 1, Panel A). 그러므로 Dombek 등(3)에 의하여 사람과 동물로부터 분리된 E.
REP-PCR 반응후 4속의 모든 식중독 균주들로부터 증폭된 band의 수가 다르게 나타났다. E. coli로부터 가장 적은수(14개) 의 band가 증폭되었고, Shigelln와 Vihrio속으로부터 가장 많은 수(16개)의 band가 증폭되었다. 또한 4속의 모든 식중독 균주 마다 REP-PCR 후 생성되는 fingerprint pattern에서 속마다 1-3개의 공통적이며 독특한 band가 생성되는 것이 확인되어 이를 이용한 속 수준의 분리 .
각 DNA fingerprint의 연관성 분석 결과, 실험균주들은 genetic similarity 90% 수준에서 16개의 type을 나타내었고(Fig. 1, Panel B), 38% 수준에서 두 group으로 양분되었다. 그리고 유사한 band pattern을 나타내었던 ESC・R4와 ESGR5는 DNA 연관성 분석에서 100% 일치하는 결과를 나타내었고, ESC-I2와 ESC-I3도 genetic similarity가 80% 이상이므로 높은 연관성을 나타내었다.
각 DNA fingerprint의 연관성 분석 결과, 실험균주들은 genetic similarity 90% 수준에서 6개의 type을 나타내었고(Fig. 3, Panel B), 64% 수준에서 2개 type으로 나뉘어졌다. 또한 72% 수준에서 표준 균주의 경우 각기 다른 type을 나타낸 반면, S.
각 DNA hngerprint의 연관성 분석 결과, 실험균주들은 genetic similarity 90% 수준에서 11개의 type으로 나뉘어졌다. 또한 본 연구에서는 같은 종에 속하는 균주들간에 REP-PCR fingerprinting pattern과 관련된 유전적 연관성이 적은 것으로 확 인되어 일반적으로 반복성 sequence# 이용한 PCR 방법이 종 수준, 더 나아가 균주 수준에서도 분리 .
sonnei 분리균주를 대상으로 REP-PCR을 실시하였다. 그 결과 200bp에서 7.0kb 범위에 걸쳐 8-16개의 band가 증폭되었으며 , 모든 Shigella 균주에서 0.99 kb와 1.85 kb 의 단편이 증폭되었다(Fig. 3, Panel A). 한편 10개 S.
1, Panel B), 38% 수준에서 두 group으로 양분되었다. 그리고 유사한 band pattern을 나타내었던 ESC・R4와 ESGR5는 DNA 연관성 분석에서 100% 일치하는 결과를 나타내었고, ESC-I2와 ESC-I3도 genetic similarity가 80% 이상이므로 높은 연관성을 나타내었다. 한편 본 연구에서는 혈청형이 확인되지 않은 ESC- Rl, ESC-R4 및 ESC-R6를 제외하고 각기 다른 혈청형을 갖는 것으로 확인된 E.
또한 4속의 모든 식중독 균주 마다 REP-PCR 후 생성되는 fingerprint pattern에서 속마다 1-3개의 공통적이며 독특한 band가 생성되는 것이 확인되어 이를 이용한 속 수준의 분리 . 동정과 또한 이러한 주요 band를 중심으로 추가적인 band들을 고려하여 종 수준까지의 분리도 가 능함을 확인하였다.
coli로부터 가장 적은수(14개) 의 band가 증폭되었고, Shigelln와 Vihrio속으로부터 가장 많은 수(16개)의 band가 증폭되었다. 또한 4속의 모든 식중독 균주 마다 REP-PCR 후 생성되는 fingerprint pattern에서 속마다 1-3개의 공통적이며 독특한 band가 생성되는 것이 확인되어 이를 이용한 속 수준의 분리 . 동정과 또한 이러한 주요 band를 중심으로 추가적인 band들을 고려하여 종 수준까지의 분리도 가 능함을 확인하였다.
4, PanelB), VIP-I3(K parahaemolyticus V5)고} VIP-I4(E parahaemolyticus V6)이 같은 type이고, 또한 VIF-16(¥ parahaemolyticusVⅢ)과 VIP-I13(E parahaemolyticus VI18)이 같은 type으로 확 인되었다. 또한 V. parahaemolyticus 분리균주들은 50% 수준에서 크게 두 가지 type으로 양분되었으며, 한 type/ VIC-R1 化 cholerae NIH 35A3)과 다른 typee VIM-R1(K mimicus ATCC 33653)과 band pattern이 유사한 것으로 나타났다.
각 DNA hngerprint의 연관성 분석 결과, 실험균주들은 genetic similarity 90% 수준에서 11개의 type으로 나뉘어졌다. 또한 본 연구에서는 같은 종에 속하는 균주들간에 REP-PCR fingerprinting pattern과 관련된 유전적 연관성이 적은 것으로 확 인되어 일반적으로 반복성 sequence# 이용한 PCR 방법이 종 수준, 더 나아가 균주 수준에서도 분리 . 동정되어질 수 있다는 Louws 등(25)의 주장을 뒷받침 해주는 결과라 할 수 있겠다.
그리고 유사한 band pattern을 나타내었던 ESC・R4와 ESGR5는 DNA 연관성 분석에서 100% 일치하는 결과를 나타내었고, ESC-I2와 ESC-I3도 genetic similarity가 80% 이상이므로 높은 연관성을 나타내었다. 한편 본 연구에서는 혈청형이 확인되지 않은 ESC- Rl, ESC-R4 및 ESC-R6를 제외하고 각기 다른 혈청형을 갖는 것으로 확인된 E. coll 표준균주들에 대한 본 연구 결과에 의하면 균주마다 각기 다른 band pattern 및 낮은 genetic similarity를 나타내었다. 이러한 결과는 식품과 임상에서 분리한 각기 다른 혈청형을 가진 E.
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