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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는, Ficus Carica Linnoeus(무화과)로부터 무화과 당단백질을 추출한 후, 무화과 당단백질이 혈장의 콜레 스테롤 수준의 변화 및 간 항산화계 해독 효소들의 활성 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보았다.
- 항산화 능력을 가진 무화과 당단백질이 생쥐에서 항고지혈 증 효과를 나타내는지 알아보기 위하여, 2주일 동안 무화과 당 단백질을 섭취시키고 혈장 콜레스테롤 수준의 차이를 알아보 았다. Table 1은 무화과 당단백질 처리로 인한 혈장 중의 TC 및 HDL-콜레스테롤, 그리고 LDL-콜레스테롤 함량들의 차이를 보여주고 있는데, PBS만 투여한 대조군과 비교하여 무화과 당 단백질만 50㎎/㎏의 농도로 섭취시킨 그룹의 TC, HDL-콜레 스테롤 그리고 LDL-콜레스테롤의 함량은 각각 247.
제안 방법
- 25 M HQ』을 잘 혼합 하고, 3TC에서 10분간 정 치 시킨다. 0.2M의 NADPH 처리한 후 340nm 파장에서 spectro- photometer로 흡광도를 측정하였다.
- 0 M MgCl2(6H2O<- 각각 1 : 3으로 혼합]를 잘 혼합한 후, 15분간 정치하고 2분간 IQOOOXg로 원심분리 후 상층액을 회수하여 분리하였다. TC, HDL-콜레스테롤, LDL-콜 레스테롤에 대한 각각의 양을 측정하기 위하여, ImL의 반응액 C[FeCl3 solution과 18M HRQ를 각각 1 : 100(v/v)决로 혼 합]에 각각 100吐의 Total HDL-콜레스테롤과 HDL subclass를 넣고, 4℃에서 1시간 동안 정치한 후 560nm의 파장에서 spec- trophotometer로 흡광도를 측정하였으며, 환산 식에 따라 그 측 정치를 TC, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 값으로 환산하 였다 (17-19).
- Total HDL-콜레스테롤은 EDTA가 들어있는 1 mL의 혈장에 100 μL의 반응액 Afdextran sulfete(MW 50, 000 ± 5,000: 20 g/ L), 1 M MgCl2(6H2O> 각각 1 :1로 혼합]를 첨가하여 잘 혼합 한 두], 10분 동안 정치하고 2분간 10, 000Xg로 원심분리 하여 상증액에서 회수 하였다. 한편, HDL subclass(apoprotein A-1과 A-2)는 반응액 A가 처리된 0.
- 생쥐에게 고지혈증을 유발하기 위해 Triton WR-1339(그룹 4, 5, 6)를 PBS에 용해하여 생쥐 체중 kg당 400 mg의 수준으로 1회 복강 주사하였으며, 무화과 당단백질의 최 종 투여는 Triton WR-1339 투여 1시간 전에 섭취 시켰다. Triton WR-1339 투여 18시간 뒤인 15일째에 실험동물을 ether로 마취한 후 심장천공법에 의해 혈액을 채취하고 개복하여 간 을 적출하였다. 채취한 ImL 혈액의 지질 산화를 지연시키기 위해 PBS에 용해한 50mM EDIA lOOpiL를 혈액에 첨가하고 10분간 정치 시킨 후 10, 000Xg로 원심분리하여 상층액을 수집 하여 -70。(2에서 저장하여 혈장지질 분석실험에 사용하였다.
- 무화과 당단백질(60kDa)이 체내의 지질대사과정의 균형을 유 지함에 있어 중요한 역할을 하는지 알아보기 위하여, 리놀렌산 를 기질로 한 과산화반응 모델에 무화과 당단백질을 처리하였다. Fig.
- 무화과 당단백질을 섭취시킴에 의한 혈중 콜레스테롤을 낮 추는 효과가 간의 항산화계 해독효소의 활성의 증가를 수반하 는지 알아보기 위해, 간 조직을 적출하여 SOD, CAT 그리고 GPx의 활성도를 측정하였다. 항산화계 해독효소 중 SO住 두 분자의 O广을 HQ?와 a로 전환시켜 O广에 의해 야기되는 산화적 손상에 대한 세포方 방어로서 일차적으로 관여하는 것으로 알려져 있으며(3), 또 다른 효소인 CAT는 간에 가장 많이 존재하며 대부분의 호기성 세포에 함유되어 있다.
- 4) 완충용액에 넣고 균질기로 분쇄한 후 4。(그에서 9, 000Xg에서 15분 동안 원 심분리하였다. 원심분리된 용액 중 상층액 ImL를 취하여 catalase(CAT)의 활성 측정에 사용하였고, 그 상층액을 다시 15,000Xg로 6。분 동안 원심분리한 후 상층액을 각 ImL씩 취하여 superoxide dismutase(SOD)와 glutathione peroxidase(GPx)의 활성 측정에 사용하였다.
- 실험동물은 5주령의 ICR계 수컷 생쥐로 25±3。(2로 조절된 사육실에서 상품화된 마우스용 사료와 물은 자유롭게 먹게 (ad libitum) 하고 사육환경에 적응시킨 후 체중 35-40 g의 생쥐만 을 선별하여 사용하였다. 생쥐를 6그룹으로 분리하고 각 그룹 은 5마리씩 실험구로써 설계하였다. 처리구에 있어서, 각 그룹 의 쥐에게는 PBS에 용해한 무화과 당단백질을 50㎎/㎏(그룹 2, 5)과 100㎎/㎏(그룹 3, 6)씩 14일간 1일 1회 일정 시간에 카테터를 이용하여 섭취 시켰으며, 대조군의 경우 PBS(그룹 1, 4)만을 투여하였다.
- 처리구에 있어서, 각 그룹 의 쥐에게는 PBS에 용해한 무화과 당단백질을 50㎎/㎏(그룹 2, 5)과 100㎎/㎏(그룹 3, 6)씩 14일간 1일 1회 일정 시간에 카테터를 이용하여 섭취 시켰으며, 대조군의 경우 PBS(그룹 1, 4)만을 투여하였다. 생쥐에게 고지혈증을 유발하기 위해 Triton WR-1339(그룹 4, 5, 6)를 PBS에 용해하여 생쥐 체중 kg당 400 mg의 수준으로 1회 복강 주사하였으며, 무화과 당단백질의 최 종 투여는 Triton WR-1339 투여 1시간 전에 섭취 시켰다. Triton WR-1339 투여 18시간 뒤인 15일째에 실험동물을 ether로 마취한 후 심장천공법에 의해 혈액을 채취하고 개복하여 간 을 적출하였다.
- 생쥐에서 이와 같은 유용한 기능을 가진 무화과 당단백질이 고지혈증을 나타내는 생쥐에서도 유사한 효능을 갖는지 확인 하기 위해, Triton WR-1339(400 ㎎/㎏)의 투여로 인해 유발된 고지혈증 병태모델생쥐를 이용하여 혈장 콜레스테롤 수준의 변화를 알아보았다. 고지혈증 유발을 위해 사용된 Triton WR-1339 는 간에서 콜레스테롤의 생합성을 증가시킴으로써 혈장 콜레 스테롤 수준 및 트리글리세라이드를 증가시키는 물질로서 비 이온계 계면활성제 중의 하나로 잘 알려져 있다(25, 26).
- 시료(당단백질 10mg/mL)는 0.1% SDS(sodium dodecyl sul- fhte)가 포함된 15% polyacrylamide gel에서 4시간동안 100 V, 30 mA로 전기영동기(Mini-Protean II cell, Bio-Rad)를 이용하여 전기영동 한 후 gde Schiff's reagent(15)로 염색하였다.
- 체중 및 간의 무게 변화를 알아보기 위해 실험 식이 개시일 로부터 충분한 양의 사료와 물을 급여하여 사육하였다. 식이 개시일과 실험당일에 생쥐의 체중을 측정하였고, 실험당일 개 복하여 간을 적출한 뒤 생리식염수를 이용하여 혈액과 수분을 제거한 다음 간 무게를 측정하였다.
- 물에 용해된 무화 과 추출물은 Whatman 여과지로 여과하여 불순물을 제거하였다. 여과된 용액에 80% ammonium sulfate 첨가하여 침전시키고 원 심분리 하였고(5 g), 그 침전물은 다시 물에 용해한 뒤 투석 반투막(Spectra/por, MWC0 6000-8000, CA, USA)을 이용하여 4℃ 의 20mM Tris-HCl(pH 7.4) 용액에서 12시간 투석하였으며, 투 석된 용액을 -701에서 동결한 뒤 동결건조기를 이용하여 건조 시켰다(2g). 건조된 단백질을 전기영동 후, electro-eluter(Mini Whole Gel Eluter; Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 용출하였고, 다시 건조하여(4 mg) 원시료의 0.
- 1 mM EDTA]을 잘 혼합 하고, 200 |1M riboflavin을 처 리하여 최종 부피 가 1 mL가 되게 한다. 이후 2개의 40W의 형광등 30cm 떨어진 위치에서 15분간 반 응시킨 후 560 nm 파장에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정하였다.
- 생쥐를 6그룹으로 분리하고 각 그룹 은 5마리씩 실험구로써 설계하였다. 처리구에 있어서, 각 그룹 의 쥐에게는 PBS에 용해한 무화과 당단백질을 50㎎/㎏(그룹 2, 5)과 100㎎/㎏(그룹 3, 6)씩 14일간 1일 1회 일정 시간에 카테터를 이용하여 섭취 시켰으며, 대조군의 경우 PBS(그룹 1, 4)만을 투여하였다. 생쥐에게 고지혈증을 유발하기 위해 Triton WR-1339(그룹 4, 5, 6)를 PBS에 용해하여 생쥐 체중 kg당 400 mg의 수준으로 1회 복강 주사하였으며, 무화과 당단백질의 최 종 투여는 Triton WR-1339 투여 1시간 전에 섭취 시켰다.
- 체중 및 간의 무게 변화를 알아보기 위해 실험 식이 개시일 로부터 충분한 양의 사료와 물을 급여하여 사육하였다. 식이 개시일과 실험당일에 생쥐의 체중을 측정하였고, 실험당일 개 복하여 간을 적출한 뒤 생리식염수를 이용하여 혈액과 수분을 제거한 다음 간 무게를 측정하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 5주령의 ICR계 수컷 생쥐로 25±3。(2로 조절된 사육실에서 상품화된 마우스용 사료와 물은 자유롭게 먹게 (ad libitum) 하고 사육환경에 적응시킨 후 체중 35-40 g의 생쥐만 을 선별하여 사용하였다. 생쥐를 6그룹으로 분리하고 각 그룹 은 5마리씩 실험구로써 설계하였다.
- Ficus Carica Linnoeus(FCL, 무화과)는 전라남도 나주에서 자생한 것을 채취하여 작은 크기로 잘라 순수 증류수(이온이 포 함되지 않은 증류수)에 2개월간 침지 하였다. 물에 용해된 무화 과 추출물은 Whatman 여과지로 여과하여 불순물을 제거하였다.
- 본 실험에 사용된 시약 중 nitro blue tetrazolium(NBT), 비타 민 C, P-NADPH, L-glutathion reduced, 콜레스테롤, dextran sulfate, Triton WR-1339, ethylene diamide tetraacetic acid(EDTA), magnesium chloride 등은 미국 Sigma사로부터 구입하였으며, 그 외 사용된 시약은 순도가 높은 등급을 구입하여 사용하였다.
- 염색한 결과, 약 60kDa의 분자량 을 가진 당단백질임을 알 수 있었다(Lane 1). 본 실험에서는 이 gel상의 60 kDa 무화과 당단백질을 electro-eluter로 용출하였고, 이를 다시 동결 건조한 시료를 사용하였다. 일반적으로 당단백 질들은 순수한 단백질 및 핵산과는 다르게 선형 및 가지형 구 조와 같은 거대한 삼차원적으로 구조적 다양성과 함께 생물학 적 잠재력 기능들을 지니고 있기 때문에, 특히 동물이나 식물 그리고 미생물에서 체내의 대사나 면역기능 그리고 항상성유지 등을 위하여 특이적인 기능을 하는 것으로 알려져 있고, 또한 거대 분자들 사이에서 그들만의 정보를 인식, 교환 하는데 있어서 필수적이라고 보고되었다(23, 24).
데이터처리
- 실험결과는 SAS Program(version 6.12)을 이용하여 분산 분 석한 후 유의차가 있는 항목에 대해서는 Duncan's multiple range test로 시료간의 유의차를 검정하였다.
이론/모형
- CAT 활성 측정: CAT의 활성도는 Thomson 등(2))의 방법을 이용하였다. 먼저 200μL의 50 mM phosphate buffer(pH 7.
- GPx 활성 측정: GPx의 활성도는 Mohandas 등(22)의 방법을 이용하였다. 20卜iL의 시료에 반응액[0.
- SOD 활성 측정: SOD의 활성도는 Beauchamp 등(20>의 방법을 이용하였다. 20]丄의 시료에 반응액[0.
- 리놀렌산을 기질로 한 과산화반응 하에서 무화과 당단백질 의 과산화 지질 라디칼 억제능력의 측정은 Takao 등(16)의 방법을 이용하였다. 무화과 당단백질을 200 卜iL의 리놀렌산(25 mg/mL)과 혼합한 후, 이곳에 400μL의 phosphate buffer와 200 ", 의 증류수를 더 혼합하여 40℃에서 30분간 정치 하였다.
성능/효과
- 3은 50과 100㎎/㎏ 농도의 무화과 당단백질만 섭취한 그룹과 무화과 당단백질의 섭취후 Triton WR-1339 투여로 고 지혈증이 유발된 생쥐그룹에서의 SOD 및 CAT 그리고 GPx 활 성을 보여주고 있다. SOD 및 CAT 활성에 있어서 50과 100 ㎎/㎏의 농도로 무화과 당단백질만 섭취한 그룹은 PBS만 처 리한 그룹과 비교하였을 때, 그 활성이 다소 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적 차이는 보이지 않았다(Fig. 3A). 또한 50 과 100㎎/㎏ 농도의 무화과 당단백질을 섭취시킨 후 Triton WR-1339 투여하여 고지혈증이 유발된 생쥐 그룹에서도 Triton WR-1339만 처리한 그룹과 비교하였을 때, SOD 및 CAT의 활 성이 점차 증가하였으나 그 유의성은 나타나지 않았다(Fig.
- 5 mg/dL 수준 이었다. 그러나 50㎎/㎏ 농 도로 무화과 당단백질을 섭취시킨 후 Triton WR-1339 투여한 그룹에서의 TC와 LDL-콜레스테롤 함량의 경우, Triton WR- 1339만 투여한 그룹과 비교하였을 때 각각 273.8과 130.6mg/ dL 수준으로의 유의적인 감소가 나타났다(p <0.05). 특히, 100 ㎎/㎏ 농도로 무화과 당단백질을 섭취한 경우 TC와 LDL-콜레 스테롤 함량은 각각 249.
- 이). 그리고 무화과 당단백질 식이의 농도가 증가함에 따라 간에 존재하는 항산화계 해독 효소인 SOD, CAT 그리고 GPx의 활성도 증가함을 알 수 있었다. 이는 무화과 당단백질 이 간 조직에 존재하는 항산화계 해독효소의 활성을 증가시켜 서 혈장에서 ROS에 의해 야기되는 산화적 스트레스를 억제하여 혈장 콜레스테롤 수준의 감소로 이어진 결과로 사료된다.
- 비록 위와 같은 무화과 당단백질의 정확한 분자적 기전은 현재 연구로서 설명 할 수 없지만, 무화과 당단백질의 저지혈증 효과에 세가지 가 능성 있는 추론은, 먼저 무화과 당단백질이 간에서 항산화계 해독효소의 활성을 증가시켜 간은 정상적인 기능으로 회복 되 게 되고, 이를 통해 HMG-CoA reductase에 영향을 주는 kinase 를 활성화시켜 HMG-CoA reductase의 인산화를 시켜줌으로써 HMG-CoA reductase의 활성을 억제 시켜 콜레스테롤 생합성을 저해 혹은 방해 할 수 있다는 점이다(30). 두번째로 무화과 당 단백질은 그들의 항산화능을 바탕으로 ROS에 의한 LDL-콜레 스테롤의 지질 과산화 작용을 막음으로써, LDL 수용체를 증가시켜 혈중 콜레스테롤 농도를 낮게 할 수 있으며, 마지막으로 지방의 분해에 관련되는 담즙산의 분비를 촉진 시켜 혈중 콜 레스테롤 농도를 낮게 하는데 기여하는 것으로 추측 할 수 있다. 지금까지의 연구결과를 종합해 볼 때, 무화과 당단백질을 섭취시킴에 따라 생쥐의 혈장 내 콜레스테롤 수준의 감소효과가 나타났으며, 특히 100 ㎎/㎏의 농도로 식이 시에는 TC와 LDL-콜레스테롤 수준의 강력한 유의적 개선효능이 나타났다 3<0.
- 결국 무화과 당단백질은 ROS에 대한 scavenger로서 기능을 가지고 있다. 따라서 무화과 당단백질은 ROS에 의해 야기되는 여러 질병들, 특히 콜레스테롤과 관련된 고지혈증이나 동맥경 화의 예방에 유용하게 사용될 수 있는 가능성을 제시해주며, 결과적으로, 무화과로부터 축출한 당단백질은 항산화 능력이 있고, 혈장 콜레스테롤의 수준을 낮출 수 있으며, 콜레스테롤 의 주합성 기관인 간 조직에 존재하는 여러 항산화계 해독 효 소들의 활성을 증가시킬 수 있는 것으로 사료된다.
- 3A). 또한 50 과 100㎎/㎏ 농도의 무화과 당단백질을 섭취시킨 후 Triton WR-1339 투여하여 고지혈증이 유발된 생쥐 그룹에서도 Triton WR-1339만 처리한 그룹과 비교하였을 때, SOD 및 CAT의 활 성이 점차 증가하였으나 그 유의성은 나타나지 않았다(Fig. 3 B). 그러나 흥미롭게도 GPx 활성의 경우, PBS만 투여하거나 Triton WR-1339만 투여한 그룹과 비교하였을 때, 100 ㎎/㎏ 농 도로 무화과 당단백질을 섭취한 그룹들의 GPx 활성은 16.
- 에 분리된 무화과 당단백질을 당단백질에 특이한 염 색 시약인 SchifFs reagents. 염색한 결과, 약 60kDa의 분자량 을 가진 당단백질임을 알 수 있었다(Lane 1). 본 실험에서는 이 gel상의 60 kDa 무화과 당단백질을 electro-eluter로 용출하였고, 이를 다시 동결 건조한 시료를 사용하였다.
- 두번째로 무화과 당 단백질은 그들의 항산화능을 바탕으로 ROS에 의한 LDL-콜레 스테롤의 지질 과산화 작용을 막음으로써, LDL 수용체를 증가시켜 혈중 콜레스테롤 농도를 낮게 할 수 있으며, 마지막으로 지방의 분해에 관련되는 담즙산의 분비를 촉진 시켜 혈중 콜 레스테롤 농도를 낮게 하는데 기여하는 것으로 추측 할 수 있다. 지금까지의 연구결과를 종합해 볼 때, 무화과 당단백질을 섭취시킴에 따라 생쥐의 혈장 내 콜레스테롤 수준의 감소효과가 나타났으며, 특히 100 ㎎/㎏의 농도로 식이 시에는 TC와 LDL-콜레스테롤 수준의 강력한 유의적 개선효능이 나타났다 3<0.이). 그리고 무화과 당단백질 식이의 농도가 증가함에 따라 간에 존재하는 항산화계 해독 효소인 SOD, CAT 그리고 GPx의 활성도 증가함을 알 수 있었다.
- 0mg/dL였다. 특히 100㎎/㎏로 섭취시킨 그룹의 기와 LDL-콜레스테롤의 함량은 대조군에 비해 5%의 유의성을 보이 며 그들의 수치를 낮추는 효과를 보였는데(p<0.05), 이러한 결과는 무화과 당단백질이 생쥐의 체내에서 콜레스테롤을 억제 할 수 있다는 가능성을 제시해준다.
- PBS만 투여한 대조군과 비교하여 무화과 당단백질(50, 100 mg/ kg)을 섭취한 그룹은 비슷한 체중증가가 나타났는데, 이러한 결과는 무화과 당단백질의 섭취로 인해 나타날 수 있는 병적 이 상이나 성장저해 현상이 나타나지 않음을 보여준다(Table 1). 한편 생쥐에서 고지혈증을 유발시키기 위해 lOOpiL의 Triton WR-1339 복강 주사한 세 그룹의 경우, 투여하지 않은 그룹과 비교해 볼 때, 체중의 증가가 다소 둔하게 나타났는데 이는 Triton WR-1339의 투여가 생쥐에게 심한 스트레스로 작용하여 체중에 영향을 준 것으로 사료된다(Table 2).
후속연구
- 그러나 HMG-CoA reductase에 의한 콜레스테롤 생성과 관련된 유전자의 발현 및 그의 기전을 분자생물학적인 수준에서 보 충적인 연구가 향후 더 수행 되어야 할 것이다.
- 일반적으로 과산화 지질 라디칼 과 같은 ROS가 우리 몸의 지질과 결합하게 되면 과산화 지질 을 형성하게 되는데, 이렇게 생성된 과산화 지질은 산화되었을 때 생체 내에서 각종 질병을 유발시키며, 특히 콜레스테롤의 산화는 동맥경화 및 심장질환에 가장 큰 요인으로 작용한다. 그러므로 이러한 결과는 무화과 당단백질이 리놀렌산의 산화 에 의해 생성된 과산화 지질 라디칼을 억제하는 능력, 즉 항산 화 능력을 가지고 있、어서, 결과적으로 지질대사과정 중 콜레스 테롤의 수치를 조절할 수 있는 항고지혈증제 및 항동맥경화제 로서 지질대사의 균형을 유지하는데 중요한 역할을 할 것으로 추론할 수 있다.
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