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문제 정의
- 서 이들 세포수의 회복 및 성장이 중요한 요인이 된다(5, 6). 따라서 HemoHIM, HIM-I 및 그 분획이 면역세포의 활성화 와 조혈세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다 (Fig. 3). 림 프구 증식 능 측정 을 통한 면역 세포 활성 화 시험 에 서는 조다당 분획 이 가장 높은 활성을 나타내었으며, 에탄올 분획은 그 활성이 현저 히 낮게 나타났다(Fig.
- DNA의 손상은 방사선에 의한 재생조직 및 면역조혈계 손상의 주원인이 되며, 물분자가 방사선에 의해 이온화되어 발생되는 수산화라디 칼이 DNA를 포함한 생 체 분자의 손상 을 불러일으킨다고 보고되었다(3). 따라서 방사선에 의한 DNA 손상 억 제효과를 평가하기 위하여 HemoHIM과 HIM-I 및 그 분획 의 림 프구 DNA 손상 억 제 효과와 수산화라디 칼 소 거효과를 비교 검토하였다. 방사선을 조사한 림프구의 DNA 손상정도를 단세포전기 영동법으로 관찰한 결과(Fig.
- 동물이 고선량의 방사선에 노출된 경우 신경계와 심혈관 계의 손상으로 수시간 내에 사망에 이르며, 준치사량의 방사 선에 노출된 경우에는 위장관 및 면역조혈계 재생조직의 손 상으로 수일에서 수 주 내에 사망에 이르게 된다(50). 따라서 본 실험에서는 위장관과 면역조혈계 보호효과를 종합적으 로 평가하기 위하여 준치사량(8 Gy)의 방사선이 조사된 마 우스의 생존에 HemoHIM이 미치는 영향을 관찰하였다(Table 3). 방사선조사 대조군에서는 30일후 생존율이 10%를 나타 내었으나, 복강 투여군에서는 40%의 생존율을 나타내어 유 의적인 생존율 증가가 관찰되었으며(p<0.
- 본 연구팀에서는 방사선으로부터 위장관과 면역 조혈계를 보호하기 위하여 당귀 , 천궁, 백작약으로부터 새로운 생 약복 합물 HIM-I을 개발한 바 있다. 본 연구에서는 방사선 방호 뿐 아니라 다양한 생체질환의 예방에 있어 면역조혈기능이 중추적 인 역할을 한다는 관점에서, HIM-I로부터 면역조혈 기능을 더욱 증진 시 킨 생 약복합조성 물 HemoHIM을 제 조하여 그 효능을 검증하였다. HIM-I를 에탄올 침 지 하여 에탄올 분획 (HIM-I-E)과 조다당 분획 (HIM-I-P)을 얻은 후, HIM-I 에 조다당 분획을 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다.
- 본 연구팀 에서는 동양의학에서 사용되고 있는 다양한 생 약재 및 한약처방제의 방사선에 대한 보호효과를.보고한 바 있으며 (20-27), 당귀 , 천궁, 백주}약 3종의 생약재를 이용하여 방사선으로부터 위장관 및 면역조혈계를 보호함과 동시에 면역조혈기능을 증진시키는 새로운 생약복합물 HIM-I를 개발한 바 있다(28).
- 기존의 연구에서 인삼(35, 36), 천궁(37), 당귀(38), 가시오가피(15) 등 단일 생약재와 십전대보탕(21, 39), 사물탕(26, 27, 40), 귀비탕(22, 41) 등의 한약처방제의 방 사선에 대한 보호효과가 보고되었다. 본 연구팀에서는 기존의 생약재 및 한약처방제 중에서 방사선 방호효과 및 면역조 혈기능 증진효과 검색을 통하여 효과가 뛰어난 생약재 조합 (당귀, 천궁, 백작약)을 선발하여 생약복합물 HIM-I를 개발 하였다(28). 당귀, 천궁, 백작약 각각은 방사선으로부터 재생 조직의 보호 효과, 항산화 효과, 또는 면역세포활성화 효과가 있다고 단편적으로 보고되었다(37, 38, 42-44).
- 본 연구팀에서는 방사선으로부터 위장관과 면역 조혈계를 보호하기 위하여 당귀 , 천궁, 백작약으로부터 새로운 생 약복 합물 HIM-I을 개발한 바 있다. 본 연구에서는 방사선 방호 뿐 아니라 다양한 생체질환의 예방에 있어 면역조혈기능이 중추적 인 역할을 한다는 관점에서, HIM-I로부터 면역조혈 기능을 더욱 증진 시 킨 생 약복합조성 물 HemoHIM을 제 조하여 그 효능을 검증하였다.
- 방사선 생 체손상의 방호 및 회 복을 위해 서는 일차적인 조직의 방호뿐만 아니라 이 차적인 면역조혈 계의 회복촉진이 더욱 중요하고 면역조혈기능이 다양한 생 체질환의 예방 및 개선에 중추적인 작용을 한다. 이러한 관 점에서, 본 연구에서는 HIM-I로부터 면역조혈증진 효능이 더욱 강화된 새로운 생약복합조성물을 개발하고자 HIM-I 에 그 조다당 분획 이 첨가된 HemoHIM을 제조하였으며, 그 효능을 검증하고자 하였다.
가설 설정
- 3) Sample was given i.p. at 30 min and 24 hr after irradiation. 4>Sample was given p.
제안 방법
- 방사선에 대한 방호효과를 종합적으로 평가하기 위한 지 표로 방사선조사 마우스의 생존시험을 수행하였다(34). 7주 령의 암컷 ICR 마우스를 각 시험군당 20마리씩으로 하여 정 상대 조군, 방사선조사대 조군, 경 구투여 군, 복강투여 군으 로 나누었다. 경구투여 의 경우 시료를 음용수에 1 mg/mL로 희석하여 방사선 조사 7일전부터 개체 사망시 또는 실험 종 료시 까지 투여 하였으며 , 복강투여 의 경우 방사선 조사전 36, 12시 간과 조사후 30분, 24시간에 시료를 복강내에 주사하였 다(25 ㎎/㎏ B.
- ). 8 Gy의 방사선을 마우스에 전신조사한 후 30일간 매일 그룹별 생존개체수를 확인하여, 30일후의 생존율과 평균 생존기간을 산출하였다.
- ) at 36 and 12 hr before and 30 min and 24 hr after irradiation (4 Gy). At 3, 7, 14, 21, 35 and 48 days after irradiation, whole blood samples were collected, and the numbers of white blood cells and lymphocytes were counted by automatic hematological analyzer (mean 士 SD). * *p<0.
- 중간선량의 방사선(4 Gy) 조사 후 면역세포 회복 증진 효과 측정을 위한 시험모델로서 백혈구수 및 림프구수의 회 복시험을 수행하였다. C57BL/6 마우스를 방사선 조사전 36 및 12시 간과 조사후 30분 및 24시간 후에 시료를 복강 투여 (300 ㎎/㎏ B.W.)하였다. 방사선조사(4 Gy) 후 3, 7, 14, 21, 35, 48일 후에 마우스의 안와정맥으로부터 혈액을 채취하여 항응고제(EDTA)가 포함된 채혈 tube에 담았다.
- 염색 및 관찰 : 슬라이드를 건조시킨 후 60 UL의 ethidium bromide(20 Ug/mL)로 염 색 하였다. CCD 카메 라가 부 착된 형 광현미경 (Leica, Germany)을 사용하여 515 — 560 nm 의 excitation filter와 590 nm의 barrier filter에서 대물렌즈 40배의 배율로 관찰하였다. 세포의 DNA 손상정도를 이 미지 분석프로그램 任Comet 4.
- 5 pCi/well) 4시간 동안 추가로 배양하였다. Cell harvester(Inotech, Switzer- land)를 이용하여 세포를 glass fiber filter strip에 수거한 후 liquid scintillation counter# 이용하여 incorporation-® Fh]-thymidine의 양을 측정하였다.
- 본 연구에서는 방사선 방호 뿐 아니라 다양한 생체질환의 예방에 있어 면역조혈기능이 중추적 인 역할을 한다는 관점에서, HIM-I로부터 면역조혈 기능을 더욱 증진 시 킨 생 약복합조성 물 HemoHIM을 제 조하여 그 효능을 검증하였다. HIM-I를 에탄올 침 지 하여 에탄올 분획 (HIM-I-E)과 조다당 분획 (HIM-I-P)을 얻은 후, HIM-I 에 조다당 분획을 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다. 이렇게 얻은 HemoHIM, HIM-I 및 각 분획에 대하여 재생조직 및 면역계 방호와 회복촉진 효과를 비교 검증하였다.
- 추출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다. HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올 주정을 첨가하고 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획(HIM- I-P)과 상층의 에탄올 분획(HIM-I-E)을 수거하였다. 수거 한 조다당 분획의 일부를 이에 해당하는 HIM-I에 첨가하여 생약복합조성 물 HemoHIM을 제조하였다.
- 5일에 동물을 희생시켜 소장부위를 채취하고 각 마우스당 8개의 절편을 통상적 인 방법에 따라 파라핀 포매하여 조직 슬라이드를 제작하였다. 각 마우스당 8개의 종절된 소장 표본의 가장자리에 위치하는 소장움의 수를 광학현미경으로 측정하고 실험군별 평균 및 편차를 산정하였다.
- 고선량 방사선(12 Gy)에 대한 방호효과 관찰을 위한 시험 모델로서 소장움 생존시 험을 Withers와 Elkind(32)의 방법에 따라 수행하였다. 각 실험 군당 6마리 의 마우스를 사용하였으며, 12 Gy의 방사선 조사후 3.5일에 동물을 희생시켜 소장부위를 채취하고 각 마우스당 8개의 절편을 통상적 인 방법에 따라 파라핀 포매하여 조직 슬라이드를 제작하였다. 각 마우스당 8개의 종절된 소장 표본의 가장자리에 위치하는 소장움의 수를 광학현미경으로 측정하고 실험군별 평균 및 편차를 산정하였다.
- 5 Gy)에 대한 면역조혈계 방호 효과 측정을 위한 시험모델로서 내재성 비장 조혈세포 집락형성 시험을 수행하였다. 각 실험군당 9마리의 마우스를 사용하였으며, 6.5 Gy의 방사선 조사후 9일 또는 10일에 마우스를 희생시켜 비장을 채취하여 Bouin 용액에 고정하고 표면에 형성된 조혈세포 집락을 실체현미경으로 관찰하였다(33).
- 본 연구에서는 방사선 생체손상의 방호 및 회복에 있어서 일차적 인 조직의 방호뿐 아니라 동시에 면역조혈계의 회복이 더욱 중 요하며, 면역조혈기능 조절물질은 질환의 예방 또는 개선에 직 . 간접적으로 작용함에 따라 질환을 원천적 예방할 수 있다는 관점에서 HIMT의 면역조혈기능을 더욱 증대시키고자 HIM-I에 조다당 분획 을 배가한 생약복합조성 물 HemoHIM 을 개발하였으며, HemoHIM과 HIM-I 및 그 분획의 효능을 비교 검토하였다.
- 골수세포는 마우스의 대퇴골로부터 분리하여 사용하였다. 골수세포를 20% FBS가 포함된 RPMI 1640 완전배지에 부유시킨 후 12-well plate에 well(2 mL) 당 1.7x106개의 골수세포가 포함되도록 분주하였다. 세포 배양액에 시료를 첨가한 후 세포배 양기 에서 10일간 배 양한 후, trypan blue로 염색하여 살아있는 부착성 세포수를 계수하였다.
- 당귀, 천궁, 백작약 등 생약재 3종의 혼합물을 열탕추출하여 HIM-I을 얻고, 에탄올 침지를 통하여 에탄올 분획(HIM- I-E) 및 조다당 분획 (HIM-I-P)을 얻었다. 여러 식 물추출물 의 조다당 분획이 면역조혈증진에 효과가 뛰어남이 보고된 바 있고(16, 42, 44), 본 연구에서 조다당 분획의 높은 면역조 혈증진 효과에 대한 실험결과를 토대로 면역조혈기능을 증 대하기 위하여 HIM-I에 조다당 분획을 첨가한 생약복합조 성물 HemoHIM을 제조하였다.
- 방사선 조사후에는 말초혈액내의 면역세포수가 급격히 감소하며, 면역세포의 재생성에 의한 면역세포수의 회복은 방사선조사 후 회 복에 중요한 역할을 한다(49). 따라서 준치 사량(4 Gy)의 방사선조사 후의 면역 세포수의 회 복에 있어서 HemoHIM이 미치는 영향을 살펴보고자 말초혈액내의 백혈 구수와 림프구수를 관찰하였다(Fig. 4). 방사선조사 대조군 에서는 방사선조사 3일 후 백혈구수와 림프구수가 정상대조 군의 20% 이하로 급격히 감소하였으며, 그 후 서서히 회복되어 방사선조사후 48일 째 에 방사선 조사전 수치 로 회 복되는 것을 관찰하였다.
- 5 Gy, 혈액세 포 재생성 시험에서는 4 Gy, 생존시험에서는 8 Gy의 감마선 을 마우스에 전신조사하였으며, DNA 손상 측정 시험 에서는 2 Gy의 감마선을.림프구 부유액에 조사하였다.
- )하였다. 방사선조사(4 Gy) 후 3, 7, 14, 21, 35, 48일 후에 마우스의 안와정맥으로부터 혈액을 채취하여 항응고제(EDTA)가 포함된 채혈 tube에 담았다. 혈액 내 림 프구 및 백혈구수는 혈액학적 분석기 (HEMAVET 850+, CDC Technologies Inc.
- 방사선조사는 한국원자력연구소 소재 저준위 감마선 조 사시설 (Panoramic Co-60, UKAEA, UKD에서 Co-60 감마 선을 1 Gy/분의 선량율로 조사하였다. 소장움 생존시험 에서 는 12 Gy, 내재성 비장집락형성 시험에서는 6.
- 소장움은 방사선에 민감한 재 생 조직으로서, 방사선에 의한 산화적 생체손상을 측정하는 대표적인 지표로 이용되어 지고 있으며, 방사선에 대한 생체방호에 있어서 소장움 등의 소화기관 재생조직 손상의 억제 및 회복이 중요한 요건의 하나로 받아들여지고 있다(45-47). 본 실험 에서는 각 분획의 기 여 도를 알아보기 위해 HIMT와 그 분획을 수율비 에 따라 투여한 실험 (experiment 1)과 HemoHIM의 투여 방법을 달리 하여 투여 한 실험 (experiment 2)을 독립 적으로 수행 하였다. Table 1에 나타난 바와 같이 experiment 1과 experiment 2 모두 정 상대조군에서 는 소장의 circumference 당 평균 약 160개 정도의 소장움이 관찰되었으나, 12 Gy의 방사선만을 조사한 방사선대조군의 경우에는 10~20개의 소장움이 관 찰되어 방사선 조사에 의해 소장움의 생존율이 현저히 저하 되었다.
- 이때 비장 내에는 조혈모세포의 증식에 의한 집락이 형성되며, 방사선 조사후 비장에서 형성된 집락의 수는 조혈모세포의 방호 및 재 생성 능력 의 지 표로 사용되어 지고 있다(48). 본 실험 에서는 각 분획의 기 여도를 알아보기 위해 HIMT과 二L 분획을 수율비에 따라 투여한 실험 (experiment 1), HemoHIM의 투여 방법을 달리 하여 투여 한 실험 (experiment 2), 그리고 HemoHIM을 용량별로 강제 경구 투여 (intubation)한 실험 (experiment 3)을 독립 적 으로 수행 하였다(Table 2). Experiment 1에서 HIM-I 및 분획의 효과를 살펴본 결과 조다당 분획이 비장집 락수를 5배 이상 증가 시 켜 가장 높은 효과를 나타냈으며 (p<0.
- , USA)으로 2회 수세후 10% FBS를 포함한 RPMI 1640 완전 배지 에 부유시켰다. 분리된 림프구는 시료를 400 Ug/mL 농 도로 처리 후 3시간 배양한 다음 2 Gy의 감마선을 조사하였다. 감마선이 조사된 림프구는 DNA 수복을 차단하기 위 하여 전기영동을 시행하기 전까지 4℃로 유지하였다.
- 7x106개의 골수세포가 포함되도록 분주하였다. 세포 배양액에 시료를 첨가한 후 세포배 양기 에서 10일간 배 양한 후, trypan blue로 염색하여 살아있는 부착성 세포수를 계수하였다.
- CCD 카메 라가 부 착된 형 광현미경 (Leica, Germany)을 사용하여 515 — 560 nm 의 excitation filter와 590 nm의 barrier filter에서 대물렌즈 40배의 배율로 관찰하였다. 세포의 DNA 손상정도를 이 미지 분석프로그램 任Comet 4.0, Kinetic Imaging Ltd., UK)을 통해 60개의 세포를 무작위로 선택하여 분석하였다. DNA 손 상정도는 tail 길이와 tail 내 DNA 파편을 수치화시킨 tail moment(TM)로 나타내었으며 , TM 값이 증가할수록 DNA 가 손상을 많이 받은 것을 의미한다.
- 방사선조사는 한국원자력연구소 소재 저준위 감마선 조 사시설 (Panoramic Co-60, UKAEA, UKD에서 Co-60 감마 선을 1 Gy/분의 선량율로 조사하였다. 소장움 생존시험 에서 는 12 Gy, 내재성 비장집락형성 시험에서는 6.5 Gy, 혈액세 포 재생성 시험에서는 4 Gy, 생존시험에서는 8 Gy의 감마선 을 마우스에 전신조사하였으며, DNA 손상 측정 시험 에서는 2 Gy의 감마선을.림프구 부유액에 조사하였다.
- HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올 주정을 첨가하고 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획(HIM- I-P)과 상층의 에탄올 분획(HIM-I-E)을 수거하였다. 수거 한 조다당 분획의 일부를 이에 해당하는 HIM-I에 첨가하여 생약복합조성 물 HemoHIM을 제조하였다. HIM-I, HIM-I- E, HIM-I-P, HemoHIMe 동결건조하여 냉동 저장하였으며, 실험 직전에 증류수에 녹여 사용하였다.
- 시료처리 및 DNA 손상 유발 : 마우스의 말초혈액을 채 취 하여 Ficoll-Histopaque gradient 방법으로 림프구를 분리 하고 Hanks' balanced salt solution(Sigma-Aldrich Co., USA)으로 2회 수세후 10% FBS를 포함한 RPMI 1640 완전 배지 에 부유시켰다. 분리된 림프구는 시료를 400 Ug/mL 농 도로 처리 후 3시간 배양한 다음 2 Gy의 감마선을 조사하였다.
- 당귀, 천궁, 백작약 등 생약재 3종의 혼합물을 열탕추출하여 HIM-I을 얻고, 에탄올 침지를 통하여 에탄올 분획(HIM- I-E) 및 조다당 분획 (HIM-I-P)을 얻었다. 여러 식 물추출물 의 조다당 분획이 면역조혈증진에 효과가 뛰어남이 보고된 바 있고(16, 42, 44), 본 연구에서 조다당 분획의 높은 면역조 혈증진 효과에 대한 실험결과를 토대로 면역조혈기능을 증 대하기 위하여 HIM-I에 조다당 분획을 첨가한 생약복합조 성물 HemoHIM을 제조하였다.
- HIM-I를 에탄올 침 지 하여 에탄올 분획 (HIM-I-E)과 조다당 분획 (HIM-I-P)을 얻은 후, HIM-I 에 조다당 분획을 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다. 이렇게 얻은 HemoHIM, HIM-I 및 각 분획에 대하여 재생조직 및 면역계 방호와 회복촉진 효과를 비교 검증하였다. HemoHIM 과 HIM-I는 시험 관내에 서 방사선 에 의한 DNA 손상을 유의적으로 억 제하고 수산화 라디 칼을 소거하는 효과가 있음이 관찰되었으며, HemoHIM과 HIM-I는 거의 비슷한 활성을 나타내었다.
- 중간선량의 방사선(4 Gy) 조사 후 면역세포 회복 증진 효과 측정을 위한 시험모델로서 백혈구수 및 림프구수의 회 복시험을 수행하였다. C57BL/6 마우스를 방사선 조사전 36 및 12시 간과 조사후 30분 및 24시간 후에 시료를 복강 투여 (300 ㎎/㎏ B.
- 중간선량의 방사선(6.5 Gy)에 대한 면역조혈계 방호 효과 측정을 위한 시험모델로서 내재성 비장 조혈세포 집락형성 시험을 수행하였다. 각 실험군당 9마리의 마우스를 사용하였으며, 6.
- 서울 경동 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종 즉, 당귀 (Danggui, Angelica gigas Nakai)-5] 뿌리 , 천궁(Chuanxiong, Cnidium offinale Makino) 의 근경 , 백 작약(Baishaoyao, Pae- onia japonica Miyabe)의 뿌리 를 동일한 무게비 율로 혼합한 후, 혼합 생약재 100 g당 증류수 1000 mL을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 추출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다. HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올 주정을 첨가하고 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획(HIM- I-P)과 상층의 에탄올 분획(HIM-I-E)을 수거하였다.
- 방사선조사(4 Gy) 후 3, 7, 14, 21, 35, 48일 후에 마우스의 안와정맥으로부터 혈액을 채취하여 항응고제(EDTA)가 포함된 채혈 tube에 담았다. 혈액 내 림 프구 및 백혈구수는 혈액학적 분석기 (HEMAVET 850+, CDC Technologies Inc., USA)를 이용하여 측정하였다. 각 그룹당 6마리의 마우스로부터 얻어진 평균치를 사용하였다.
대상 데이터
- 수거 한 조다당 분획의 일부를 이에 해당하는 HIM-I에 첨가하여 생약복합조성 물 HemoHIM을 제조하였다. HIM-I, HIM-I- E, HIM-I-P, HemoHIMe 동결건조하여 냉동 저장하였으며, 실험 직전에 증류수에 녹여 사용하였다.
- 혈액세포 재생성 시험 에서는 7주령의 암컷 C57BL/6 마 우스를 사용하였다. 마우스는 대한바이오링크(주)에서 구입 하여, 사육실 온도를 23±1℃로, 습도를 55~60%로 유지 시 키 고 명 암순환이 12시간 단위 로 조절되는 표준 사육방법 으 로 사육하였으며 , 고형사료와 음수는 자유로이 공급하였다.
- 서울 경동 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종 즉, 당귀 (Danggui, Angelica gigas Nakai)-5] 뿌리 , 천궁(Chuanxiong, Cnidium offinale Makino) 의 근경 , 백 작약(Baishaoyao, Pae- onia japonica Miyabe)의 뿌리 를 동일한 무게비 율로 혼합한 후, 혼합 생약재 100 g당 증류수 1000 mL을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 추출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다.
- 소장움(intestinal crypt) 생 존 시험 및 30일 생 존율 시험 에 서는 7주령의 암컷 ICR 마우스를 사용하였으며, 내재성 비 장집락형성시험에는 7주령의 수컷 ICR 마우스를 사용하였다. 혈액세포 재생성 시험 에서는 7주령의 암컷 C57BL/6 마 우스를 사용하였다.
- 실험에 사용한 세포배양액은 RPMKRosewell Park Memorial Institute) 1640 배 지 (pH 7.4) 에 2 mg/mL sodium bicarbonate, 20 mM HEPES, 100 U/mL penicillin, 100 ]ig/ mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1 mM pyruvate, 1% non-essential amino acid 및 10% 또는 20%의 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)을 첨가한 완전배지를 사용하였으며, 세포배양은 5% CO2, 37℃ 포화습도 조건의 세포배양 기에서 수행하였다. 모든 시약은 GIBCO BRL(Praisley, UK)에서 구입하였으며 , 다만 2-mercaptoethanole Sigma- Aldrich Co.
- 소장움(intestinal crypt) 생 존 시험 및 30일 생 존율 시험 에 서는 7주령의 암컷 ICR 마우스를 사용하였으며, 내재성 비 장집락형성시험에는 7주령의 수컷 ICR 마우스를 사용하였다. 혈액세포 재생성 시험 에서는 7주령의 암컷 C57BL/6 마 우스를 사용하였다. 마우스는 대한바이오링크(주)에서 구입 하여, 사육실 온도를 23±1℃로, 습도를 55~60%로 유지 시 키 고 명 암순환이 12시간 단위 로 조절되는 표준 사육방법 으 로 사육하였으며 , 고형사료와 음수는 자유로이 공급하였다.
데이터처리
- 실험군간 차이에 대한 유의성 검정은 Student's t-test와 Chi-square test를 수행하여 분석하였으며, 분석 프로그램 으로는 SPSS 7.0 for windows(SPSS Inc., USA)를 사용하였다.
이론/모형
- Hydroxyl radical scavenging activity of HemoHIM and its fractions. The hydroxyl radical scavenging activity was measured in triplicates by 2-deoxyribose oxidation method (mean 士 SD). Values at the same concentration of the samples are compared, and those with same alphabet letters are significantly different (p<0.
- 고선량 방사선(12 Gy)에 대한 방호효과 관찰을 위한 시험 모델로서 소장움 생존시 험을 Withers와 Elkind(32)의 방법에 따라 수행하였다. 각 실험 군당 6마리 의 마우스를 사용하였으며, 12 Gy의 방사선 조사후 3.
- 비장 림프구의 활성화 효과는 Fh]-thymidine incorporation 방법으로 측정하였다(31). 마우스로부터 분리한 림프 구를 10%의 FBS가 포함된 RPMI 배지 에 부유시킨 후 96- well plate에 분주하였다(2x10, cells/200 uL/well).
- 수산화 라디칼 소거 활성 측정(2-deoxyribose 산화법) 시료의 수산화라디 칼(hydroxyl radical, . OH) 소거 활성 은 2-deoxyribose oxidation 방법으로 측정 하였다(30). 시험 관에서 0.
- 슬라이드 준비 및 전기영동 : Singh 등(29)의 방법에 따라 림프구를 low melting agar(Life Technologies, Inc., USA)에 부유시킨 후 슬라이드에 도말하였으며, 전기영동은 알칼리 조건에서 수행하였다.
성능/효과
- 음용수를 통하여 HemoHIM 을 경구투여한 경우에는 유의적이지는 않았으나 증가하는 경향을 나타내었다. Experiment 1과 2를 비교하였을 때 HemoHIMe HIM-L보다 조혈세포 집 락형 성 증가효과가 뛰어난 것으로 나타났다. 한편, experiment 3에서 HemoHIM 을 용량에 따라 강제 경구투여 (100~400 ㎎/㎏ B.
- 본 실험 에서는 각 분획의 기 여도를 알아보기 위해 HIMT과 二L 분획을 수율비에 따라 투여한 실험 (experiment 1), HemoHIM의 투여 방법을 달리 하여 투여 한 실험 (experiment 2), 그리고 HemoHIM을 용량별로 강제 경구 투여 (intubation)한 실험 (experiment 3)을 독립 적 으로 수행 하였다(Table 2). Experiment 1에서 HIM-I 및 분획의 효과를 살펴본 결과 조다당 분획이 비장집 락수를 5배 이상 증가 시 켜 가장 높은 효과를 나타냈으며 (p<0.005), HIM-I 및 에 탄올 분획 도 유의적으로 비 장집 락수를 증가시 켰다(p<0.05). 한편 experiment 2에서 HemoHIM의 투여 방법에 따른 효과를 살펴 본 결과, HemoHIM을 방사선 조사전 복강 투여 하였 을 때 비장집 락수가 약 45배 증가하여 가장 효과가 뛰어났 으며 (p<0.
- Table 1에 나타난 바와 같이 experiment 1과 experiment 2 모두 정 상대조군에서 는 소장의 circumference 당 평균 약 160개 정도의 소장움이 관찰되었으나, 12 Gy의 방사선만을 조사한 방사선대조군의 경우에는 10~20개의 소장움이 관 찰되어 방사선 조사에 의해 소장움의 생존율이 현저히 저하 되었다. Experiment 1에서 HIM-I와 에탄올 분획을 복강 투 여한 후 방사선을 조사한 그룹에서는 방사선 대조군에 비해 유의적으로 생존 소장움의 수가 1.6 ~ 1.9배 증가하였으며, 조다당 분획을 투여한 그룹에서는 통계적으로 유의성을 보 이지는 않았으나 증가하는 경향을 나타내었다. 이로부터 소 장움의 생존에 에탄올 분획 이 가장 크게 기 여 함을 알 수 있었다.
- 이로부터 소 장움의 생존에 에탄올 분획 이 가장 크게 기 여 함을 알 수 있었다. Experiment 2에서 HemoHIM을 방사선 조사전 또는 조사후에 복강 투여 시 생존 소장움이 각각 2.4배와 2.0배 증 가하였으며 (p<0.05), 경구 투여한 경우에도 증가하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로부터 방사선에 의한 소장 내 조직 손상을 경 감시 키는 효과에 있어 서 HemoHIMe HIM-I 이나 분획들과 비교하여 비 슷하거나 높은 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 이렇게 얻은 HemoHIM, HIM-I 및 각 분획에 대하여 재생조직 및 면역계 방호와 회복촉진 효과를 비교 검증하였다. HemoHIM 과 HIM-I는 시험 관내에 서 방사선 에 의한 DNA 손상을 유의적으로 억 제하고 수산화 라디 칼을 소거하는 효과가 있음이 관찰되었으며, HemoHIM과 HIM-I는 거의 비슷한 활성을 나타내었다. 시험관내 면역세포 활성화와 골수세포 성장촉 진 실험에서는 HemoHIM이 HIM-I에 비하여 높은 활성을 보였으며, 이는 HIM-I에 비해 높은 조다당 함량에 기인한 것으로 보인다.
- 방사선조사 대조군 에서는 방사선조사 3일 후 백혈구수와 림프구수가 정상대조 군의 20% 이하로 급격히 감소하였으며, 그 후 서서히 회복되어 방사선조사후 48일 째 에 방사선 조사전 수치 로 회 복되는 것을 관찰하였다. HemoHIM을 투여한 그룹에서는 방사선 조사후 14일까지는 방사선조사대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 21일 및 35일째에는 급격히 회복되어 방사 선 조사전의 수치로 회복되었다. 이러한 결과는 HemoHIM 이 방사선조사후 면역세포수의 회복을 촉진시키는 효과가 있음을 보여주었다.
- 본 실험 에서는 각 분획의 기 여 도를 알아보기 위해 HIMT와 그 분획을 수율비 에 따라 투여한 실험 (experiment 1)과 HemoHIM의 투여 방법을 달리 하여 투여 한 실험 (experiment 2)을 독립 적으로 수행 하였다. Table 1에 나타난 바와 같이 experiment 1과 experiment 2 모두 정 상대조군에서 는 소장의 circumference 당 평균 약 160개 정도의 소장움이 관찰되었으나, 12 Gy의 방사선만을 조사한 방사선대조군의 경우에는 10~20개의 소장움이 관 찰되어 방사선 조사에 의해 소장움의 생존율이 현저히 저하 되었다. Experiment 1에서 HIM-I와 에탄올 분획을 복강 투 여한 후 방사선을 조사한 그룹에서는 방사선 대조군에 비해 유의적으로 생존 소장움의 수가 1.
- 가 높으며 , 조다당 분획을 첨가한 HemoHIM이 HIM-I보다 더 높은 면역조혈 세포 활성화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 시험관내 면역세포 활성화와 골수세포 성장촉 진 실험에서는 HemoHIM이 HIM-I에 비하여 높은 활성을 보였으며, 이는 HIM-I에 비해 높은 조다당 함량에 기인한 것으로 보인다. 감마선 조사 마우스를 이용한 생 체 보호효과를 살펴 본 결과, HemoHIMe HIM-I와 비슷한 정도의 소장 움 생존율 증가효과를 보였으나, 내재성 비장 조혈세포집락 형 성 시험 에서는 HemoHIMe HIM-I보다 높은 효과를 나타내었다. 또한 방사선조사 마우스에서 HemoHIM의 투여는 방사선 조사후 급격히 감소된 말초 혈 액내 백 혈구 및 림 프구 수의 회복을 촉진시키고, 생존율을 증대시키는 효과가 관찰 되었다.
- HemoHIM 은 조다당 분획 보다는 활성이 약간 낮았으나, HIM-I에 비해 서는 그 활성이 훨씬 높게 나타났다. 골수세포를 이용한 조 혈세포 성장촉진 시험 에서도 조다당 분획 이 가장 높은 효과를 나타내었고 에탄올 분획 이 가장 낮은 효과를 나타내었다 (Fig. 3B). 또한 HemoHIMe 조다당 분획보다는 낮았으나 HIM-I보다는 높은 효과를 나타내었다.
- 05). 따라서 HemoHIMe 방사선 조 사 마우스에서 조혈모세포의 방호와 재생성을 촉진시키는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
- HemoHIMe HIM-I에 활성이 낮은 조다당 분획을 첨가하여 제조하였음에도 불구하고 HIM-I와 비슷한 높은 활성을 나타내었다. 따라서 본 실험 결과 HemoHIMe 방사선에 의한 DNA 손상을 억 제 하고 수산화라디 칼을 소거 하는 효과를 보였으며, HIM-I와 비슷한 높은 활성을 유지하였다.
- 3B). 또한 HemoHIMe 조다당 분획보다는 낮았으나 HIM-I보다는 높은 효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 조 다당 분획이 면역세포의 활성화와 조혈세포 성장촉진 효과
- 감마선 조사 마우스를 이용한 생 체 보호효과를 살펴 본 결과, HemoHIMe HIM-I와 비슷한 정도의 소장 움 생존율 증가효과를 보였으나, 내재성 비장 조혈세포집락 형 성 시험 에서는 HemoHIMe HIM-I보다 높은 효과를 나타내었다. 또한 방사선조사 마우스에서 HemoHIM의 투여는 방사선 조사후 급격히 감소된 말초 혈 액내 백 혈구 및 림 프구 수의 회복을 촉진시키고, 생존율을 증대시키는 효과가 관찰 되었다. 이상의 결과들은 생약복합물 HIM-I에 조다당 분획 을 첨가하여 개발한 새로운 생약복합조성물 HemoHIM이 방사선에 의해 유발된 위장콴및'면역계 조직의 손상을 감소시켜 생존을 증가시키는 효과가 있음을 제시하였다.
- 05), 경구투여군은 35%가 생존하여 생존율의 증가 경향이 관찰되었다. 또한 복강투여군은 방사선조사 대조군에 비해 평균 생존기간이 유의 적 으로 증대 되 었으며 (p<0.05), 경 구 투여 군에서 는 유의 적이지는 않았으나 생존기간이 증대되는 경향이 관찰되었다. 본 시험 에서 HemoHIM 투여시 방사선조사 마우스의 생 존이 증대된 것은 Table 1, 2 및 Fig.
- 따라서 방사선에 의한 DNA 손상 억 제효과를 평가하기 위하여 HemoHIM과 HIM-I 및 그 분획 의 림 프구 DNA 손상 억 제 효과와 수산화라디 칼 소 거효과를 비교 검토하였다. 방사선을 조사한 림프구의 DNA 손상정도를 단세포전기 영동법으로 관찰한 결과(Fig. 1), 2 Gy의 감마선 조사에 의해 림프구의 DNA 손상이 크게 증가하였다. 그러나 시료를 처리한 상태에서 감마선을 조사한 경우, DNA 손상이 유의적으로 감소되었다(p<0.
- 4). 방사선조사 대조군 에서는 방사선조사 3일 후 백혈구수와 림프구수가 정상대조 군의 20% 이하로 급격히 감소하였으며, 그 후 서서히 회복되어 방사선조사후 48일 째 에 방사선 조사전 수치 로 회 복되는 것을 관찰하였다. HemoHIM을 투여한 그룹에서는 방사선 조사후 14일까지는 방사선조사대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 21일 및 35일째에는 급격히 회복되어 방사 선 조사전의 수치로 회복되었다.
- 따라서 본 실험에서는 위장관과 면역조혈계 보호효과를 종합적으 로 평가하기 위하여 준치사량(8 Gy)의 방사선이 조사된 마 우스의 생존에 HemoHIM이 미치는 영향을 관찰하였다(Table 3). 방사선조사 대조군에서는 30일후 생존율이 10%를 나타 내었으나, 복강 투여군에서는 40%의 생존율을 나타내어 유 의적인 생존율 증가가 관찰되었으며(p<0.05), 경구투여군은 35%가 생존하여 생존율의 증가 경향이 관찰되었다. 또한 복강투여군은 방사선조사 대조군에 비해 평균 생존기간이 유의 적 으로 증대 되 었으며 (p<0.
- HemoHIM 과 HIM-I는 시험 관내에 서 방사선 에 의한 DNA 손상을 유의적으로 억 제하고 수산화 라디 칼을 소거하는 효과가 있음이 관찰되었으며, HemoHIM과 HIM-I는 거의 비슷한 활성을 나타내었다. 시험관내 면역세포 활성화와 골수세포 성장촉 진 실험에서는 HemoHIM이 HIM-I에 비하여 높은 활성을 보였으며, 이는 HIM-I에 비해 높은 조다당 함량에 기인한 것으로 보인다. 감마선 조사 마우스를 이용한 생 체 보호효과를 살펴 본 결과, HemoHIMe HIM-I와 비슷한 정도의 소장 움 생존율 증가효과를 보였으나, 내재성 비장 조혈세포집락 형 성 시험 에서는 HemoHIMe HIM-I보다 높은 효과를 나타내었다.
- HemoHIM을 투여한 그룹에서는 방사선 조사후 14일까지는 방사선조사대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 21일 및 35일째에는 급격히 회복되어 방사 선 조사전의 수치로 회복되었다. 이러한 결과는 HemoHIM 이 방사선조사후 면역세포수의 회복을 촉진시키는 효과가 있음을 보여주었다.
- 05), 경구 투여한 경우에도 증가하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로부터 방사선에 의한 소장 내 조직 손상을 경 감시 키는 효과에 있어 서 HemoHIMe HIM-I 이나 분획들과 비교하여 비 슷하거나 높은 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 또한 방사선조사 마우스에서 HemoHIM의 투여는 방사선 조사후 급격히 감소된 말초 혈 액내 백 혈구 및 림 프구 수의 회복을 촉진시키고, 생존율을 증대시키는 효과가 관찰 되었다. 이상의 결과들은 생약복합물 HIM-I에 조다당 분획 을 첨가하여 개발한 새로운 생약복합조성물 HemoHIM이 방사선에 의해 유발된 위장콴및'면역계 조직의 손상을 감소시켜 생존을 증가시키는 효과가 있음을 제시하였다. 특히 HemoHIMe HIM-L와 비교하여 재 생조직 의 산화적 손상억 제 효과는 비슷하게 유지 되 면서도 면역 조혈세포 방호 및 회 복촉진 효과가 높은 것으로 관찰되어 방사선 방호제로서 뿐만 아니라 면역조혈기능 증진제로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 05). 한편 experiment 2에서 HemoHIM의 투여 방법에 따른 효과를 살펴 본 결과, HemoHIM을 방사선 조사전 복강 투여 하였 을 때 비장집 락수가 약 45배 증가하여 가장 효과가 뛰어났 으며 (p<0.05), 방사선 조사후 복강 투여한 경우에도 유의적인 증가효과가 나타났다(p<0.05). 음용수를 통하여 HemoHIM 을 경구투여한 경우에는 유의적이지는 않았으나 증가하는 경향을 나타내었다.
- HemoHIM, HIM-I 및 분획 간에는 DNA 손상 감소 효과에 유의적인 차이를 관찰할 수 없었다. 한편, 방사선에 의한 생체손상의 주요 요인인 수산화 라디칼에 대한 소거 활성을 살펴본 결과, HemoHIM, HIM-I 및 각 분획은 농도 의존적으로 수산 화 라디 칼 소거 활성을 나타내 었다(Fig. 2). 분획 중에 는 에 탄 올 분획의 활성이 조다당 분획 활성보다 높게 나타났다.
후속연구
- 이상의 결과들은 생약복합물 HIM-I에 조다당 분획 을 첨가하여 개발한 새로운 생약복합조성물 HemoHIM이 방사선에 의해 유발된 위장콴및'면역계 조직의 손상을 감소시켜 생존을 증가시키는 효과가 있음을 제시하였다. 특히 HemoHIMe HIM-L와 비교하여 재 생조직 의 산화적 손상억 제 효과는 비슷하게 유지 되 면서도 면역 조혈세포 방호 및 회 복촉진 효과가 높은 것으로 관찰되어 방사선 방호제로서 뿐만 아니라 면역조혈기능 증진제로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이에 따라 일본, 미국을 중심으로 독성이 적은 천연물을 이용한 방사선 방호제 개발 연구가 많이 이루어지고 있다(12-19). 한편, 생체의 산화적 손상과 면역조혈기능 저하는 방사선에 의한 부작용의 원인 일 뿐 아니라 다양한 만성 질환의 원인이 된다는 점 에서 방 사선 방호효과가 있는 소재는 다양한 용도로 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
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