[논문]HPLC를 이용한 감초 추출물의 당 분석법 연구

권영주; 장기철; 나효환; 김용하; 이문수

문제 정의

ISO Guide 인 "Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (측정 불확도 표현 지침서, GUM)"에 따르면 불확도란 “충분히 타당성 있는 이유에 의해 측정값에 영향을 미치는 값의 분포를 특성화한 패러미터”로 정의하고 있으며, 측정결과의 신뢰성의 척도로서 국제적으로 이 지침에 따라 측정값과 함께 측정 결과의 불확도를 표기하도록 하고 있다(ISO, 1993; NIST). 따라서 본 연구에서는 감초의 개별 당 분석법 확립과 아울러 분석값에 영향을 미치는 측정 불확도를 산출하므로써 데이터의 신뢰성을 확 보코저 하였다.
따라서 본 연구에서는 담배의 품질에 중요한 영향을 미치는 감초 추출물의 개별당의 HPLC 분 석법을 확립코자 하였다. 또한 확립된 감초의 당 분석법에 대한 신뢰성 확보를 위하여 당 함량 분석과정에서 발생되는 불확도(Uncertainty) 를 산 출코저하였다.

제안 방법

92 ug으로 나타났다. 감초 추출물 분석 정량값의 정확성을 검증하기 위하여 감초 추출물 시료에 fructose, glucose, sucrose, maltose를 시료에 함유되어 있는 개별당 수준의 50%, 100%, 200% 농도별로 첨가하여 3반복 시험을 행하여 각 개별당별로 회수율을 분석하였다 (Table 2). 각 개별 당의 농도별 회수율 분석 결과는 fructose 97.
고, 계산된 각 표준 불확도를 합성하여 최종 확장 불확도(expanded uncertainty)를 산출하였다. 분석조건은 High Performance Liquid Chromatograph (HPLC)는 Waters system with Empower 를 이용하였고, 컬럼은 YMC-Pack polyamine(250 mm x 4.
따라서 본 연구에서는 담배의 품질에 중요한 영향을 미치는 감초 추출물의 개별당의 HPLC 분 석법을 확립코자 하였다. 또한 확립된 감초의 당 분석법에 대한 신뢰성 확보를 위하여 당 함량 분석과정에서 발생되는 불확도(Uncertainty) 를 산 출코저하였다. ISO Guide 인 "Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (측정 불확도 표현 지침서, GUM)"에 따르면 불확도란 “충분히 타당성 있는 이유에 의해 측정값에 영향을 미치는 값의 분포를 특성화한 패러미터”로 정의하고 있으며, 측정결과의 신뢰성의 척도로서 국제적으로 이 지침에 따라 측정값과 함께 측정 결과의 불확도를 표기하도록 하고 있다(ISO, 1993; NIST).
분석결과의 정확성 및 신뢰성 향상을 위하여 감초 추출물 중의 당 함량 분석과정에서 발생될 수 있는 불확도를 측정하였다. 불확도는 ISO Guide 에 따른 불확도 산출법에 준하여 불확도 값을 산출하였다(황 등, 2003).
고, 계산된 각 표준 불확도를 합성하여 최종 확장 불확도(expanded uncertainty)를 산출하였다. 분석조건은 High Performance Liquid Chromatograph (HPLC)는 Waters system with Empower 를 이용하였고, 컬럼은 YMC-Pack polyamine(250 mm x 4.6 mm, 5 um)을 사용하였으며, 이동상은 Acetonitrile : H₂O = 73:27(v/v%), 유속은 12분까지 1.0 mL/min, 12분에서 20분까지 는 1.3 mL/min, 20분에서 35분까지는 1.0 mL/min, 검출기는 Refractive Index(RI)를 사용하여 표준용액으로 검량곡선을 작성하여 시험액중 의 개별 당 함량을 정량하였다.
45 pm 필터로 여과하여 HPLC 주입시료로 사용하였다. 회수율 분석 시험은 감초 추출물에 함유된 개별 당 함량을 기준으로 50%, 100%, 200% 농도로 첨가하여 3반복 분석 시험을 행하였으며, 당 함량 분석과정에서 발생 될 수 있는 불확도 측정은 GSI에 따른 불확도 산출법에 준하여 계산하였다(황 등, 2003). 즉, 감 초추출물 중의 당 분석 과정에서 발생할 수 있는 불확도 요인을 모두 포함하는 전체 관계식을 설 정하고 불확도 요인을 A형과 B형 불확도로 분류하여 표준 불확도(standard uncertainty)를 계산하

대상 데이터

본 시험에 사용한 시료는 감초 근경을 85°C에 서 물 추출하여 여과, 농축한 후 Brix 70°으로 조 정하여 실험 재료로 이용하였다. 시료 전처리는 10 g의 시료에 증류수 100 ml를 넣어 잘 용해시 키고 Cis SPE cartridge를 통과시켜 비극성 성분 을 제거한 후 0.

이론/모형

분석결과의 정확성 및 신뢰성 향상을 위하여 감초 추출물 중의 당 함량 분석과정에서 발생될 수 있는 불확도를 측정하였다. 불확도는 ISO Guide 에 따른 불확도 산출법에 준하여 불확도 값을 산출하였다(황 등, 2003). 감초의 개별 당 함량에 영향을 미치는 불확도 요인으로는 시료용 액조제, 표준용액 조제, 표준물질 순도, 표준용액 검량선 및 HPLC 반복성 등에 기인한 불확도 요인을 들수 있는데 이들 불확도 인자들 중에서 표준 물질 순도, 표준용액 검량선 및 HPLC 반복성이 불확도에 가장 큰 영향을 주는 것으로 나타났으며, 시료 추출이나 표준용액 조제 시 저울의 반복 사용 및 플라스크의 온도에 따른 부피 팽창계수들은 불확도 요인에 큰 영향을 미치지 못하 는 것으로 나타났다(Table 4).

성능/효과

HPLC를 이용한 감초 추출물의 개별 당 분석법 연구결과 표준물질의 검량선 R 값은 sucrose, glucose가 1.0000, fructose, maltose가 0.9999로서 매우 우수한 직선성을 보였으며, 검출한계는 1.5 8-3.92 ug 수준으로 나타났다. 또한 회수율은 첨가 수준에 따라 91.
감초 추출물 분석 정량값의 정확성을 검증하기 위하여 감초 추출물 시료에 fructose, glucose, sucrose, maltose를 시료에 함유되어 있는 개별당 수준의 50%, 100%, 200% 농도별로 첨가하여 3반복 시험을 행하여 각 개별당별로 회수율을 분석하였다 (Table 2). 각 개별 당의 농도별 회수율 분석 결과는 fructose 97.4—97.7%, glucose 92.3 ~97.9%, sucrose 99.4—102.0%, maltose 91.1 ~ 101.0%로나타났다. 다른 개별당에 비해 함량이 높은 sucrose가 가장 높은 회수율을 나타내었고, 함량이 가장 낮은 maltose가 상대적으로 회수율 편차 가 높게 나타났는데 이러한 결과는 maltose의 retention time이 늦어서 피크 확장이 일어나고,다른 당에 비해 상대적으로 함량이 낮아 정량값 에 편차 요인이 큰데 영향이 있는 것으로 추측된다
감초 추출물 시료의 개별 당 분석 결과는 Table 3에서와 같이 각 개별 당의 함량은 같이 각 개별당의 함량은 sucrose 11.69%, fructose 1.98%, glucose 1.32%, maltose 1.06%로 나타났다. Vola (1984)는 HPLC 를 이용하여 감초 추출물 중의 당을 분석한 결과 fructose 3.
또한 HPLC 크로마토그람 상에 나타난 피크를 기준으로 당 함량을 정량할 때 피크 면적 보다는 피크 높이를 이용하여 정량하는 것이 본연구에서는 불확도 값을 다소 줄일 수 있는 것으로 나타났다.감초 추출물중의 fructose, glucose, sucrose, 및 maltose 함량분석에서 얻어진 확장 불확도 값은 95% 신뢰 수준에서 각각 1.98 ± 0.047, 1.32 ± 0.065, 11.69±0.177 및 1.06 ± 0.042 g/100g 수준으로 각 개별 당 분석 결과의 relative standard deviation(RSD, %)는 5% 이내로 나타났다(Table 5).
불확도는 ISO Guide 에 따른 불확도 산출법에 준하여 불확도 값을 산출하였다(황 등, 2003). 감초의 개별 당 함량에 영향을 미치는 불확도 요인으로는 시료용 액조제, 표준용액 조제, 표준물질 순도, 표준용액 검량선 및 HPLC 반복성 등에 기인한 불확도 요인을 들수 있는데 이들 불확도 인자들 중에서 표준 물질 순도, 표준용액 검량선 및 HPLC 반복성이 불확도에 가장 큰 영향을 주는 것으로 나타났으며, 시료 추출이나 표준용액 조제 시 저울의 반복 사용 및 플라스크의 온도에 따른 부피 팽창계수들은 불확도 요인에 큰 영향을 미치지 못하 는 것으로 나타났다(Table 4). 일반적으로 화학 분석 과정에서 최종 불확도 측정값에 가장 큰 영 향을 미치는 요인은 시료의 전처리 과정인데 감 초의 당 분석법은 전처리 과정이 비교적 단순하 여 불확도 값에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.
0%로나타났다. 다른 개별당에 비해 함량이 높은 sucrose가 가장 높은 회수율을 나타내었고, 함량이 가장 낮은 maltose가 상대적으로 회수율 편차 가 높게 나타났는데 이러한 결과는 maltose의 retention time이 늦어서 피크 확장이 일어나고,다른 당에 비해 상대적으로 함량이 낮아 정량값 에 편차 요인이 큰데 영향이 있는 것으로 추측된다
각 개별 (Vora, 1984).당별로 검량선 분석 결과를 보면 sucrose, glucose 검량선의 R 값이 1.0000, fructose, maltose 검량선의 R값이 0.9999로서 매우 우수한 직선성을 나타내었다. 또한 각 개별당의 검출한계 (detection limit)는 S/N비의 3배로 계산한 값으로 Table 1에서 보는 바와 같이 fructose 1.
일반적으로 화학 분석 과정에서 최종 불확도 측정값에 가장 큰 영 향을 미치는 요인은 시료의 전처리 과정인데 감 초의 당 분석법은 전처리 과정이 비교적 단순하 여 불확도 값에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다. 또한 HPLC 크로마토그람 상에 나타난 피크를 기준으로 당 함량을 정량할 때 피크 면적 보다는 피크 높이를 이용하여 정량하는 것이 본연구에서는 불확도 값을 다소 줄일 수 있는 것으로 나타났다.감초 추출물중의 fructose, glucose, sucrose, 및 maltose 함량분석에서 얻어진 확장 불확도 값은 95% 신뢰 수준에서 각각 1.
0%로 양호하게 나타 났다. 또한 당 함량 분석 시 실험결과에 영향을 미칠 수 있는 불확도 요인을 산출하여 얻어진fructose, glucose, sucrose, 및 maltose의 확장 불확도 값은 각각 1.98 ± 0.047, 1.32 ± 0.065, 11.69 士 0.177, 1.06±0.042 g/100g 수준이었으며, 각 개별 당 분석결과의 RSD(%)는 5% 이내로 나타났다.

후속연구

따라서 신뢰성 있고 재현성 있는 감초 추출물 의 당 분석법을 정립함으로서 감초 추출물의 당 분석 시 적절히 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

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