In order to develop a good separation and simultaneous analysis of different sugar in an artificial mixed sugar solution, we analyzed 10 sugar components in an artificial mixed sugar solution composed of fructose, glucose, mannitol, sucrose, maltose, lactose, xylose, xylitol erythritol, and trehalos...
In order to develop a good separation and simultaneous analysis of different sugar in an artificial mixed sugar solution, we analyzed 10 sugar components in an artificial mixed sugar solution composed of fructose, glucose, mannitol, sucrose, maltose, lactose, xylose, xylitol erythritol, and trehalose with using HPLC-ELSD or HPLC-RI. Separation and quantification by HPLC-ELSD was superior to those by HPLC-RI and detection sensitivity by HPLC-ELSD was higher then that by HPLC-RI as micorgram($\mu\textrm{g}$) level. 1. The units of minimal detectable limits were showed $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ and ng/$m\ell$ by the HPLC-RI and HPLC-ELSD, respectively. 2. The condition of ELSD was drift tube temperature $82^{\circ}C$, $N_2$ gas flow rate 2.10 SLPM, and colum oven temperature $30^{\circ}C$, respectively. Isolation and recovery rates of single sugar from the multiple sugar solution was higher at the condition (time: flow rate: D.W.:ACN MeOH, min : $m\ell$/min:v:v:v) of linear gradient elution of mobile phase as 0 : 1.00 : 15 : 85 : 0.1 : 1.00 : 6 : 90 : 4, 17 : 1.00 : 10 : 70 : 20, 28 : 1.00 : 15 : 85 : 0 an 35 : 1.00 : 15 : 85 : 0, in order.
In order to develop a good separation and simultaneous analysis of different sugar in an artificial mixed sugar solution, we analyzed 10 sugar components in an artificial mixed sugar solution composed of fructose, glucose, mannitol, sucrose, maltose, lactose, xylose, xylitol erythritol, and trehalose with using HPLC-ELSD or HPLC-RI. Separation and quantification by HPLC-ELSD was superior to those by HPLC-RI and detection sensitivity by HPLC-ELSD was higher then that by HPLC-RI as micorgram($\mu\textrm{g}$) level. 1. The units of minimal detectable limits were showed $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ and ng/$m\ell$ by the HPLC-RI and HPLC-ELSD, respectively. 2. The condition of ELSD was drift tube temperature $82^{\circ}C$, $N_2$ gas flow rate 2.10 SLPM, and colum oven temperature $30^{\circ}C$, respectively. Isolation and recovery rates of single sugar from the multiple sugar solution was higher at the condition (time: flow rate: D.W.:ACN MeOH, min : $m\ell$/min:v:v:v) of linear gradient elution of mobile phase as 0 : 1.00 : 15 : 85 : 0.1 : 1.00 : 6 : 90 : 4, 17 : 1.00 : 10 : 70 : 20, 28 : 1.00 : 15 : 85 : 0 an 35 : 1.00 : 15 : 85 : 0, in order.
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문제 정의
ELSD는 lipids, carbohydrates, surfactant등과 같은 이동상 보다 비휘발성인 물질의 검출이 용이하며, 특히 기울기 용리로 분리능을 향상시켜 검출함므로서 단당류에서 올리고당류 까지의 동시분리가 가능할 것으로 기대하고 있다. 이에 따라 본 실험에서 HPLC—ELSD법에의한 각종 당류 혼합액중의 당 분리능과 측정회수율을 확인하고자 하였다.
제안 방법
HPLC-ELSD의 조건은 drift tube 온도가 82℃, N2 gas flow는 2.10 SLPM, 칼람오븐 온도는 30℃, RI에서의 칼람오븐 온도는 30℃으로각각 조정하였다.
각 표준당류 lg씩을 각기 50㎖ 메스플라스크에 취하고 증류수 25㎖를 가하여 용해시킨 후 ACN으로 표선까지 채워 보존용액을 제조하여 냉장 보존하면서 분석에 적용할 당용액은 2㎎/㎖로 희석하였고, 혼합시험용액은 각 당이 ㎖당 5, 10, 20㎍이 되도록 혼합하여 사용하였다.
당류 (fructose, glucose, mannitol, sucrose, maltose, lactose, xylose, xylitol, erythritol, trehalose) 표준액을 혼합하고, 각각의 당을 동시에 분석하고자 HPLC-RI와 HPLC-ELSD# 비교한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
당분리를 위한 분석기기는 Waters 2690 HPLC system(Waters Co., USA)을, 검출기는 500 ELSD(Alltech Co., USA)를 ELSD에 의한결과를 비교하기 위해서는 RI 410(Waters Co., USA)을 각각 이용하였다. 이 때 컬럼은 Alltima NHz(5㎛, 4.
위의 비교 분석 결과에서 보면, ELSD는 기울기 용리가 가능하지만, RI의 경우는 기울기 용리가 불가능하여 등매용리 조건으로 분석하였으며, 또한 검출감도의 차이가 심하여 표준품의 농도와 주입 량의 조건을 각각으로 하여 1,000/㎍/㎖의 주입량을 10㎕로 분석하였다. 그 결과 검출 시간대가 ELSD에서는 6분대에서 23분대인데 반하여, RI는 5분대에서 17분대까지로 비교적 짧았다.
최단시간에 최상의 당분리조건을 확립하기 위하여 등매용리에 의한 결과로부터 세 가지 기울기 용리조건을 설정하였으며, 그 방법들은 Table 2와 같다. 제조한 각각 이동상은 0.
대상 데이터
등매용리를 위한 적절한 이동상의 선택을 위하여 ACN:MeOH:DW의 비율을 달리하는 8 종의 이동상을 Table 1과 같이 제조하여 사용하였다. 최단시간에 최상의 당분리조건을 확립하기 위하여 등매용리에 의한 결과로부터 세 가지 기울기 용리조건을 설정하였으며, 그 방법들은 Table 2와 같다.
분석할 당 용액의 제조에 사용할 당 표준품은 glucose, fructose, maltose, lactose, sucrose, xylose, trhalose 등을, 당알코올류는 mannitol, xylitol, erythritol 등의 제품(Chem Service Co., USA)을 사용하였다. 한편, 이동상으로 사용할 acetonitrile(ACN)과 methanol(MeOH)은 HPLC grade(JT Baker Co.
, USA)을 각각 이용하였다. 이 때 컬럼은 Alltima NHz(5㎛, 4.6 × 250mm ID, Alltech Co., USA)를 사용하였다.
2. HPLC-ELSD의 경우에는 drift tube 온도 82℃, Nz gas frow 2.10 SLPM, 컬럼 오븐 온도 300℃의 조건과 이동상의 기울기 용리조건[시 간 : 유속 : D.W. : ACN : MeOH (min : mVmin : v : v : v)]을 0 : 1.00 : 15 : 85 : 0, 1 :1.00 : 6 : 90 : 4, 17: 1.00: 10: 70: 20 28 : 1.00 : 15 : 85 : 0 및 35 : 1.00 : 15 : 85 : 0으로 설정하여 분석한 바 분리능과 회수율이 가장 높았고, 시간과 경비를 줄일 수 있었다.
주입량을 10㎕로 분석하였다. 그 결과 검출 시간대가 ELSD에서는 6분대에서 23분대인데 반하여, RI는 5분대에서 17분대까지로 비교적 짧았다. 그러나 검출량은 ELSD에서는 1, 140.
그 결과 검출 시간대가 ELSD에서는 6분대에서 23분대인데 반하여, RI는 5분대에서 17분대까지로 비교적 짧았다. 그러나 검출량은 ELSD에서는 1, 140.8에서 361.5, RI에서는 17.3에서 5.4로 ELSD의 감도가 200배정도 높은 것으로 나타났다.
C에서는 erythritol과 xylose, xylitol과 fructose, glucose 와 mannitol, lactose 와 trehalose의 검출시간대 가 유사하였다. 그리고 D와 E에서는 erythritol xylose, xylitol과 fructose, ghicose 와 mannitol, lactose와 trehalose의 검출시간대가 유사하였으며, 나머지는 완전하게 분리되었다. 또한, F와 G에서는 erythritol과 xylose이, xylitol과 fructose, lactose와 treha]ose의 검출시간대가 유사하였으나 나머지는 분리가 우수하였으며, MeOH를 가하지 않은 경우 검출시간이 35분대 에 마지막 물질이 분리된 반면, 가한 경우는 검 출시간이 37분대로 비교적 늦게 검출됨을 알 수 있었다.
또한, F와 G에서는 erythritol과 xylose이, xylitol과 fructose, lactose와 treha]ose의 검출시간대가 유사하였으나 나머지는 분리가 우수하였으며, MeOH를 가하지 않은 경우 검출시간이 35분대 에 마지막 물질이 분리된 반면, 가한 경우는 검 출시간이 37분대로 비교적 늦게 검출됨을 알 수 있었다. 또한 H에서는 완전한 분리를 보였으나 마지막 검출 시간이 97분대까지로 매우 늦게 검 출됨을 알 수 있었다.
그리고 D와 E에서는 erythritol xylose, xylitol과 fructose, ghicose 와 mannitol, lactose와 trehalose의 검출시간대가 유사하였으며, 나머지는 완전하게 분리되었다. 또한, F와 G에서는 erythritol과 xylose이, xylitol과 fructose, lactose와 treha]ose의 검출시간대가 유사하였으나 나머지는 분리가 우수하였으며, MeOH를 가하지 않은 경우 검출시간이 35분대 에 마지막 물질이 분리된 반면, 가한 경우는 검 출시간이 37분대로 비교적 늦게 검출됨을 알 수 있었다. 또한 H에서는 완전한 분리를 보였으나 마지막 검출 시간이 97분대까지로 매우 늦게 검 출됨을 알 수 있었다.
이상의 결과에서 혼합 당표준액을 ELSD를 이용하여 기울기 용리조건으로 분석하였을 때 재현성이 높음을 알 수 있었다.
이와 같은 결과로 미루어 볼 때 기울기 용리조건에서 G-1의 경우가 검출시간이 짧으면서 면적 비가 일정하게 분포되어있어 분석조건이 가장 적절하다고 판단되었다.
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