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문제 정의
- 있다[15]. 따라서 본 연구에서는 B. pumilus TX703의 배양 상등액으로부터 xylanase를 정제한 다음 화학수식제를 사용하여 정제효소의 특정 아미노산 잔기를 불활성화시킨 후 그 효소활성도를 측정함으로써 내열성 xylanase의 효소활성부위를 규명하고자 하였다.
가설 설정
- Samples were recovered by indicated time intervals and then the residual enzyme activity was determined. B: Determination of the second-order rate constant of inactivation. C: Apparent order of reaction with respect to reagent concentration.
- B: Determination of the second-order rate constant of inactivation. C: Apparent order of reaction with respect to reagent concentration.
제안 방법
- 5 ml로 하였다. Cysteine 잔기를 수식하기 위해서는 iodoacetic acidz 5, 5’-di-thiobis (2-nitrobenzoic acid), N-ethylmaleimide, p-chloro-mercuribenzoic acid를, lysine 잔기를 수식하기 위해서는 pyridoxal-5' -phosphate, acetic anhydride, 2,4,6-trinitroben- zene-1-sulfonic acid를, histidine 잔기를 수식하기 위해서는 diethylpyrocarbonate를, arginine 잔기를 수식하기 위해서는 phenylglyoxale4 2, 3-butanedione을 사용하였으며, tryptophan 잔기를 수식하기 위해서는 N-bromosuccinimide를, glutamic acid 또는 aspartic acid를 수식하기 위해서는 carbodiimide를 첨가한 후 37℃에서 20분간 방치한 다음 0.01 ml를 채취하여 xylanase의 잔존활성을 측정하였고, 화학수식제의 작용은 화학수식제를 사용하지 않은 효소활성의 상대 %로 나타내었다.
- Xylanase 활성은 Somogyi와 Nelson의 환원당 정량방법[18]을 변형하여 측정하였다. 기질용액으로는 1% oat-spelts xylan을 50 mM citrate-phosphate (pH 6.
- 기질에 의한 효소의 보호효과를 알아보기 위해서는 0.5% (w/v) oat-spelts xylan (Sigma Co., USA)과 1 mM의 N-bro~ mosuccinimide 또는 10 mN의 carbodiimide를 0.05 unit의 효소가 존재하는 반응용액에 첨가하여 37℃에서 20분간 방치한 다음 0.01 ml를 채취하여 xylanase의 잔존활성을 측정하였다.
- 6 ml의 증류수를 첨가하여 희석한 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 D-xylose를 0~1.0 μmol의 농도로 사용하여 작성하였고, 효소 1 unit는 주어진 조건에서 분당 1 μmol의 D-xylose에 해당하는 환원당을 생성할 수 있는 효소의 양으로 정하였다. 단백질 함량은 Bradford의 방법 [4]에 따라 측정 하였고 bovine serum albumin을 표준물질로 사용하였다.
- 화학수식제에 의한 효소활성의 저해도를 알아보기 위하여 특정 아미노산 잔기에 선택적으로 작용하는 여러가지 화학수식제를 효소반응용액에 각각 20 mM 씩 첨가한 후 효소의 잔존활성을 측정하였다. 정제효소는 각 반응용액 당 0.
- 8×90 cm)에 15 ml/hr의 속도로 통과시켜 3 ml씩 분획하였다. 활성 분획을 모아 농축시킨 다음 10 mM sodium phosphate 완충용액(pH 6.8)로 평형화된 hydroxylapatite column (1.5×8 cm)에 통과시키고 0.01~0.4 M sodium phosphate 완충용액(pH 6.8)으로 농도구배를 걸어 용출되는 활성분획을 모아 농축시킨 후 50 mM citrate-phosphate (pH 6.0) 완충용액을 이용하여 투석하여 정제효소로 사용하였다. 효소의 정제도는 Laemmli의 방법 [11]을 이용하여 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 수행 한 후 Coomassie brilliant blue R-250로 염색하여 확인하였다.
- 효소저해의 반응차수를 계산하기 위해서는 N-bromosucci-nimide 또는 carbodiimide를 여러가지 농도로 반응용액에 첨가한 후 37℃에서 일정시간 간격으로 0.01 ml를 채취하여 효소의 잔존활성을 측정하였다.
대상 데이터
- pumilus TX703을 사용하였다[16]. B. pumilus TX703은 LB 한천 고체배지에서 계대배양하여 4℃ 에 보관하였고 필요할 경우 사용하였으며, 효소생산을 위해 LB 한천 고체배지에서 생육한 colony를 5 ml의 기본배지(1% birchwood xylan, 1% soytone, 0.1% K2HPO4, 0.02% MgSO4·7H2O, pH 6.8)에 접종한 후 37℃에서 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 이 배양액을 500 ml의 기본배지에 1% (v/v)가 되도록 접종한 후 37℃ 에서 250 rpm으로 24시간 배양한 후 5,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다.
- 본 연구에 사용된 내열성 xylanase를 생산하는 균주로는 본 연구진에 의해 토양으로 분리 된 B. pumilus TX703을 사용하였다[16]. B.
- 본 연구진에서는 내열성 Bacillus pumilus TX703으로부터 xylanase 유전자(xynK)를 cloning한 후 그 유전자의 염기서열을 결정하여 분석한 바 있는데 이 유전자는 409개의 아미노산을 coding하는 open reading frame 1,227 bp로 구성되어 있다[15]. 따라서 본 연구에서는 B.
데이터처리
- 검색한 결과 GH10에 속하는 xylanase로 확인되었으며 다른 생물 유래의 xylanase와의 유사성을 알아보기 위하여 CLUSTALW program을 이용하여 homology alignment를 작성한 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 여러 xylanase 중에서 본 연구에 사용된 B.
이론/모형
- 0 μmol의 농도로 사용하여 작성하였고, 효소 1 unit는 주어진 조건에서 분당 1 μmol의 D-xylose에 해당하는 환원당을 생성할 수 있는 효소의 양으로 정하였다. 단백질 함량은 Bradford의 방법 [4]에 따라 측정 하였고 bovine serum albumin을 표준물질로 사용하였다.
- 0) 완충용액을 이용하여 투석하여 정제효소로 사용하였다. 효소의 정제도는 Laemmli의 방법 [11]을 이용하여 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 수행 한 후 Coomassie brilliant blue R-250로 염색하여 확인하였다.
성능/효과
- B. pumilus TX703의 배양 상등액 500 ml로부터 “재료 및방법"에 기술한 정제과정을 통하여 약 0.21 mg의 정제효소를 얻을 수 있었다(Table 1). 정제효소의 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 실시한 결과 48 kDa의 분자량을 지니는 단일 band를 확인할 수 있었으며 이는 xylanase 유전자의 염기배열에서 추론한 분자량과 동일한 것으로 나타났다(Fig.
- 이는 glutamic acid 또는 aspartic acid 잔기가 기질 결합부위가 아닌 촉매활성부위임을 보여주는 것이다. N-bro-mosuccinimide에 의한 효소활성 저해시 기질 첨가에 의해 효소의 잔존활성이 대조구와 비교하여 90%를 보여주어 기질에 의해 효소가 보호되는 것을 알 수 있었으며, 이로부터 기질결합부위에 tryptophan이 관여하는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 N-bromosuccinimide에 의한 저해방식을 알아보기 위하여 N-bromosuccinimide의 농도를 달리하여 반응속도를 측정한 후 Dixon plot을 작성한 결과 xylanase는 N-bromo-succinimide에 의해 경쟁적 저해방식에 의해 저해됨을 알 수 있었고 저해상수 K는 0.6 mM로 계산되었다(Fig. 3). 이상의 결과로부터 xylanase는 기질 결합부위에 1개의 tryptophan 잔기가 관여하는 것을 알 수 있었다.
- 또한 carbodiimide에 의한 저해 방식을 알아보기 위하여 carbodiimide의 농도를 달리하여 반응속도를 측정한 후 Dixon plot을 작성한 결과 xylanase는 carbodiimide에 의해 비경쟁적 저해방식에 의해 저해되는 것으로 나타나 aspartic acid나 glutamic acid는 기질결합부위가 아닌 것으로 확인되었다(Fig. 5). 저해상수 Ki는 2.
- pumilus TX703의 xylanase와 가장 유사성이 높은 xylanase는 Hordeum vulgare isozyme X-l과 X-II로 각각 39%와 38%의 아미노산이 동일하였으며 그 다음으로 Clostridium thermocellum (31%)과 Dictgoglomus thermophilum (28%) 유래의 xylanase 순으로 유사성이 높았다. 비교한 8종류의 모든 xylanase에서 보존되고 있는 아미노산 잔기는 24개로 이중에서 tryptophan 잔기는 Trp146 하나만이 보존되고 있어 이 tryptophan 잔기가 효소의 기질결합부위에 관여하고 있다고 판단되었다. 또한 산성 아미노산은 Asp178z Asp209, Asp218, Asp282와 Glu182, Glu280이 모든 xylanase에서 보존되고 있는 것으로 나타나 이들 6개의 산성 아미노산 잔기 중에서 2개의 아미노산 잔기가 효소의 촉매부위에 관여하고 있는 것으로 추측되어진다.
- 6에 나타내었다. 여러 xylanase 중에서 본 연구에 사용된 B. pumilus TX703의 xylanase와 가장 유사성이 높은 xylanase는 Hordeum vulgare isozyme X-l과 X-II로 각각 39%와 38%의 아미노산이 동일하였으며 그 다음으로 Clostridium thermocellum (31%)과 Dictgoglomus thermophilum (28%) 유래의 xylanase 순으로 유사성이 높았다. 비교한 8종류의 모든 xylanase에서 보존되고 있는 아미노산 잔기는 24개로 이중에서 tryptophan 잔기는 Trp146 하나만이 보존되고 있어 이 tryptophan 잔기가 효소의 기질결합부위에 관여하고 있다고 판단되었다.
- 여러가지 화학수식제를 효소용액에 첨가하고 효소활성을 측정한 결과 Table 2에 나타낸 바와 같이 여러가지 화학수식제 중에서 tryptophan 잔기에 선택적으로 작용하는 N-bro-mosuccinimide와 glutamic acid 또는 aspartic acid 잔기 등 산성 아미노산에 선택적으로 작용하는 carbodiimide 만이 효소활성을 완전히 저해하였다. 한편 cysteine, lysine 또는 histidine에 작용하는 화학수식제들은 효소활성을 부분적으로 저해시킴을 알 수 있었다.
- 3). 이상의 결과로부터 xylanase는 기질 결합부위에 1개의 tryptophan 잔기가 관여하는 것을 알 수 있었다.
- 21 mg의 정제효소를 얻을 수 있었다(Table 1). 정제효소의 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 실시한 결과 48 kDa의 분자량을 지니는 단일 band를 확인할 수 있었으며 이는 xylanase 유전자의 염기배열에서 추론한 분자량과 동일한 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 한편 carbodiimide에 의해 수식된 효소의 Km 값을 Line-weaver-Burk plot으로 측정한 결과 13.32 mg/ml로 계산되어 N-bTomosuccinimide에 의해 수식된 효소의 Km값과 비교하였을 경우 7배 정도 낮은 수준임을 알 수 있었다(data not shown). 이는 tryptophan 잔기의 경우와 비교하였을 때 산성 아미노산 잔기는 기질에 대한 결합능력이 매우 낮기 때문인 것으로, 산성 아미노산 잔기가 기질 결합부위에 관여하지 않는다는 것을 말해준다.
- 한편 화학수식제에 의해 수식되지 않은 효소의 Km 값을 Lineweaver~Burk plot으로 측정한 결과 1.56 mg/ml로 계산되었으나 N-bromosuccinimide에 의해 수식된 효소의 Km값은 81.12 mg/nd로 계산되어 수식되지 않은 효소의 Km값과 비교하였을 경우 50배 이상 증가함을 알 수 있었다(data not shown). 이는 tryptophan이 기질의 결합에 관여하며 tryptophan이수식됨에 따라 기질의 친화도가 감소함에 따라 Km 값이 증가하였음을 의미한다.
- 화학수식제에 의한 효소활성 저해시 반응용액에 기질인 xylan을 첨가하여 효소에 기질을 결합시킴으로써 첨가 기질에 의해 화학수식제의 저해반응으로부터 효소활성이 보호되는지를 확인함으로써 화학수식제가 효소의 기질결합 부위에 직접 작용하는 것인가를 확인하였다. 효소활성을 완전 저해시 킨 N-bromosuccinimide와 carbodiimide를 사용하여 효소를 수식할 때 기질인 oat-spelts xylan을 효소용액에 첨가하여 보호한 후 효소의 잔존활성을 측정한 결과 Table 3에 나타낸 바와 같이 carbodiimide를 사용하여 효소를 불활성화시켰을 때 기질의 첨가가 효소의 불활성화를 방지하지 못하였다.
- 효소를 여러가지 농도의 carbodiimide와 반응하였을 때 시간이 지남에 따라 효소활성이 소실됨을 알 수 있었고 효소실활은 carbodiimide의 농도에 따라 pseudo first-order kinetics의 양상을 나타내었다(Fig. 4(A)).
후속연구
- circulans가 생산하는 xylanase의 활성부위에는 glutamic acid가 관여한다고 보고하였고 Clostridium thermocellum[25], Dictyoglomus thermophilum[12], Thermotoga neapolitana[2D] 등에서도 glutamic acid가 xylanase의 촉매부위에 존재한다고 보고되어 본 연구와 동일한 결과를 나타내었다. 본 연구에서는 특정 아미노산에 선택적으로 작용하는 화학수식제를 사용하여 xylanase의 활성부위를 간접적으로 확인하였는데 보다 직접적으로 효소활성부위를 결정하기 위해서는 cloning된 xylanase 유전자를 사용한 site-directed mutagenesis 연구가 뒷받침되어야 한다고 사료된다.
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