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문제 정의
- 본 실험에서는 Tween 85, Triton X-100, SDS를 사용하여 Sphingomonas sp. HS362의 phenanthrene 분해에 대한 영향을 알아보았다. 계면활성제가 100 ppm 첨가되었을 때, 각각의 실험군에서 대조실험군 보다 높은 분해능을 관찰할 수 있었다.
- Sphingomonas sp. HS362의 phenanthrene 분해에 있어서 계면활성제의 영향을 알아보았다. 대조 실험군에서는 배양 10일 후, 96%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 관찰되었고, SDS, Tween 85, Triton X-I00 등 계면활성제가 100 ppm 첨가된 경우 모두 10일 후, 99% 이상을 분해하는 것으로 관찰되었다.
- Phenanthrene 분해에 염분의 농도가 미치는 영향을 알아보았다. 대조군으로 사용된 0.
- 본 연구에서는 PAHs로 오염된 유류오염 토양으로부터 단일 탄소원과 에너지원으로서 phenanthrene을 이용하는 균주를 분리, 동정하고, 분리된 균주의 phenanthrene 분해능에 미치는 다양한 조건들의 영향을 관찰하고, phenanthrene 분해를 증진시키기 위한 조건들과 plasmid가 phenanthrene 분해에 있어 어떤 상관관계를 갖는지의 여부를 확인하였다.
- 세균의 plasmid가 대사에 필요한 많은 유전자들의 진화와 확산에 중요한 역할을 한다는 것은 이미 잘 알려져 있는 사실로서, plasmid를 포함하고 있는 Sphingomonas 속의 경우에도 plasmid 흘로 또는 chromosome과 협력하여 PAHs를 이화시키는 기능이 있다는 보고가 많아, 분리된 균주 HS362의 plasmid에 대한 연구를 수행하였다. 이에 따라, curing 실험을 한 결과, 각각의 plasmid pl, p2, p3, p5가 없는 경우에는 phenanthrene을 분해하지 못하는 것을 관찰할 수 없었고, plasmid p4가 존재하는 경우에만 phenanthrene을 분해하는 것을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 이에 따라, Sphingomonas sp. HS362 을 500 ppm phenanthrene이 첨가된 배지에서 전배양하여 전배양 하지 않은 대조군과 phenanthrene 분해능을 비교하였다. 그 결과, 전배양한 경우에는 효소의 유도기간 없이 바로 phenanthrene을 분해하기 시작해서 6일에는 첨가된 phenanthrene을 모두 분해하는 것으로 관찰되었다.
- Sphingomonas sp. HS362가 phenanthrene 이외에 다른 종류의 PAHs을 분해할 수 있는지를 알아보기 위해 앞에서 기술한 방법에 따라, indole, naphthalene, fluoranthene, pyrene에 대해 분해 여부를 확인하였다. Sphingomonas sp.
- Sphingomonas sp. HS362가 phenanthrene을 유일한 탄소원과 에너지원으로 이용하여 성장하는지를 알아보기 위하여 500 ppm 의 phenanthrene이 첨가된 최소액체배지에서 배양하면서 시간에 따른 phenanthrene 분해능과 성장률을 즉정하였다. Sphingomonas sp.
- Sphingomonas sp. HS362의 phenanthrene 분해에 pH가 미치는 영향을 알아보기 위하여, 각각 pH 2, 4, 6, 8, 10, 12에서 배양한 후, 분해능을 측정하였다. 10일 후 pH 4에서는 첨가된 500 ppm phenanthrene 중 약 98%, pH 6과 8에서는 각각 97%, 95% 이상을 분해하였다.
- Phenanthrene 분해 세균의 생화학적 특성은 집락 모양, 색소 형성, 그람 염색, 그리고 API (Analytic Profile Index) 20 NE test strips (bioMerieux, Marcy-I'Etoile, France) 실험을 통하여 결정하였다. PAHs를 분해하는 균주들의 지방산 분석을 위해 TSA 에서 24〜48 시간 배양한 후, 세포의 지방산들을 saponification, methylation, extraction 하여 microbial identification system (MIDI; ChemStation Version 4.02)을 통해 분석하였다.
- coli numbering 1492〜 1510 : 5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')> 사용하였다(16). PCR 반응은 PE480 (Perkin Elmer, USA)을 이용하였으며 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 95℃에서 I 분, 55, C에서 1분, 72P에서 L5분씩 30회 반복하고 마지막에는 72℃에서 10분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다.
- Phenanthrene 분해 세균의 생화학적 특성은 집락 모양, 색소 형성, 그람 염색, 그리고 API (Analytic Profile Index) 20 NE test strips (bioMerieux, Marcy-I'Etoile, France) 실험을 통하여 결정하였다. PAHs를 분해하는 균주들의 지방산 분석을 위해 TSA 에서 24〜48 시간 배양한 후, 세포의 지방산들을 saponification, methylation, extraction 하여 microbial identification system (MIDI; ChemStation Version 4.
- Phenanthrene 분해능 측정은 시간대별로 배양액을 5 ml씩 취하여 잔존하는 phenanthrene 양을 HPLC (Waters, USA)로 분석하였다. 내부표준물질로서 pyrene을 첨가하고 3배의 ethyl acetate를 가한 후, anhydrous sodium sulfated 남아있는 수분을 제거하고, 감압증류 장치로 ethyl acetate를 증발시켜 잔류 phenanthrene을 추출하였다.
- Phenanthrene 분해세균을 분리하기 위해 유류오염 토양으로부터 토양시료를 채취하여 집적배양을 하였다. Kiyohara(15)의 방법에 의해 최소고체배지에 도말하여 아세톤에 녹인 2% phenanthrene을 도포하여 배양한 후, 집락 주변에 뚜렷한 투명환이 형성되는 것을 선택하여 단일 colony를 분리, 순수 배양하였다.
- 증폭된 PCR 산물을 정제한 후 염기서열을 결정하였다. 결정된 16S rDNA 염기서열간의 유사도를 알아보기 위해 NCBI의 GenBank와 EMBL의 database에서 유사한 16S rDNA 염기서열을 비교. 검색하였다.
- 이 집적배 양액을 생리 식염수를 이용하여 희석한 후 최소고체배지에 100 W씩 접종하였다. 그 위에 100ml의 아세톤에 녹인 2g의 phenanthrene을 분무하여 28℃에서 배양하는 동안 집락 주위에 투명환(clear zone)이 형성된 집락을 분해세균으로 선별하였다(15). 선별된 집락들을 순수 배양하기 위해 tryptic soy agar (TSA)배지에 접종하여 단일 집락을 분리하였다.
- 극소량의 영양분의 존재가 분해능 향상에 영향을 미칠 수도 있으므로, 500 ppm이 phenanthrene이 포함된 최소액체배지에 전분, 포도당, peptone, yeast extract를 각각 100 ppm 이 되도록 첨가한 후 5일과 10일 후에 분해능을 확인하였고, 계면활성제의 효과를 알아보기 위하여 동일한 배지에 SDS (sodium dodecyl sulfate), Tween 85 (polyoxyethylene sorbitan ester), Triton X- 100 (alkylphen이 ethoxylate ether)를 각각 100 ppm이 되도록 첨가하여 5일과 10일 후에 분해능을 확인하였다.
- Phenanthrene 분해능 측정은 시간대별로 배양액을 5 ml씩 취하여 잔존하는 phenanthrene 양을 HPLC (Waters, USA)로 분석하였다. 내부표준물질로서 pyrene을 첨가하고 3배의 ethyl acetate를 가한 후, anhydrous sodium sulfated 남아있는 수분을 제거하고, 감압증류 장치로 ethyl acetate를 증발시켜 잔류 phenanthrene을 추출하였다. 주출된 phenanthrene^ acetonitrile 2 ml에 녹여 LC- PAH (Supelco, USA)가 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다.
- Sphingomonas sp. 니S362를 500ppm phenanthrene0] 첨가된 최소액체배지에서 전배양하여 분해효소의 생산을 유도시킨 후, phenanthrene 분해능 확인 실험을 하였다. 전배양한 실험군은 유도기 없이 바로 phenanthrene 분해를 시작하여 4일 후에 97%, 6일 후에는 거의 완전히 분해하였다.
- 이 때, 계대한 최소고체배지에는 아세톤에 녹인 2% phenanthrene을 도포하여 배양하였다. 배양하는 동안 집락주변에 투명환을 형성하는 것과 형성하지 못하는 집락들을 무작위로 선택하여, TSB에 접종하여, 3(TC에서 200 rpm으로 24~48시간 배양한 후, 위의 방법과 동일하게 plasmid DNA를 추출하여 확인하였다.
- 분리된 phenanthrene 분해 균주가 phenanthrene을 유일한 탄소 원과 에너지원으로서 이용하여 성장하는지를 알아보기 위해 100 ml의 최소액체배지에 phenanthrene이 500 ppm 되도록 첨가하였다. 분리된 phenanthrene 분해 균주들은 OD660에서 흡광도가 0.
- 분리된 phenanthrene 분해 균주가 phenanthrene을 유일한 탄소 원과 에너지원으로서 이용하여 성장하는지를 알아보기 위해 100 ml의 최소액체배지에 phenanthrene이 500 ppm 되도록 첨가하였다. 분리된 phenanthrene 분해 균주들은 OD660에서 흡광도가 0.04-0.057} 되도록 접종하였으며, 성장률은 배양액 1 ml과 4 ml 의 용매혼합물 [aceton : methanol : hydrochloric acid = 10 : 10 : 1 (v/v/v)]을 혼합하여 OD660에서 spectrophotometer (Biomate 5, USA)를 이용해 측정하였다(13).
-
분리된 균주의 phenanthrene 및 다른 PAHs 분해
분리된 균주가 phenanthrene 이외에 다른 종류의 PAHs를 분해할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 indole과 naphthalene은 최소고체배지에 균체를 접종한 후, 페트리디쉬 뚜껑에 결정체를 첨가해 균체 생성 및 변화를 관찰하였으며, fluoranthene과 pyrene은 각각 2 g을 아세톤 100 ml에 녹여 배지 위에 분무한 후 균체 주변에 투명환의 형성 유무 및 균체 주변 배지의 색깔변화를 관찰하였다.
- 선별된 집락들을 순수 배양하기 위해 tryptic soy agar (TSA)배지에 접종하여 단일 집락을 분리하였다. 분리된 단일 집락은 다시 최소고체배지에 접종한 후 phenanthrene을 녹인 아세톤(2 g/100 ml)을 분무하여 분해능을 재확인하였다.
- 주출된 phenanthrene^ acetonitrile 2 ml에 녹여 LC- PAH (Supelco, USA)가 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다. 시료들은 717 plus Autosampler# 이용하여 20 u1씩 주입하였고 column 온도는 30P를 유지하며, 100% acetonitrile^- 분당 0.8 ml씩 흘리면서 UV 검출기를 이용하여 254nm에서 측정하였다.
- 유류에 오염된 토양 시료는 표면 아래 5~10cm로부터 채취하여 멸균된 conical tube (Sarstedt, Geimany)에 밀봉하여 실험실로 운반 후 분석하였다. 사용된 최소액체배지는 nitrate minimal medium을 변형한 것으로 그 조성은 증류수 1 L당 (NH4)2SO4 0.
- 이plasmid들이 phenanthrene의 분해에 관여하는지 알아보기 위해 42℃에서 배양하면서 plasmid curing 실험을 실행하였다(8). 실험 결과, plasmid 5개 모두가 없는 경우에는 phenanthrene을 분해하지 못하는 것으로 보아 plasmid들이 phenanthrene 분해에 관여한다는 사실을 추정할 수 있었다.
- 내부표준물질로서 pyrene을 첨가하고 3배의 ethyl acetate를 가한 후, anhydrous sodium sulfated 남아있는 수분을 제거하고, 감압증류 장치로 ethyl acetate를 증발시켜 잔류 phenanthrene을 추출하였다. 주출된 phenanthrene^ acetonitrile 2 ml에 녹여 LC- PAH (Supelco, USA)가 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다. 시료들은 717 plus Autosampler# 이용하여 20 u1씩 주입하였고 column 온도는 30P를 유지하며, 100% acetonitrile^- 분당 0.
- 증폭된 PCR 산물을 정제한 후 염기서열을 결정하였다. 결정된 16S rDNA 염기서열간의 유사도를 알아보기 위해 NCBI의 GenBank와 EMBL의 database에서 유사한 16S rDNA 염기서열을 비교.
- 채취된 토양시료 0.5 g을 500 ppm의 phenanthrene (Sigma, USA)이 포함된 5 ml의 최소액체배지에 접종하고 28℃, 180 ipm 에서 1주일 동안 집적배양 (enrichment culture)을 하였다. 배양된 시료는 동일한 조건의 새로운 배지로 100 ul씩 접종하여 1주일 동안 배양하였다.
- Sphingomonas sp. HS362의 phenanthrene 분해에 있어서 영양분이 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 500 ppm의 phenanthrene0! 포함된 최소액체배지에 각각 100 ppm의 포도당, peptone, yeast extract, 전분 등을 첨가 후, 배양하여 phenanthrene의 분해를 관찰하였다. 대조 실험군에서는 배양 10 일 후, 96%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 관찰되었고, 포도당을 첨가하여 배양한 경우에는 92%, peptone의 경우에도 92%, yeast extract의 경우에는 95%, 전분을 첨가 배양한 경우에는 98%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 확인되었다.
대상 데이터
- 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 이용된 primer는 eubacteria에 특이적인 27F (E. coli numbering 8〜27 : 5-AGAG TTTGMCMTGGCTCAG-3')와 1492R (E. coli numbering 1492〜 1510 : 5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')> 사용하였다(16). PCR 반응은 PE480 (Perkin Elmer, USA)을 이용하였으며 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 95℃에서 I 분, 55, C에서 1분, 72P에서 L5분씩 30회 반복하고 마지막에는 72℃에서 10분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다.
- Kiyohara(15)의 방법에 의해 최소고체배지에 도말하여 아세톤에 녹인 2% phenanthrene을 도포하여 배양한 후, 집락 주변에 뚜렷한 투명환이 형성되는 것을 선택하여 단일 colony를 분리, 순수 배양하였다. 분리된 균주들 중 분해능이 가장 우수한 균주를 HS362로 명명하였다.
- 유류에 오염된 토양 시료는 표면 아래 5~10cm로부터 채취하여 멸균된 conical tube (Sarstedt, Geimany)에 밀봉하여 실험실로 운반 후 분석하였다. 사용된 최소액체배지는 nitrate minimal medium을 변형한 것으로 그 조성은 증류수 1 L당 (NH4)2SO4 0.03 g, NaCl 2 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4 . 7H2O 0.
성능/효과
- 실험 결과, plasmid 5개 모두가 없는 경우에는 phenanthrene을 분해하지 못하는 것으로 보아 plasmid들이 phenanthrene 분해에 관여한다는 사실을 추정할 수 있었다. 5개의 plasmid 중 어떤 plasmid가 분해에 관여하는지를 확인하기 위하여 curing 실험을 한 결과 각각의 plasmid pl, p2, p3 그리고, p5가 없는 경우에는 모두 phenanthrene을 분해할 수 있는 것으로 관찰되었다. 따라서 비록 plasmid p4만을 잃어버린 균을 분리하지는 못했으나 plasmid p4가 phenanthrene 분해에 관여할 것이라 추론할 수는 있었다(Fig.
- Sphingomonas sp. HS362가 phenanthrene을 유일한 탄소원과 에너지원으로 이용하여 성장할 경우 660 nni에 서 흡광도 0.27로 기존에 알려진 세균들보다 훨씬 높은 성장률 을 보였다
- Sphingomonas sp. HS362는 indole의 경우, 분해산물인 indigo의 형성을 관찰할 수 있었고, LMW PAHs인 naphthalene과 phenanthrene도 분해하였으나, HMW PAHs인 fluoranthene과 pyrene은 분해를 하지 못하는 것으로 확인되었다.
- 이상에서와 같이 본 실험에서 분리된 Sphingomonas sp. HS362는 영양분의 첨가 없이 phenanthrene을 분해할 수 있었으며, 전분을 첨가하여 배양한 경우에만 약간의 분해 증진 효과를 확인할 수 있었다. 여기에 계면활성제를 첨가하였을 때와 전배양을 통해서도 phenanthrene 분해능이 증진됨을 관찰하였다.
- 온도에 따른 Sphingomonas sp. HS362의 phenanthrene 분해능을 즉정한 결과, 10일 배양 후, 첨가된 500 ppm phenanthrene 중 10℃와 20℃에서는 각각 46%와 58%, 40℃에서는 23% 정도 를 분해하였지만, 3VC에서는 98% 이상을 분해하는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 따라서, HS362의 phenanthrene 분해를 위한 최적배양온도는 30℃로 추정할 수 있었다.
- Sphingomonas sp. HS362의 phenanthrene 분해에 있어서 포도당, peptone, yeast extract를 첨가한 경우에는 분해능의 증진을 확인할 수 없었고, 단지 전분을 첨가한 경우에만 대조군와 비교해서 분해가 다소 증진된 것을 확인할 수 있었다.
- 이러한 결과를 통해, Sphingomonas sp. HS362의 phenanthrene 분해에 있어서는 phenanthrene을 이용 한 전배양을 통해 증진효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
- Sphingomonas sp. HS362의 성장은 2일 동안의 유도기를 거쳐 3일 이후, 급격한 증가를 보여 6일까지 꾸준히 증가하였으며 그 후, 성장이 크게 둔화되었다. Phenanthrene의 분해는 균체의 성장과 거의 비례하였다(Fig.
- 그러나, 3일을 지나면서 phenanthrene의 양은 급격히 줄어들어 5일째에는 68% 이상, 10일째에는 98% 이상을 분해하였다. 균체의 성장도 3일 이후 급격한 증가 후, 660nm에서 흡광도가 약 0.27까지 성장하는 것을 관찰하였다.
- HS362 을 500 ppm phenanthrene이 첨가된 배지에서 전배양하여 전배양 하지 않은 대조군과 phenanthrene 분해능을 비교하였다. 그 결과, 전배양한 경우에는 효소의 유도기간 없이 바로 phenanthrene을 분해하기 시작해서 6일에는 첨가된 phenanthrene을 모두 분해하는 것으로 관찰되었다. 이것은 전배양을 통하여 phenanthrene 분 해효소가 유도되었기 때문으로 추정된다.
- HS362의 phenanthrene 분해에 있어서 영양분이 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 500 ppm의 phenanthrene0! 포함된 최소액체배지에 각각 100 ppm의 포도당, peptone, yeast extract, 전분 등을 첨가 후, 배양하여 phenanthrene의 분해를 관찰하였다. 대조 실험군에서는 배양 10 일 후, 96%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 관찰되었고, 포도당을 첨가하여 배양한 경우에는 92%, peptone의 경우에도 92%, yeast extract의 경우에는 95%, 전분을 첨가 배양한 경우에는 98%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 확인되었다. 따라서 전분을 첨가하여 배양한 경우에만 분해가 다소간 증진되는 것을 관찰할 수 있었고, 포도당, peptone, yeast extract의 경우에는 오히려 분해능이 저하되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- HS362의 phenanthrene 분해에 있어서 계면활성제의 영향을 알아보았다. 대조 실험군에서는 배양 10일 후, 96%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 관찰되었고, SDS, Tween 85, Triton X-I00 등 계면활성제가 100 ppm 첨가된 경우 모두 10일 후, 99% 이상을 분해하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 첨가된 계면활성제인 SDS, Tween 85, Triton X-100 모두 대조군과 비교해서 분해능의 증진효과를 확인할 수 있었다(Fig.
- Phenanthrene 분해에 염분의 농도가 미치는 영향을 알아보았다. 대조군으로 사용된 0.2% NaCl 농도와 0% NaCl 농도부터 4% NaCl 농도 범위에 이르기까지 10일 후 500 ppm phenanthrene 가운데, 60% 이상이 분해되는 것을 확인하였으며, 특히 1% 이하의 NaCl 농도일 경우에는 95% 이상을 분해하는 것을 확인하였다(Fig. 3C). 또한 0%에서 1%에 이르는 농도 범위에서는 분해능의 변화가 거의 없는 것으로 관찰되었다.
- 대조 실험군에서는 배양 10 일 후, 96%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 관찰되었고, 포도당을 첨가하여 배양한 경우에는 92%, peptone의 경우에도 92%, yeast extract의 경우에는 95%, 전분을 첨가 배양한 경우에는 98%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 확인되었다. 따라서 전분을 첨가하여 배양한 경우에만 분해가 다소간 증진되는 것을 관찰할 수 있었고, 포도당, peptone, yeast extract의 경우에는 오히려 분해능이 저하되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A).
- 또한 0%에서 1%에 이르는 농도 범위에서는 분해능의 변화가 거의 없는 것으로 관찰되었다. 따라서, phenanhrene 분해에 있어서 NaCl의 농도는 1% 이하가 최적 조건이라는 것을 알 수 있었다.
- 대조 실험군에서는 배양 10일 후, 96%의 phenanthrene을 분해하는 것으로 관찰되었고, SDS, Tween 85, Triton X-I00 등 계면활성제가 100 ppm 첨가된 경우 모두 10일 후, 99% 이상을 분해하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 첨가된 계면활성제인 SDS, Tween 85, Triton X-100 모두 대조군과 비교해서 분해능의 증진효과를 확인할 수 있었다(Fig. 4B)
- 3C). 또한 0%에서 1%에 이르는 농도 범위에서는 분해능의 변화가 거의 없는 것으로 관찰되었다. 따라서, phenanhrene 분해에 있어서 NaCl의 농도는 1% 이하가 최적 조건이라는 것을 알 수 있었다.
- 10일 후 pH 4에서는 첨가된 500 ppm phenanthrene 중 약 98%, pH 6과 8에서는 각각 97%, 95% 이상을 분해하였다. 또한 pH 10에서는 80% 이상을 분해하였으나, pH 2와 pH 12에서는 각각 30%, 14% 정도의 분해능을 나타내었다(Fig. 3B). 따라서, Sphingomonas sp.
- 생화학적 검사를 실시한 결과로는 Sphingomonas pancimobilis와 가장 유사한 것으로 나타났으며, 지방산 조성 분석에서는 Sphingomonas 속에서 대표적으로 나타나는 14:0 2OH, 18:1 w7c, 16:1 w7c/15 iso 2OH가 관찰되었다(결과 미제시). 또한, 16S rDNA gene을 PCR 로 증폭시켜 direct sequencing을 실시하여 얻은 약 1, 500 bp의 염기서열을 가지고 NCBI의 GenBank와 EMBL등의 database를 통해 알려진 Sphingomonas 속의 16S rDNA 염기서열들과 비교 분석한 결과 HS362는 Sphingomonas CF06과 가장 유사하여 99.2% 이상의 유사도를 갖는 것으로 확인되었다(GenBank Accession Number DQ121385). 이상의 생화학적 특성, 지방산 조성 분석, rDNA 염기서열분석 등의 결과를 바탕으로 HS362를 Sphingomonas sp.
- 1). 배양 후 2일이 경과할 때까지 첨가된 500 ppm phenanthrene 가운데 약 10%의 phenanthrene을 분해하였으나, 균체의 성장은 관찰되지 않았다. 그러나, 3일을 지나면서 phenanthrene의 양은 급격히 줄어들어 5일째에는 68% 이상, 10일째에는 98% 이상을 분해하였다.
- 분리된 phenanhrene 분해균주 HS362는 그람음성의 간균이었으며, 집락은 점성이 높고, 진한 노란색을 띠었다. 생화학적 검사를 실시한 결과로는 Sphingomonas pancimobilis와 가장 유사한 것으로 나타났으며, 지방산 조성 분석에서는 Sphingomonas 속에서 대표적으로 나타나는 14:0 2OH, 18:1 w7c, 16:1 w7c/15 iso 2OH가 관찰되었다(결과 미제시).
- Kiyohara(15)의 방법에 의해 최소고체배지에 도말하여 아세톤에 녹인 2% phenanthrene을 도포하여 배양한 후, 집락 주변에 뚜렷한 투명환이 형성되는 것을 선택하여 단일 colony를 분리, 순수 배양하였다. 분리된 균주들 중 분해능이 가장 우수한 균주를 HS362로 명명하였다.
- 분리된 phenanhrene 분해균주 HS362는 그람음성의 간균이었으며, 집락은 점성이 높고, 진한 노란색을 띠었다. 생화학적 검사를 실시한 결과로는 Sphingomonas pancimobilis와 가장 유사한 것으로 나타났으며, 지방산 조성 분석에서는 Sphingomonas 속에서 대표적으로 나타나는 14:0 2OH, 18:1 w7c, 16:1 w7c/15 iso 2OH가 관찰되었다(결과 미제시). 또한, 16S rDNA gene을 PCR 로 증폭시켜 direct sequencing을 실시하여 얻은 약 1, 500 bp의 염기서열을 가지고 NCBI의 GenBank와 EMBL등의 database를 통해 알려진 Sphingomonas 속의 16S rDNA 염기서열들과 비교 분석한 결과 HS362는 Sphingomonas CF06과 가장 유사하여 99.
- 이plasmid들이 phenanthrene의 분해에 관여하는지 알아보기 위해 42℃에서 배양하면서 plasmid curing 실험을 실행하였다(8). 실험 결과, plasmid 5개 모두가 없는 경우에는 phenanthrene을 분해하지 못하는 것으로 보아 plasmid들이 phenanthrene 분해에 관여한다는 사실을 추정할 수 있었다. 5개의 plasmid 중 어떤 plasmid가 분해에 관여하는지를 확인하기 위하여 curing 실험을 한 결과 각각의 plasmid pl, p2, p3 그리고, p5가 없는 경우에는 모두 phenanthrene을 분해할 수 있는 것으로 관찰되었다.
- HS362는 영양분의 첨가 없이 phenanthrene을 분해할 수 있었으며, 전분을 첨가하여 배양한 경우에만 약간의 분해 증진 효과를 확인할 수 있었다. 여기에 계면활성제를 첨가하였을 때와 전배양을 통해서도 phenanthrene 분해능이 증진됨을 관찰하였다. 이로써 Sphingomonas sp.
- 세균의 성장은 여러 가지 환경요인에 영향을 받는데, PAHs 분해에 있어서 균체의 성장뿐만 아니라 분해도 이러한 환경적 요인에 영향을 받는다. 온도, pH, NaCl 농도에 따른 phenanthrene 분해능의 변화에 대한 실험을 한 결과, 500 ppm phenanthrene이 첨가된 경우 30℃, pH 4~8, 그리고 1% 이하의 NaCl 농도일 때 분해능이 가장 우수한 것을 확인하였다.
- 세균의 plasmid가 대사에 필요한 많은 유전자들의 진화와 확산에 중요한 역할을 한다는 것은 이미 잘 알려져 있는 사실로서, plasmid를 포함하고 있는 Sphingomonas 속의 경우에도 plasmid 흘로 또는 chromosome과 협력하여 PAHs를 이화시키는 기능이 있다는 보고가 많아, 분리된 균주 HS362의 plasmid에 대한 연구를 수행하였다. 이에 따라, curing 실험을 한 결과, 각각의 plasmid pl, p2, p3, p5가 없는 경우에는 phenanthrene을 분해하지 못하는 것을 관찰할 수 없었고, plasmid p4가 존재하는 경우에만 phenanthrene을 분해하는 것을 확인할 수 있었다. 이로써, plasmid p4가 phenanthrene을 분해하는데 관여할 것이라 추론할 수 있었으나, chromosome의 관여여부는 확인하지 못했다.
후속연구
- HS362는 phenanthrene 및 유류오염 환경의 생물학적 처리에 유용할 것으로 판단된다. 또한 앞으로 다양한 환경 시료를 대상으로 한 연구결과가 확보된다면 PAHs 오염 환경의 생물정화에 유용할 것으로 생각된다.
- Sphingomonas 속에 속하는 여러 균들은 환경에 널리 분포되어 있으며, 다양한 이화능력을 가지고 있어 환경 내 PAHs의 생물정화를 위한 높은 잠재성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 이전의 Pseudomonas 속이나 Flavobacterium으로 알려진 균들이 Sphingomonas 로 재분류되는 것으로 미루어 볼 때(14), Sphingomonas는 phenanthrene 이외에 더 많은 종류의 오염물질 분해에 기여할 수 있으리라 기대된다.
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