S. chungbukensis DJ77로부터 16S rRNA유전자의 염기서열을 분식하였다. 염기서열은 총 1,502 bp로 2000 년에 등록된 부분 서열(1,435 bp)보다 5' 방향과 3' 방향으로 29 bp와 37 bp 길이만큼 각각 확장하였으며, 1 bp가 추가로 삽입되었다. E. coli의 16S rRNA유전자를 모델로 이차구조를 제작하였으며, 네 부위가 특이적임을 발견하였다. Sphnigomonas spp.의 16S rRNA 서열과 S. chungbukensis DJ77의 다중서열검색 결과, Sphingomonas종에서만 나타나는 보존부위와 가변부위를 발견할 수 있었다. 특히, Campylobacter jejuni에서만 나타나는 것으로 알려진 긴 stem loop구조가 서열은 조금 다르지만 구조적 일치를 보이는 유사한 구조를 S. chungbukensis DJ77에서도 발견하였다. 결과적으로, 다중서열검색을 통해 제작한 계통수와 nucleotide signatures분석에 근거하여 S. chugukensis DJ77을 cluster II (Sphingobium)로 분류하였다.
S. chungbukensis DJ77로부터 16S rRNA유전자의 염기서열을 분식하였다. 염기서열은 총 1,502 bp로 2000 년에 등록된 부분 서열(1,435 bp)보다 5' 방향과 3' 방향으로 29 bp와 37 bp 길이만큼 각각 확장하였으며, 1 bp가 추가로 삽입되었다. E. coli의 16S rRNA유전자를 모델로 이차구조를 제작하였으며, 네 부위가 특이적임을 발견하였다. Sphnigomonas spp.의 16S rRNA 서열과 S. chungbukensis DJ77의 다중서열검색 결과, Sphingomonas종에서만 나타나는 보존부위와 가변부위를 발견할 수 있었다. 특히, Campylobacter jejuni에서만 나타나는 것으로 알려진 긴 stem loop구조가 서열은 조금 다르지만 구조적 일치를 보이는 유사한 구조를 S. chungbukensis DJ77에서도 발견하였다. 결과적으로, 다중서열검색을 통해 제작한 계통수와 nucleotide signatures분석에 근거하여 S. chugukensis DJ77을 cluster II (Sphingobium)로 분류하였다.
A 16S ribosomal RNA gene from S. chungbukensis DJ77 has been sequenced. This sequence had a length of 1,502 bp and was extended for 29 bp at 5' and for 37 bp at 3' from the partial sequence (1,435 bp) registered in 2000 year. Besides, 1 bp was newly added near to the 3' end. We made the secondary st...
A 16S ribosomal RNA gene from S. chungbukensis DJ77 has been sequenced. This sequence had a length of 1,502 bp and was extended for 29 bp at 5' and for 37 bp at 3' from the partial sequence (1,435 bp) registered in 2000 year. Besides, 1 bp was newly added near to the 3' end. We made the secondary structure of the 16S rRNA based on E. coli model and found four specific regions. We found constant and variable regions in genus Sphingomonas as the result of multiple alignment of 16S rRNA gene sequences from Sphingomonas spp. and S. chungbukensis DJ77. We found a stem loop structure in S. chungbukensis DJ77, which was only discovered in C. jejuni to date. It showed the structural agreement despite the difference of the sequences from the both organisms. Finally, S. chungbukensis DJ77 belonged to cluster II (Sphingobium) group, after the classification using phylogenetic analysis and nucleotide signature analysis.
A 16S ribosomal RNA gene from S. chungbukensis DJ77 has been sequenced. This sequence had a length of 1,502 bp and was extended for 29 bp at 5' and for 37 bp at 3' from the partial sequence (1,435 bp) registered in 2000 year. Besides, 1 bp was newly added near to the 3' end. We made the secondary structure of the 16S rRNA based on E. coli model and found four specific regions. We found constant and variable regions in genus Sphingomonas as the result of multiple alignment of 16S rRNA gene sequences from Sphingomonas spp. and S. chungbukensis DJ77. We found a stem loop structure in S. chungbukensis DJ77, which was only discovered in C. jejuni to date. It showed the structural agreement despite the difference of the sequences from the both organisms. Finally, S. chungbukensis DJ77 belonged to cluster II (Sphingobium) group, after the classification using phylogenetic analysis and nucleotide signature analysis.
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문제 정의
본 연구에서는 다양한 polyaromatic hydrocarbon들에 '대한 분해능을 암호화하는 phn 유전자(5, 7)를 가진 S. chungbukensis DJ77(6, 8)을 이용하여 유전체 프로젝트로부터 획득한 16S rRNA 서열을 근거로 계통 분류학적 분류를 실시하고자 하였다. 이미 2000년에 부분 서열로 등록했던 S.
chungbukensis DJ77(6, 8)을 이용하여 유전체 프로젝트로부터 획득한 16S rRNA 서열을 근거로 계통 분류학적 분류를 실시하고자 하였다. 이미 2000년에 부분 서열로 등록했던 S. chungbukensis DJ77의 16S rRNA 유전자 서열(AF159257)을 완성하고, 생물정보학적 차원에서 다른 종과의 다중서열 비교를 통해 종특이적인 가변 부위 와 보존 부위를 분석하고, 종간의 유연관계를 밝히고자 하였다.
제안 방법
이 시기에 사용된 S chungbukensis DJ77의 16S rRNA 유전자 서열은 부분적이었기 때문에, 본 연구에서 유전체 프로젝트를 통해 완성한 서열을 가지고 서로 다른 Sphingomonas 종의 유전자들을 수집하여 다중서열 검색을 실시하였다. PHYLIP을 이용한 다중서열 검색 결과로부터 계통수를 제작하였다 (Fig. 2). E coli의 16S rRNA 유전자를 outgroup으로 선택하여 S.
RNAstructure(v. 4.11) 프로그램을 사용하여 S. chungbukensis DJ77의 16S rRNA 유전자의 염기서열로부터 이차 구조를 예측하였다(Fig. 3).동정된 16S rRNA 유전자의 이차 구조는 E.
다중서열 검색을 통한 계통 수 제작에는 PHYLIP(13)을 이용하였고, evolutionary distance matrices는 Jukes and Cantor 모델로 계산하였으며, 계통수는 neighbor-joining 방법으로 제작하였다. 계통수의 안정성 검사를 위해 1000번의 bootstrap resampling을 시행하였다. 16S rRNA 유전자의 이차 구조는 E.
coli에서 조차 대부분(87%)의 유전자 서열은 보존적이었다. 그러나, 비보존 서열로 이루어진 A 부터 G까지의 일곱 구역을 Sphingomonas 속의 가변 부위로 평가하였다(Table 2). 이 중, F와 G 지역은 비교적 보존 부위가 풍부하나, 나머지 A부터 E까지의 다섯 구역에서는 서열간의 강한 다양성을 관찰하였다.
염기서열은 뉴클레오티드 사이의 서열유사도를 평가하는 프로그램인 BLASTN(l)을 이용하여 분석하였으며, 기존의 등록된 서열과 비교하기 위해 BLAST2 (1)를 사용하였다. 더불어 ribosomal database project (RDP)의 CHECK CHIMERA 프로그램(10)을 통해 chimera artifact를 확인하였다. 다른 종의 16S rRNA 유전자들에 대한 다중서열 검색은 CLUSTALX(15)로 수행하였다.
chungbukensis DJ77을 Pseudomonas 속으로부터 Sphingomonas 속으로 재분류시킨 16S rRNA 유전자 서열(AF159257)을 사용하였다. 또한, S. chungbukensis DJ77에 대한 유전체 프로젝트를 통해 제작한 random 클론으로부터 얻었던 단편들을 조립하여 16S rRNA 유전자의 전체 서열(AY911412)을 획득하였다.
서로 다른 Sphinogomonas종과 S. chungbukensis DJ77 에서 16S rRNA 유전자에 대한 다중서열 검색의 결과를 통해 보존 부위와 가변 부위를 분석하였다. 동일한 Sphingomonas 속 뿐 아니라 이차 구조의 모델로 사용했던 E.
yanoikuyae 등과 함께 cluster II로 구분되었다. 이 시기에 사용된 S chungbukensis DJ77의 16S rRNA 유전자 서열은 부분적이었기 때문에, 본 연구에서 유전체 프로젝트를 통해 완성한 서열을 가지고 서로 다른 Sphingomonas 종의 유전자들을 수집하여 다중서열 검색을 실시하였다. PHYLIP을 이용한 다중서열 검색 결과로부터 계통수를 제작하였다 (Fig.
그러나, 비보존 서열로 이루어진 A 부터 G까지의 일곱 구역을 Sphingomonas 속의 가변 부위로 평가하였다(Table 2). 이 중, F와 G 지역은 비교적 보존 부위가 풍부하나, 나머지 A부터 E까지의 다섯 구역에서는 서열간의 강한 다양성을 관찰하였다. 주목할 만한 것은 다른 Sphingomonas 종에는 존재하지 않는 16 bp의 서열이 S.
대상 데이터
S. chungbukensis DJ77을 Pseudomonas 속으로부터 Sphingomonas 속으로 재분류시킨 16S rRNA 유전자 서열(AF159257)을 사용하였다. 또한, S.
S. chungbukensis DJ77의 유전체 프로젝트로부터 획득한 16S rRNA 유전자(AY911412)의 길이는 1, 502 bp이다(Fig. 1). 이는 2000년도에 GenBank에 등록되었던 동일균주의 부분적인 16S rRNA 유전자(AE 59257)와 BLAST2를 사용하여 비교한 결과, 67 bp 차이를 보였다.
이론/모형
계통수의 안정성 검사를 위해 1000번의 bootstrap resampling을 시행하였다. 16S rRNA 유전자의 이차 구조는 E. boli의 16S rRNA 유전자 이차구 조 모델을 기반으로 하였으며 (3), 이를 자동화하기 위해 RNAstructure (v. 4.11) 프로그램(11)을 사용하였다.
더불어 ribosomal database project (RDP)의 CHECK CHIMERA 프로그램(10)을 통해 chimera artifact를 확인하였다. 다른 종의 16S rRNA 유전자들에 대한 다중서열 검색은 CLUSTALX(15)로 수행하였다. 다중서열 검색을 통한 계통 수 제작에는 PHYLIP(13)을 이용하였고, evolutionary distance matrices는 Jukes and Cantor 모델로 계산하였으며, 계통수는 neighbor-joining 방법으로 제작하였다.
다른 종의 16S rRNA 유전자들에 대한 다중서열 검색은 CLUSTALX(15)로 수행하였다. 다중서열 검색을 통한 계통 수 제작에는 PHYLIP(13)을 이용하였고, evolutionary distance matrices는 Jukes and Cantor 모델로 계산하였으며, 계통수는 neighbor-joining 방법으로 제작하였다. 계통수의 안정성 검사를 위해 1000번의 bootstrap resampling을 시행하였다.
염기서열은 뉴클레오티드 사이의 서열유사도를 평가하는 프로그램인 BLASTN(l)을 이용하여 분석하였으며, 기존의 등록된 서열과 비교하기 위해 BLAST2 (1)를 사용하였다. 더불어 ribosomal database project (RDP)의 CHECK CHIMERA 프로그램(10)을 통해 chimera artifact를 확인하였다.
성능/효과
2). E coli의 16S rRNA 유전자를 outgroup으로 선택하여 S. chungbukensis DJ77의 16S rRNA 유전자를 비교한 결과, S. chlorophenolica, S. yanoikuyae 등과 함께 그룹을 이루는 것으로 드러났으며, nucleotide signatures 의 검색 결과, 52:359(U:A), 134(G), 593(U), 987:1218(A:U), 990:1215(U:G) 위치의 서열이 정확히 cluster II 그룹과 일치했다. 이로써 S.
이 부위는 한국에서 분리된 Sphingomonas sp. KH3-2 (AF282616) 균주와 미국에서 분리된 uncultured soil bacterium clone PHE7d9 (AY 699586)에서 모두 나타나지만, 같은 종으로 동정된 벨기에의 S. chungbukensis VM0440 (AY151392)에서는 나타나지 않는 특이함을 보였다 (Fig. 4). 또한, proteobacteria 수준에서 분석한 결과, X2와 서열은 다르지만, 구조적으로 유사한 stem loop 구조를 Campylobacter jejuni에서 발견하였다 (Fig.
chungbukensis DJ77 에서 16S rRNA 유전자에 대한 다중서열 검색의 결과를 통해 보존 부위와 가변 부위를 분석하였다. 동일한 Sphingomonas 속 뿐 아니라 이차 구조의 모델로 사용했던 E. coli에서 조차 대부분(87%)의 유전자 서열은 보존적이었다. 그러나, 비보존 서열로 이루어진 A 부터 G까지의 일곱 구역을 Sphingomonas 속의 가변 부위로 평가하였다(Table 2).
4). 또한, proteobacteria 수준에서 분석한 결과, X2와 서열은 다르지만, 구조적으로 유사한 stem loop 구조를 Campylobacter jejuni에서 발견하였다 (Fig. 5). X2 서열은 다른 Sphingomonas 종에서 발견되지 않은 것으로 보아 세대를 거쳐 삽입되었을 가능성이 있으나, 지역적으로 먼 위치(한국, 미국, 벨기에)에서 동정된 유전자들 사이의 구조적 불일치는 16S rRNA 유전자 서열로 계통을 동정하는 데 대한 한계를 보여준다.
이는 2000년도에 GenBank에 등록되었던 동일균주의 부분적인 16S rRNA 유전자(AE 59257)와 BLAST2를 사용하여 비교한 결과, 67 bp 차이를 보였다. 세부적으로 살펴보면, 재발굴한 16S rRNA 유전자는 GenBank에 등록된 서열보다 5' 방향으로 29 bp, 3' 방향으로 37 bp의 길이로 각각 확장되어 있으며, 1458번째 위치에 T 염기가 추가되었다.
yanoikuyae 등과 함께 그룹을 이루는 것으로 드러났으며, nucleotide signatures 의 검색 결과, 52:359(U:A), 134(G), 593(U), 987:1218(A:U), 990:1215(U:G) 위치의 서열이 정확히 cluster II 그룹과 일치했다. 이로써 S. chungbukensis DJ77은 Sphingomonas 속의 네그룹 중에서 cluster II (Sphingobium)로 분류됨을 확인하였다.
후속연구
특히, 16S rRNA 유전자 중에서 특정 분류군에만 존재하는 가변부위(variable region)는 종과 속간의 다양성을 발견하는 근거가 되며, 관련 연구에 응용될 수 있다 (2). 또한, 진화적으로 속도가 매우 느린 부위(constant region)도 보유하고 있어 많은 생물체의 공통된 보존염기서열과 이차 구조로부터 다양한 분류군의 상호 비교가 가능하다.
X2 서열은 다른 Sphingomonas 종에서 발견되지 않은 것으로 보아 세대를 거쳐 삽입되었을 가능성이 있으나, 지역적으로 먼 위치(한국, 미국, 벨기에)에서 동정된 유전자들 사이의 구조적 불일치는 16S rRNA 유전자 서열로 계통을 동정하는 데 대한 한계를 보여준다. 앞으로 다양한 접근을 통해 Sphingomonas 종간의 유연관계를 밝히는 연구를 진행하고자 한다.
해독된 16S rRNA 유전자의 염기서열은 계통 분류학적 분석을 통해 미생물간의 종, 속관계의 파악에 매우 유용하게 사용되며, 이를 응용한 연구도 진행되고 있다 (4, 12).특히, 16S rRNA 유전자 중에서 특정 분류군에만 존재하는 가변부위(variable region)는 종과 속간의 다양성을 발견하는 근거가 되며, 관련 연구에 응용될 수 있다 (2). 또한, 진화적으로 속도가 매우 느린 부위(constant region)도 보유하고 있어 많은 생물체의 공통된 보존염기서열과 이차 구조로부터 다양한 분류군의 상호 비교가 가능하다.
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