[국내논문]인체 피부 세포주 (HaCaT)에서 Kaempferol, Quercetin의 Hyaluronan 합성 촉진 효과에 대한 연구 The Effect of Kaempferol, guercetin on Hyaluronan-Synthesis Stimulation in Human Keratinocytes (HaCaT)원문보기
수분 보유력이 우수한 hyaluronan (HA)은 피부 보습에 관여하는 여러 물질들 중 하나로 피부의 extracellular matrix를 구성하는 주요 성분 중 하나이다. Glycosaminoglycans (GAGs)의 구성 성분의 하나로 과거에는 진피에서 유래하는 것으로 알려져 왔으나 최근 연구들을 통해 표피에서 합성되는 것이 확인되었다. Polyphenolic compound의 일종인 kaempferol과 quercetin은 채소류 같은 식물성 음식에 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, kaempferol은 인체 표피세포에서 glutathione 합성을 증가시키고 quercetin은 lipoxygenase inhibitor로 PPAR (peroxisome proliferator activated receptor) - mediated 표피세포 분화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 우리는 표피 세포주에서 이들 flavonoids -kaempferol, quercetin -의 HA 합성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 물질 처리에 따른 HA 합성 효소인 hyaluronan synthase 1, 2, 3 (HAS1, 2, 3) 유전자 발현의 변화를 semi-quantitative RT-PCR을 통해 살펴보았다. 이들 flavonoid들에 의해 24 h 후 HAS2, 3 mRNA 발현이 증가되는 것을 발견하였다. 또한 HA 합성량의 변화를 알아보기 위해 ELISA를 수행하였다. 24 h 물질 처리 후 배지를 수거하여 HA 합성량을 살펴본 결과 이들 물질에 의해 합성이 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 비록 합성 촉진에서의 효과가 retinoic acid에는 못 미치지만 kaempferol과 quercetin은 표피 세포주에서 농도 의존적으로 HA 합성을 증가시켰다. 위의 결과를 통해 flavonoid류인 kaempferol과 quercetin이 피부에서 HA 생산을 촉진시킴을 알 수 있었고 이를 통해 피부 보습과 잔주름 개선에 효과를 볼 수 있을 것으로 생각된다.
수분 보유력이 우수한 hyaluronan (HA)은 피부 보습에 관여하는 여러 물질들 중 하나로 피부의 extracellular matrix를 구성하는 주요 성분 중 하나이다. Glycosaminoglycans (GAGs)의 구성 성분의 하나로 과거에는 진피에서 유래하는 것으로 알려져 왔으나 최근 연구들을 통해 표피에서 합성되는 것이 확인되었다. Polyphenolic compound의 일종인 kaempferol과 quercetin은 채소류 같은 식물성 음식에 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, kaempferol은 인체 표피세포에서 glutathione 합성을 증가시키고 quercetin은 lipoxygenase inhibitor로 PPAR (peroxisome proliferator activated receptor) - mediated 표피세포 분화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 우리는 표피 세포주에서 이들 flavonoids -kaempferol, quercetin -의 HA 합성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 물질 처리에 따른 HA 합성 효소인 hyaluronan synthase 1, 2, 3 (HAS1, 2, 3) 유전자 발현의 변화를 semi-quantitative RT-PCR을 통해 살펴보았다. 이들 flavonoid들에 의해 24 h 후 HAS2, 3 mRNA 발현이 증가되는 것을 발견하였다. 또한 HA 합성량의 변화를 알아보기 위해 ELISA를 수행하였다. 24 h 물질 처리 후 배지를 수거하여 HA 합성량을 살펴본 결과 이들 물질에 의해 합성이 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 비록 합성 촉진에서의 효과가 retinoic acid에는 못 미치지만 kaempferol과 quercetin은 표피 세포주에서 농도 의존적으로 HA 합성을 증가시켰다. 위의 결과를 통해 flavonoid류인 kaempferol과 quercetin이 피부에서 HA 생산을 촉진시킴을 알 수 있었고 이를 통해 피부 보습과 잔주름 개선에 효과를 볼 수 있을 것으로 생각된다.
One of the key molecules involved in skin moisture is hyaluronan (hyaluronic acid, HA) with its associated water of hydration. The predominant component of the ECM (extracellular matrix) of skin is HA. It Is the primordial and the simplest of the GAGs (glycosaminoglycans), a water-sorbed macromolecu...
One of the key molecules involved in skin moisture is hyaluronan (hyaluronic acid, HA) with its associated water of hydration. The predominant component of the ECM (extracellular matrix) of skin is HA. It Is the primordial and the simplest of the GAGs (glycosaminoglycans), a water-sorbed macromolecule In extracellular matrix, Included between the vital cells of epidermis. In the skin, HA was previously thought to derive extlusively from dermis. But, recent studies revealed that HA could be synthesized in epidermis. Flavonoids are polyphenolic compounds that is found mainly in foods of plant origin. Kaempferol was known to increase glutathione synthesis in human keratinocyte. And quercetin blocked PPAR-meidated keratinocyte differentiation as lipoxygenase inhibitors. In this study, we sought to evaluate the effect of flavonid, kaempferol and quercetin on production HA in keratinocyte. We examined the changes of three human hyaluronan synthase genes (HASI, HAS2, HAS3) expression by semi-quantitative RT-PCR when kaempferol or quercetin was added to cultured human keratinocytes. We found that these flavonoids slightly upregulated HAS2, HAS3 mRNA after 24 h. And we investigated the effect on HA production by ELISA. When we evaluated the level of HA in culture medium after 24 h incubation. We found enhanced accumulation of HA in the culture medium. Although the effects of above flavonoids are less than retinoic acid, the data indicate that kaempferol, quercetin can dose-dependently increase the level of HA in epidermis cell line. It suggested that flavonoid, kaempferol, and quercetin increased production of HA in skin and it helped to elevate skin moisture and improve facial wrinkle.
One of the key molecules involved in skin moisture is hyaluronan (hyaluronic acid, HA) with its associated water of hydration. The predominant component of the ECM (extracellular matrix) of skin is HA. It Is the primordial and the simplest of the GAGs (glycosaminoglycans), a water-sorbed macromolecule In extracellular matrix, Included between the vital cells of epidermis. In the skin, HA was previously thought to derive extlusively from dermis. But, recent studies revealed that HA could be synthesized in epidermis. Flavonoids are polyphenolic compounds that is found mainly in foods of plant origin. Kaempferol was known to increase glutathione synthesis in human keratinocyte. And quercetin blocked PPAR-meidated keratinocyte differentiation as lipoxygenase inhibitors. In this study, we sought to evaluate the effect of flavonid, kaempferol and quercetin on production HA in keratinocyte. We examined the changes of three human hyaluronan synthase genes (HASI, HAS2, HAS3) expression by semi-quantitative RT-PCR when kaempferol or quercetin was added to cultured human keratinocytes. We found that these flavonoids slightly upregulated HAS2, HAS3 mRNA after 24 h. And we investigated the effect on HA production by ELISA. When we evaluated the level of HA in culture medium after 24 h incubation. We found enhanced accumulation of HA in the culture medium. Although the effects of above flavonoids are less than retinoic acid, the data indicate that kaempferol, quercetin can dose-dependently increase the level of HA in epidermis cell line. It suggested that flavonoid, kaempferol, and quercetin increased production of HA in skin and it helped to elevate skin moisture and improve facial wrinkle.
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제안 방법
PCR 결과를 agarose gel에 전기영동하고, 에티디움 브로마이 드(ethidium bromide)로 염색하였다. GAPDH를 증폭한 결과를 표준화를 위한 기준으로 삼았다.
HaCaT 세포에서 kaempferol과 quercetin, retinoic acid 를 처리한 후 HA 합성 효소의 발현을 mRNA 수준에서 살펴보았다.
HaCaT 세포에서 kaempferol과 quercetin을 농도별로처리한 후 HA 합성이 촉진되어 배지로 배출되는 양을 HA-ELISA kit를 이용하여 정량화 하였다.
94℃에서 5 min간 한번의 변성 사이클을 거친 다음 94℃ 에서 1 min, 55℃ 에서 1 min 및 72℃ 에서 1 min 30 s간의 cycle을 30회 반복하였다. PCR 결과를 agarose gel에 전기영동하고, 에티디움 브로마이 드(ethidium bromide)로 염색하였다. GAPDH를 증폭한 결과를 표준화를 위한 기준으로 삼았다.
계속해서 상기의 반응 혼합물 3 μL를 취하여 PCR 반 응에 사용하였다. 각각의 PCRe TaKaRa Ex Taq DNA 중합효소(5 U/nL, TaKaRa), 10 x Ex Taq Buffer, MgCh, dNTP Mixture 및 25 pM의 적절한 sense 또는 antisense PCR 프라이머 (Table 1)를 함유하는 반응 혼합물 20 μL 내에서 Perkin-Elmer Cycler 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster, CA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다.
위의 세포 배양을 통해 수거한 배지를 HA-ELISA Kit 를 이용하여 kaempferol과 quercetin에 의해 HaCaT 세포 에서 합성되어 배지로 배출되는 HA 합성량을 정량하였다.
정량한 RNA를 역전사하고, 이어 세 종류의 HA 합성 효소 HAS1, 2, 3에 특이적인 primer를 이용하여 각각의 정 량적인 PCR을 수행하였다. 총 RNA 4 #을 M-MuLV 역전사 중합효소(20 U/“L) 1 μL, RNAse 억제제(20 U/μL) 1 #L, 5xReaction Buffer 4 #L, 10 mM dNTP mix 2 μL, oligo (dT) 프라이머 (0.
처리 농도에서 세포 독성을 알아보기 위하여 96 well plate에 1 X lT/well의 세포를 분주하고 위의 조건으로 배양하여 MTT Assay kit 내의 protocal에 따라 562 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
ELIS A 를 수행하기 위해 Echelon 사의 Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit (HA-ELISA, Product No: K-1200)을 구입하였다.
기기는 ELISA reader, Perkin-Elmer Cycler 9600, agarose gel electrophoresis system 등을 사용하였다.
세포는 3일에 한번씩 신선한 배 지로 교체해 주고 밀도가 최상에 도달하자마자 1:5의 분 할 비로 2차 배양하였다. 물질을 처리하기 72 h 전에 조 직 배양 플라스크 75 cm?당 1 X 105개의 세포를 분주하 여, 10% FBS> 함유하는 배지에서 48 h 동안 배양하였다. 그 후 FBS가 없는 배지에서 24 h 동안 배양하고, kaempferol과 quercetin, retinoic acid을 각각 X 1000의 농도로 DMSO에 녹여 stock으로 만든 후 final 농도가 0.
본 연구에 사용한 HaCaT 세포주는 독일 암연구소 (DKFZ)의 Norbert E. Fusenig 박사로부터 분양 받았다. HaCaT 세포를 10% FBS (Hyclone 사), sodium bicarbonate 3.
실험에 사용된 시약으로 kaempferol, quercetin, retinoic acid, phosphate buffered saline (PBS), sodium bicarbonate 등은 Sigma (USA)사 제품을 사용하였고, trypsirV EDTA, penicillin/streptomycin, Dulbeccos Modification of Eagles medium (DMEM), Trizol 등은 Gilbco (USA) 사 제품을, FBS는 Hyclone사(USA) 제품을, RT-PCR kit 는 MBI Fermentas사(Lithuania) 의 First Strand cDNA Synthesis .kit를, PCRe Takara사(Japan) 의 Ex Taq kit 를 primer는 bioneer사(Republic of Korea) 제품을, ELISA 를 위해 Echelon사(USA)의 HA-ELISA Kit 등을 사용하였다.
이론/모형
처리 물질의 해당 농도에서 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.
성능/효과
HA 합성 효소 중 HAS2 유전자의 경우 DMSO와 물질 처리군에서 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었고 HAS3의 경우는 DMSO에서는 소량 검출되었으나 1과 10 #M 농도의 kaempferol과 quercetin을 처리한 세포에서 다소 증가한 것을 알 수 있었다. 양성대조군으로 사용한 retinoic acid의 경우는 0.
본 연구를 통해 flavonoid류인 kaempfer이과 quercetin 을 인체 표피 피부 세포주, 즉 각질형성 세포주인 HaCaT 에 처리하였을 때, HAS 유전자 발현의 증가와 이로 인한 HA 합성량의 증가를 확인하였다.
본 연구에서는 HA을 보다 효과적으로 인체에 공급할 수 있는 방법에 대하여 꾸준히 연구한 결과, 항암 효과, 항산화 효과 및 항염, 항알레르기 효과 등이 있는 것으로 알려진 flavonid류인 kaempferol과 quercetin0] 상기의 효능 뿐만 아니라, 인체 세포 내의 HA 합성효소 유전자의 발현을 증가시켜 결과적으로 인체 내의 HA의 생성을 촉진하는 효능이 있음을 발견하였다. 즉, kaempferol과 quer- cetin을 인체 표피 피부 세포주에 처리할 경우, 세포에 의한 HA의 생성이 촉진되고 생체 내의 HA의 양이 증가하므로, HA의 유용성을 이용하는 각종의 용도, 예를 들면 피부 탄력 증진, 피부 건조 방지 또는 피부 노화 방지와 같은 피부 개선 또는 예방 등의 부분에 이용할 수 있을 것으로 생각되어진다.
처리 물질인 kaempferol, quercetin, retinoic acid 모두 처리 농도에서 무처리군에 비해 95%의 신뢰도로 통계적 으로 유의하게 세포 독성이 없음을 확인할 수 있었다.
통계 분석을 통해 살펴본 결과, kaempferol과 quercetin 모두 1과 10 의 처리 농도에서 무처리에 비해 유의성(p<0.05) 있는 증가 결과를 보였다. 양성대조군인 retinoic acid 역시 0.
후속연구
HA 합성을 촉진하는 효능이 있는 것으로 밝혀진 kaem- pferol과 quercetine HA를 이용하는 각종 피부 외용제의 유효성분으로 사용하여 피부 탄력 증진, 건조 방지, 노화 방지 등의 용도로 사용될 수 있을 것으로 생각되어진다.
최근의 표피에서 hyaluronan synthase 유전자들의 cloning과 각질층 hyaluronan 의 발견은 기존의 진피에 초점이 맞추어지고 단순히 외 부에서 첨가하는 용도로만 생각했던 hyaluronan의 연구 방향을 표피세포 내에서의 작용과 내부인자를 통한 증가 측면으로 전환시키고 있다. 진피에 초점이 맞추어진 그리고 단순히 도포에 의미를 두고 있던 hyaluronan을 과학적으로 표피로 끌어내었고 앞으로 표피에서의 hyaluronan 에 대한 연구와 기전, 관련 물질 등에 관한 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되어진다.
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