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문제 정의
- 그러나 임프란트와 관련하여 골유착시 BMP가 어떻게 발현되고 어떠한 작용을 하는지에 대한 연구는 시도된 바가 없으며 단지 rh-BMP투여를 통해 골유착을 증진시키려는 연구만이 시도되었다. 본 연구는 실제 골유착시 BMP가 발현되는 지 여부를 알아보고자 하는 실험으로 가토의 경골에 임프란트를 식립후 3일, 7일, 14일, 28일경에 BMP2, BMP4의 발현을 확인하였다. 이는 골유착 증진방법으로 BMP 투여에 대한 이론적 근거를 확립하였다고 할 수 있다.
- 본 연구에서는 골유착과 관련된 6가지의 요인들은 동일한 조건으로 판단하고 일반적인 골유착시 발생되는 골형성 인자를 밝히고 아울러 임프란트에서 표면처리 방법을 달리 했을 때 즉 RBM과 Machined surface의 임프란트에서 골유착시 이들 성장인자가 어떻게 달리 발현되는지를 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 부가적으로 표면거칠기에 따른 골유착 효과의 차이를 성장인자의 발현차이로 규명하려고 하였다. 일반적으로 재료의 특성 즉, 표면 에너지, 표면 거침, 지형도(topography)가 임프란트와 조직간 경계면에 중요한 역할을 한다고 믿어짐에도 불구하고, 임프란트 주위의 골치유의 순차적 단계는 표면 자체 보다는 표면에 부착되어 있는 세포에 의해 좌우된다.
- 본 연구에서는 임프란트와 골간의 치유기전에 BMP2와 BMP4가 중요한 역할을 담당한다는 가설하에 임프란트 매식후 골유착 기간동안 BMP2, BMP4의 발현되는지 여부와 일반적인 골치유시 발현되는 BMP2, BMP4의 발현양과 어떠한 차이를 보이는 지 여부를 비교 분석하고, 또한 임프란트의 표면거칠기가 증가함에 따라 이들 성장인자들이 어떻게 발현되는 지를 비교분석하여 골유착에 대한 분자생물한적 기전을 규명하고자 한다.
제안 방법
- 각 인자에 대한 sense primer와 antisense primer을 적용하였다(Table 2). PCR 반응이 종료된 검체들에서 각 산물을 5㎕씩 취하여 6×loading buffer(0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% glycerol in water) 2 ㎕와 혼합하여 2% 한천 겔(agarose gel)에 100V에서 30분간 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 자외선 투사기로 관찰한 다음 폴라로이드 카메라로 촬영하여 검사한다.
- 전신마취를 위하여 Ketamin HCL (Ketalar, 유한양행, 한국) 30mg/kg와 Xylazine HCL(Rompun, 바이엘코리아, 한국) 10mg/kg를 혼합하여 근육 주사 하였다. 가토를 앙와위로 고정하고 양측 경골 내측부를 제모한 뒤 베타딘 용액을 도포하여 소독하고 국소마취와 지혈목적으로 1:100,000 epinephrine을 함유한 2% lidocaine HCL(유한양행, 한국)을 피하 주사 하였다. 경골 내측부를 절개하고 층별박리를 통해 경골을 노출시킨 후 경골 관절면에서 1cm 하방에 machined surface 임프란트를 식립하였다(Fig.
- 반응이 끝난 후 RT product 5㎕에 1×PCR buffer(Promega, USA), 10 pmol sense 및 antisense primer, 1 unit Taq polymerase 및 증류수를 가하여 총량을 25㎕로 한 후 58℃에서 30분간 처리한 후 다시 92℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초간 30회 실시한 후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 각 인자에 대한 sense primer와 antisense primer을 적용하였다(Table 2). PCR 반응이 종료된 검체들에서 각 산물을 5㎕씩 취하여 6×loading buffer(0.
- 각각의 실험군에서 한쪽의 경골부위에 RBM surface, Machined surface임프란트을 매식하고 실험군 옆부위에 와동을 형성한 대조군을 형성하였다.
- 가토를 앙와위로 고정하고 양측 경골 내측부를 제모한 뒤 베타딘 용액을 도포하여 소독하고 국소마취와 지혈목적으로 1:100,000 epinephrine을 함유한 2% lidocaine HCL(유한양행, 한국)을 피하 주사 하였다. 경골 내측부를 절개하고 층별박리를 통해 경골을 노출시킨 후 경골 관절면에서 1cm 하방에 machined surface 임프란트를 식립하였다(Fig. 1). 반대쪽을 같은 방법으로 수술하고 생리식염수로 깨끗이 세척한 뒤 3-0 흡수성 봉합사와 비흡수성 봉합사로 층별봉합한 뒤 모든 동물은 술후 감염예방과 저작곤란으로 인한 영양결핍을 방지하기 위하여 3일간 Gentamycin(20mg/ kg)과 Beecom을 근육 주사 하였다.
- 1). 반대쪽을 같은 방법으로 수술하고 생리식염수로 깨끗이 세척한 뒤 3-0 흡수성 봉합사와 비흡수성 봉합사로 층별봉합한 뒤 모든 동물은 술후 감염예방과 저작곤란으로 인한 영양결핍을 방지하기 위하여 3일간 Gentamycin(20mg/ kg)과 Beecom을 근육 주사 하였다.
- 1(Bio-RAD,USA)프로그램을 이용하여 발현차를 비교분석하였다. 분석방법은 각각의 사진에서 나타난 가장 어두운 배경부분을 542, 가장 밝은 부분을 1106으로 설정하고 발현부에 대한 절대치를 구하여 각 시기별, 군간의 발현차를 분석하였다.
- 수술 후 3일, 7일, 14일, 28일에 희생시킨 2마리의 좌측 경골부에서 R군, M군 임프란트를 각각 포함한 직경 7 mm 원통 형태의 골을 채취하여 실험군으로 하였고, 식립부에서 인접한 와동만 형성한 골을 채취하여 대조군으로 하였다. 이 골편들을 즉시 액화질소에 넣어 급냉시킨 뒤 막자사발에서 잘게 부수고 임프란트는 제거하고 Trizol (Invitrogen Co.
- 수술후 3일, 7일, 14일, 28일 각 시기에 채취된 임프판트 식립부와 골결손부를 치과용 교합필름을 이용하여 일정거리하에서 65kvp, 7.5mA, 25msec의 조건하에서 촬영하여 방사선학적 사진촬영을 하였다(Fig. 2).
- 수술후 3일, 7일, 14일, 28일에 각 실험군에서 2마리씩 희생시켜 조직표본을 채취하였다(Table 1). 탈회표본제작을 위하여 채취한 임프란트 식립부 검체를 10% 중성 포르말린에 3일간 일차 고정한 후 흐르는 물에서 세척하고 5%포름산과 구연산 나트륨을 동량으로 희석한 탈회액에서 5일간 탈회를 한다.
- 그후 조직을 조직캡슐에 넣어 흐르는 물에 12시간 동안 수세한 다음 glycolmethacrylate 레진 포매를 시행하였다. 임프란트을 포함하여 골을 절단 및 연마 장치를 이용하여 최종적으로 두께 50 μm의 표본을 만들었다. 제작된 절편은 Harri’s Hematoxylin을 여과지에 40분간 여과를 시행한 후 30분간 수세하고 Eosin 용액에 2분간 적용후 10분간 수세하여 H&E 염색을 시행한 후 광학현미경하에서 전반적인 조직학적 양상과 조직형태계측 프로그램(Kappa image base control 2.
- 전신마취를 위하여 Ketamin HCL (Ketalar, 유한양행, 한국) 30mg/kg와 Xylazine HCL(Rompun, 바이엘코리아, 한국) 10mg/kg를 혼합하여 근육 주사 하였다. 가토를 앙와위로 고정하고 양측 경골 내측부를 제모한 뒤 베타딘 용액을 도포하여 소독하고 국소마취와 지혈목적으로 1:100,000 epinephrine을 함유한 2% lidocaine HCL(유한양행, 한국)을 피하 주사 하였다.
- 임프란트을 포함하여 골을 절단 및 연마 장치를 이용하여 최종적으로 두께 50 μm의 표본을 만들었다. 제작된 절편은 Harri’s Hematoxylin을 여과지에 40분간 여과를 시행한 후 30분간 수세하고 Eosin 용액에 2분간 적용후 10분간 수세하여 H&E 염색을 시행한 후 광학현미경하에서 전반적인 조직학적 양상과 조직형태계측 프로그램(Kappa image base control 2.3.5, Olympus, Japan)을 이용하여 골유착 정도를 관찰하였다.
- 수술후 3일, 7일, 14일, 28일에 각 실험군에서 2마리씩 희생시켜 조직표본을 채취하였다(Table 1). 탈회표본제작을 위하여 채취한 임프란트 식립부 검체를 10% 중성 포르말린에 3일간 일차 고정한 후 흐르는 물에서 세척하고 5%포름산과 구연산 나트륨을 동량으로 희석한 탈회액에서 5일간 탈회를 한다. 그후 조직을 조직캡슐에 넣어 흐르는 물에 12시간 동안 수세한 다음 glycolmethacrylate 레진 포매를 시행하였다.
대상 데이터
- 체중 2.5 - 3 Kg의 가토 8마리를 암수 구별없이 실험동물로 사용하였으며 실온에서 동물용 고형사료와 물을 이용하여 일정기간 사육하였다. 치과 임프란트는 특별 제작 주문한 직경 3mm, 높이 5mm의 나선 형태의 동물실험용 임프란트(오스템, 한국)을 사용하였으며, Resorbable Blast Machined (RBM) surface, Machined surface 등 2가지 다른 표면구조를 가지고 있다.
- 5 - 3 Kg의 가토 8마리를 암수 구별없이 실험동물로 사용하였으며 실온에서 동물용 고형사료와 물을 이용하여 일정기간 사육하였다. 치과 임프란트는 특별 제작 주문한 직경 3mm, 높이 5mm의 나선 형태의 동물실험용 임프란트(오스템, 한국)을 사용하였으며, Resorbable Blast Machined (RBM) surface, Machined surface 등 2가지 다른 표면구조를 가지고 있다.
데이터처리
- 각 군에서 발현된 성장인자들의 PCR-product 상을 스캔 하여 Quantity one-4.4.1(Bio-RAD,USA)프로그램을 이용하여 발현차를 비교분석하였다. 분석방법은 각각의 사진에서 나타난 가장 어두운 배경부분을 542, 가장 밝은 부분을 1106으로 설정하고 발현부에 대한 절대치를 구하여 각 시기별, 군간의 발현차를 분석하였다.
성능/효과
- 결과적으로 BMP2와 BMP4 모두 실험군과 대조군에서 발현되었으나 실험기간동안 발현양상은 실험군에서는 시간이 지남에 따라 증가한 반면 대조군에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 실험군에서 표면의 차이에 따른 BMP2, BMP4의 발현 차이는 크지 않았으나 BMP4가 M군에 비해 R군에서 보다 증가된 발현현상을 보였다.
- 4). BMP4는 RBM군에서 매식 후 3일경에 발현되어 약간의 감소를 보이나 28일경에 발현량이 증가 되어 나타났으며, Machined surface군에서는 발현되어 감소 경향을 나타났다. 와동을 형성한 군에서는 발현되어 증가와 감소양상으로 진행되었으며, 28일경에는 초기에 비해 감소되는 경향을 보였다(Fig.
- RBM군에서는 골과 임프란트의 접촉율(BIC)이 3일째 8%, 7일째 5%, 14일째 8%, 28일째에는 35%로 증가되었으며, Machined surface군에서는 3일째 5%, 7일째 6.2%, 14일째 6.6%, 28일째에는 24%으로 증가 추세로 나타났다. 두 군에서 골과 임프란트의 접촉율이 증가되는 양상을 보이고 있었으며, 표면의 거칠기가 높은 RBM이 machined surface임프란트에 비해 28일째에 좀더 많은 접촉율을 보이고 있었다(Fig.
- 모든 임프란트가 피질골부위의 상부 구조를 제외하고 피질 골층에서 접촉되고 있었고, 골수내의 임프란트 나사산은 많은 골수 조직과 접촉을 이루고 있었다. RBM이 machined surface보다 골수내에서 더 많은 접촉을 이루고 있음을 확인 할 수 있었다.
- 결과적으로 BMP2와 BMP4 모두 실험군과 대조군에서 발현되었으나 실험기간동안 발현양상은 실험군에서는 시간이 지남에 따라 증가한 반면 대조군에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 실험군에서 표면의 차이에 따른 BMP2, BMP4의 발현 차이는 크지 않았으나 BMP4가 M군에 비해 R군에서 보다 증가된 발현현상을 보였다.
- 실험군에서 표면의 차이에 따른 BMP2, BMP4의 발현 차이는 크지 않았으나 BMP4가 machined surface 비해 RBM surface에서 보다 증가된 발현상을 보였다. 결론적으로 임프란트 골유착시 BMP2, BMP4는 골유착에 중요한 역할을 하는 성장인자로 특히 임프란트 표면거칠기가 증가할수록 이들 성장인자들의 작용이 증가하는 것으로 사료된다.
- 방사선 검사에서 임프란트 주변으로 골 흡수로 보이는 소견은 보이지 않아서, 골유착이 되어짐을 확인할 수 있었다. 대조군의 와동형성군에서는 시간의 경과에 따라 골의 치유가 이루어졌으며, 방사선상에서도 골의 불투과성이 증가함을 확인할 수 있었다.
- 6%, 28일째에는 24%으로 증가 추세로 나타났다. 두 군에서 골과 임프란트의 접촉율이 증가되는 양상을 보이고 있었으며, 표면의 거칠기가 높은 RBM이 machined surface임프란트에 비해 28일째에 좀더 많은 접촉율을 보이고 있었다(Fig. 3).
- 이는 본 연구에서 28일 째에도 초기와 유사한 발현을 보이는 것으로 알 수 있다. 또한 일반적인 골결손부의 골치유와 관련하여 골유착 기전 역시 큰 차이 없이 이러한 BMP의 발현을 통하여 골치유가 일어나는 것으로 생각되며 본 연구에서 대조군과 발현차이에서도 큰 차이를 보이지 않았다. 비록 다른 성장인자들에 대한 연구가 같이 시행되어지지는 않았지만 향후 BMP와 연관되어 다른 성장인자들의 발현에 대한 연구가 추가적으로 시행되면 골 유착에 관여하는 분자생물학적 기전(molecular mechanism)이 많은 부분 이해될 것으로 사료된다.
- 실험군의 RBM, Machined surface임프란트 모두에서 주변의 성숙한 피질골과 골내에서 골유착을 보이고 있다. 모든 임프란트가 피질골부위의 상부 구조를 제외하고 피질 골층에서 접촉되고 있었고, 골수내의 임프란트 나사산은 많은 골수 조직과 접촉을 이루고 있었다. RBM이 machined surface보다 골수내에서 더 많은 접촉을 이루고 있음을 확인 할 수 있었다.
- 조직학적 면에서도 매끄러운 표면에 비해 거친 표면에서 골의 생성이 증가되어짐을 확인되었으며, 이는 거친 표면의 생체역학의 증가됨을 뒷받침하는 것이다21-25). 본 연구에서는 RBM과 machined surface을 가진 타이타늄 임프란트를 이용하였는데, 표면이 거친 RBM surface(35%)가 machined surface(24%)보다 임프란트와 골과의 접촉률에 있어서는 더 높았다. 이는 표면이 거칠수록 더 임프란트 주변의 골형성이 증진된다는 다른 연구와 일치하는 결과이다.
- 이는 표면이 거칠수록 더 임프란트 주변의 골형성이 증진된다는 다른 연구와 일치하는 결과이다. 성장인자 발현 측면에서 BMP2와 BMP4의 발현이 표면이 거칠수록 더 많이 발현될 것으로 예상하였으나, BMP2, BMP4 모두 큰 차이를 보이지는 않았지만 주로 RBM에서는 초기의 발현양보다 계속적으로 증가하는 소견을 보였고 machined surface는 다소 불규칙적인 발현양상을 보였다. BIC에서도 초기보다는 골유착이 진행될수록 차이가 나타나는 소견을 보였는 데 이는 아마도 골유착이 진행될수록 BMP2, 4의 발현이 RBM에서 계속 증가되기 때문인 것으로 여겨진다.
- 결과적으로 BMP2와 BMP4 모두 실험군과 대조군에서 발현되었으나 실험기간동안 발현양상은 실험군에서는 시간이 지남에 따라 증가한 반면 대조군에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 실험군에서 표면의 차이에 따른 BMP2, BMP4의 발현 차이는 크지 않았으나 BMP4가 M군에 비해 R군에서 보다 증가된 발현현상을 보였다.
- BMP2와 BMP4 모두 실험군과 대조군에서 발현되었으나 실험기간동안 발현양상은 실험군에서는 시간이 지남에 따라 증가한 반면 대조군에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 실험군에서 표면의 차이에 따른 BMP2, BMP4의 발현 차이는 크지 않았으나 BMP4가 machined surface 비해 RBM surface에서 보다 증가된 발현상을 보였다. 결론적으로 임프란트 골유착시 BMP2, BMP4는 골유착에 중요한 역할을 하는 성장인자로 특히 임프란트 표면거칠기가 증가할수록 이들 성장인자들의 작용이 증가하는 것으로 사료된다.
- 실험군의 RBM과 Machined surface임프란트 식립후 3일, 7일, 14일, 28일간의 육안 및 방사선 검사을 시행하였으며, 주변 연조직의 긴장으로 인한 열개현상, 매식체의 노출이나, 염증반응은 일어나지 않았으며, 경조직에서 골흡수 양상이나 동요도의 증가 등은 보이지 않은 상태였다. 방사선 검사에서 임프란트 주변으로 골 흡수로 보이는 소견은 보이지 않아서, 골유착이 되어짐을 확인할 수 있었다.
- 임프란트와 골사이의 골유착을 향상시키기 위한 방법으로는 임프란트의 표면처리 방법, 골형성과 관련된 성장 인자 주입등의 방법이 소개되어졌다. 임프란트의 성공적인 골 유착은 표면 질감, 구조, 골과 인접한 조직간의 상호작용에 의해 얻어 질 수 있으며, 표면의 거칠기는 RBM surface가 machined surface보다 더 높으며 이는 골유착 정도가 향상될 수 있음을 알 수 있다. 임프란트의 표면과 관련하여 거칠기는 스트레스의 분산, 골내에서 임프란트의 유지, 임프란트 표면으로 직접적인 골의 성장, 기계적 연결과 관련이 되며, 재료의 표면 거칠기는 세포 기능, 기질의 축적, 무기질화에 영향을 준다3,4).
- 이는 골유착 증진방법으로 BMP 투여에 대한 이론적 근거를 확립하였다고 할 수 있다. 즉 골유착시 외인성 BMP를 투여하여 BMP 작용을 증가시키면 골유착 효과가 증진될 수 있다는 것을 암시한다. 시기와 관련하여서 BMP는 골유착 기간동안 계속적으로 발현되어 임프란트가 골에 안정화될 때까지 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다.
후속연구
- 또한 일반적인 골결손부의 골치유와 관련하여 골유착 기전 역시 큰 차이 없이 이러한 BMP의 발현을 통하여 골치유가 일어나는 것으로 생각되며 본 연구에서 대조군과 발현차이에서도 큰 차이를 보이지 않았다. 비록 다른 성장인자들에 대한 연구가 같이 시행되어지지는 않았지만 향후 BMP와 연관되어 다른 성장인자들의 발현에 대한 연구가 추가적으로 시행되면 골 유착에 관여하는 분자생물학적 기전(molecular mechanism)이 많은 부분 이해될 것으로 사료된다.
- 즉 표면거칠기에 따른 효과는 초기에 비슷한 양의 BMP가 발현되면서 유사한 골유착이 일어나지만 시간이 지날수록 거친표면에서 좀 더 많은 BMP가 발현되면서 골유착 효과가 증진되는 것으로 설명된다. 이에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각되며 또한 다양한 표면거칠기의 임프란트의 비교연구가 필요할 것으로 사료된다.
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