식용 및 약용 식물 215 종의 천연물로부터 추출부위를 달리한 메탄올 추출물 309 종을 조제하였으며, 안전성이 우수한 천연물 충치예방 및 치료제 개발을 목표로 309종의 추출물의 S. mutans JC-2에 대한 항균 활성을 평가하였다. 항균활성은 96 well microtiter method에 의한 생육저해능 측정 및 disk paper method에 의한 생육저지환 크기를 측정하여 평가하였으며, 그 결과 가죽나무(가지), 곰딸기(열매), 독활(잎), 상수리나무(잎), 여뀌(전초), 작약(종자), 짚신나물(뿌리) 추출물에서 강한 활성을 확인하였다. 상기 7종 천연물의 최소 생육저지농도(MIC)를 측정하여 항균 활성을 비교한 결과, 여뀌, 상수리나무, 가죽나무 추출물이 $25\∼30{\mu}g/ml $의 농도에서 생육을 완전히 억제하였다 이러한 결과는 항균력이 우수한 천연물로부터 새로운 충치 예방 및 치료제 개발이 가능함을 제시한다
식용 및 약용 식물 215 종의 천연물로부터 추출부위를 달리한 메탄올 추출물 309 종을 조제하였으며, 안전성이 우수한 천연물 충치예방 및 치료제 개발을 목표로 309종의 추출물의 S. mutans JC-2에 대한 항균 활성을 평가하였다. 항균활성은 96 well microtiter method에 의한 생육저해능 측정 및 disk paper method에 의한 생육저지환 크기를 측정하여 평가하였으며, 그 결과 가죽나무(가지), 곰딸기(열매), 독활(잎), 상수리나무(잎), 여뀌(전초), 작약(종자), 짚신나물(뿌리) 추출물에서 강한 활성을 확인하였다. 상기 7종 천연물의 최소 생육저지농도(MIC)를 측정하여 항균 활성을 비교한 결과, 여뀌, 상수리나무, 가죽나무 추출물이 $25\∼30{\mu}g/ml $의 농도에서 생육을 완전히 억제하였다 이러한 결과는 항균력이 우수한 천연물로부터 새로운 충치 예방 및 치료제 개발이 가능함을 제시한다
Oral streptococci are major constituents of dental plaques, and their prevalence is closely linked with various pathologic symptoms, such as dental caries. To develop natural anticaries agent, we prepared 309 kinds of plant extracts from 215 species of edible or medical plants, and antibacterial act...
Oral streptococci are major constituents of dental plaques, and their prevalence is closely linked with various pathologic symptoms, such as dental caries. To develop natural anticaries agent, we prepared 309 kinds of plant extracts from 215 species of edible or medical plants, and antibacterial activity of the extracts against Streptococcus mutans JC-2 were evaluated based on 96 well microtiter plate assay and disk paper method, subsequently. Among the tested plant extracts, Ailanthus altissima, Paeonia lactiflora, Rubus phoenicolasius, Aralia continentalis, Quercus acutissima, Persicaria hydropiper and Agrimonia pilosa extracts showed strong antimicrobial activity. Determination of minimal inhibitory concentration (MIC) of the selected seven plant extracts showed that Ailanthus altissima, Persicaria hydropiper and Quercus acutissima extracts ($MIC=25\∼30[\mu}g/ml$) has potential as a source of natural anticaries agents.
Oral streptococci are major constituents of dental plaques, and their prevalence is closely linked with various pathologic symptoms, such as dental caries. To develop natural anticaries agent, we prepared 309 kinds of plant extracts from 215 species of edible or medical plants, and antibacterial activity of the extracts against Streptococcus mutans JC-2 were evaluated based on 96 well microtiter plate assay and disk paper method, subsequently. Among the tested plant extracts, Ailanthus altissima, Paeonia lactiflora, Rubus phoenicolasius, Aralia continentalis, Quercus acutissima, Persicaria hydropiper and Agrimonia pilosa extracts showed strong antimicrobial activity. Determination of minimal inhibitory concentration (MIC) of the selected seven plant extracts showed that Ailanthus altissima, Persicaria hydropiper and Quercus acutissima extracts ($MIC=25\∼30[\mu}g/ml$) has potential as a source of natural anticaries agents.
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제안 방법
96 well microtiter plate assay에 의한 항균 활성의 측정: 96 well plate를 사용하여 각 well에 180 pl HIB 배지, 10 μ1의 시료와 10 μ1의 S. mutans 균액을 혼합하여 최종 부피가 200111 되도록 조정하였으며, 최종 시료농도는 100 pg/mlz 접종 농도는 if CFU/ml로 되도록 첨가하였다. 이후, 37℃에서 24시간 배양하고, UV-Visible spectrophotometer (Hitachi Co.
Disk paper method를 이용한 항균 활성의 측정: 96 well microtiter plate method에 의해 1차 선별된 시료의 항균 활 성은 HIB 고체 배지에서 disk paper (지름 6.5 mm, Whatman No. 2)를 이용한 생육저지환의 크기를 측정하여 재평가 하였 다[25]. 이때 시료의 농도는 disk당 100 ug을 사용하였으며, S.
MIC의 측정: 2차 선별된 7종의 천연물 시료의 항균 활성 은 microbroth dilution 법을 변형시켜 평가하였다[26 HIB 액체 배지 980 ill에 시료 10 pl (각각의 최종농도 0, 10, 15, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200 ug/ml) 와 균액 10 pl (106 CFU/ml)를 첨가하여, 37C에서 24시간 배양한 후 생육이 나타나지 않는 최저농도를 MIC로 결정하였다. 이때 실험의 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate를 각각 최 종농도1, 2, 3, 4 pg/ml 되도록 처 리하여 MIC를 결정하였다.
mutans 세포 농도는 1~2 CFU 되도록 도말한 후 37 ℃ 에서 24시간 배양 한 후 생육저지환의 크기(mm)를 측정하여 2차 선별하였다. 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate의 시 판 항세균제를 1 pg/ml 농도로 처리하였으며, 항세균 활성은 생육저지환의 크기로 나타내었다.
경북 및 강원도 일대에서 1995년에서 2004년 사이에 채집 한 식용 및 약용 식물 309 종을 대한식물도감μ9]에서 검증하 여, 그늘에서 일주일 간 건조 한 후 잘게 썰어 메탄올로 추출 하였으며, 추출액은 감압 농축하여 분말로 제조하여 사용 전 까지 저온 밀봉 보관하였다. 사용시에는 10 mg/ml의 농도로 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹인 후 항균 활성을 평가하였다. 사용한 식물 재료 및 추출 부위는 Table 1에 나타내었다.
, USA)를 사용하였다. 시료의 활성 평가를 위한 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate (Sigma Co., USA)를 DMSO에 적당한 농도로 녹여사용하였다.
식용 맟 약용 식물 215 종의 천연물로부터 추출부위를 달 리한 메탄올 추출물 309 종을 조제하였으며, 안전성이 우수한 천연물 충치예방 및 치료제 개발을 목표로 309종의 추출 물의 S. mutans JC-2에 대한 항균 활성을 평가하였다. 항균 활성은 96 well microtiter method에 의한 생육저해능 측정 및 disk paper method에 의한 생육저지환 크기를 측정하여 평가하였으며, 그 결과 가죽나무(가지), 곰딸기(열매), 독활 (잎), 상수리나무(잎), 여뀌(전초), 작약(종자), 짚신나물(뿌리) 추출물에서 강한 활성을 확인하였다.
MIC의 측정: 2차 선별된 7종의 천연물 시료의 항균 활성 은 microbroth dilution 법을 변형시켜 평가하였다[26 HIB 액체 배지 980 ill에 시료 10 pl (각각의 최종농도 0, 10, 15, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200 ug/ml) 와 균액 10 pl (106 CFU/ml)를 첨가하여, 37C에서 24시간 배양한 후 생육이 나타나지 않는 최저농도를 MIC로 결정하였다. 이때 실험의 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate를 각각 최 종농도1, 2, 3, 4 pg/ml 되도록 처 리하여 MIC를 결정하였다.
mutans 균액을 혼합하여 최종 부피가 200111 되도록 조정하였으며, 최종 시료농도는 100 pg/mlz 접종 농도는 if CFU/ml로 되도록 첨가하였다. 이후, 37℃에서 24시간 배양하고, UV-Visible spectrophotometer (Hitachi Co., JAPAN)로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 S. mutans1^ 대한 성장률을 측정하여 항균력을 평가하였다. 시료 처리시 용매 대조구는 DMSO를 5% (v/v)를 사용하였으며, 이 농도 까지는 S.
항균활성의 정량적 비교를 위해, 2차 선별된 7종 시료의 MIC를 측정하였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다. 짚신 나물(뿌리), 독활(잎) 추출물의 MIC는 각각 100 yg/ml, 여뀌 (전초), 작약(종자) 추출물의 MIC는 50 ug/m이며 가죽나무 (잎) 추출물이 30 pg/ml, 곰딸기(열매) 및 상수리나무(잎) 추 출물은 각각 25 ug/ml로 7종 모두 100 pg/ml 이 하의 MIC를 나타내었다.
대상 데이터
경북 및 강원도 일대에서 1995년에서 2004년 사이에 채집 한 식용 및 약용 식물 309 종을 대한식물도감μ9]에서 검증하 여, 그늘에서 일주일 간 건조 한 후 잘게 썰어 메탄올로 추출 하였으며, 추출액은 감압 농축하여 분말로 제조하여 사용 전 까지 저온 밀봉 보관하였다. 사용시에는 10 mg/ml의 농도로 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹인 후 항균 활성을 평가하였다.
mutans1^ 대한 성장률을 측정하여 항균력을 평가하였다. 시료 처리시 용매 대조구는 DMSO를 5% (v/v)를 사용하였으며, 이 농도 까지는 S. 의 성장저해는 나타나지 않았다. 성장 저해 율은 아래와 같이 계산하였다μ4].
실험에 사용한 균주는 원광대학교 치과대학 구강미 생물 실험 실에 보관중인 S. mutans JC-2를 분양 받아 4주마다 NA(Nutrient agar, Difco Co., USA)배지에 계대하여 사용하였다. 항균 활성 측정에 사용된 배지로는 HIB (Heart Infusion Broth, Difco Co.
, USA)배지에 계대하여 사용하였다. 항균 활성 측정에 사용된 배지로는 HIB (Heart Infusion Broth, Difco Co., USA)를 사용하였다. 시료의 활성 평가를 위한 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate (Sigma Co.
이론/모형
Table 2. Evaluation of antibacterial activity of first selected 10 plant extracts against S. mutans JC-2 based on disk paper method.
항균활성을 나타내는 천연물은 96 well microtiter plate assay, Disk paper method, MIC 측정의 3단계를 통해 최종선정하였다.
성능/효과
선별된 10종 천연물의 농도를 100 pg/disk로 조정하여 항 균활성을 disk paper method로 검정한 결과는 Table 2에 나타내었다. 가죽나무(가지), 곰딸기(열매), 독활(잎), 상수리나 무(잎), 여뀌(전초), 작약(종자), 짚신나물(뿌리) 7종의 시료에서 생육저지환의 크기가 7 mm 이상으로 우수한 활성이 나 타났으며, 대조구로 사용된 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate의 경우, 1 pg/disk 농도에서 생육저지환의 크기가 각각 17 mm, 11 mm, 15 mm로 나타나 강한 활성을 확인하였다. Table 2에 나타낸 것과 같이 1차 선별된 가죽나무 (잎 추출물), 멍석딸기 (잎 줄기 혼합 추출물), 둥근잎꿩의비 름 (꽃 추출물)의 경우에는 생육저지환이 나타나지 않았는 데, 이는 액체배지를 사용한 직접 접촉시험과 고체배지의 확 산 시험에서 차이가 나타난다는 최근의 보고[21, 22]와도 부 분적으로 일치된다.
mutans에 대한 항균력을 microtiter plate assay로 측정한 결과는 Table 1과 같다. 균주 생육이 80% 이상 저해되는 천연물 시료는 가죽나무(잎, 가지), 곰딸기(열매), 노루발(전초), 독활(잎), 둥근잎꿩의비름(잎), 멍 석딸기(잎, 줄기 혼합 추출물), 상수리나무(잎, 가지), 여뀌(전 초), 작약(종자), 짚신나물(뿌리)로 10 종이 확인되었다. 이중백작약의 경우 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Listeria JMonoq/fogeMes에 대한 미약한 항균 활성 (MIC = 2 mg/ml)0] 알려져 있고[9], 짚신나물의 경우 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus Mtilis에 대한 약한 항균 활성 (MIC = 0.
항균 활성은 96 well microtiter method에 의한 생육저해능 측정 및 disk paper method에 의한 생육저지환 크기를 측정하여 평가하였으며, 그 결과 가죽나무(가지), 곰딸기(열매), 독활 (잎), 상수리나무(잎), 여뀌(전초), 작약(종자), 짚신나물(뿌리) 추출물에서 강한 활성을 확인하였다. 상기 7종 천연물의 최 소 생육저지농도(MIC)를 측정하여 항균 활성을 비교한 결과, 여뀌 상수리나무, , 가죽나무 추출물이 25 - 30 ug/ml의 농 도에서 생육을 완전히 억제하였다. 이러한 결과는 항균력이 우수한 천연물로부터 새로운 충치 예방 및 치료제 개발이 가 능함을 제시한다.
조제된 309종의 천연물 추출물은 기존의 대 량검색[4]에 사용된 55종 시료와 비교할 때, 백선피, 백출, 비자, 시효, 천남 성, 천문동, 황기의 7종이 중복되었다. 309 종의 약용 및 식용 식물 메탄올 추출물을 이용하여 S.
Table 2에 나타낸 것과 같이 1차 선별된 가죽나무 (잎 추출물), 멍석딸기 (잎 줄기 혼합 추출물), 둥근잎꿩의비 름 (꽃 추출물)의 경우에는 생육저지환이 나타나지 않았는 데, 이는 액체배지를 사용한 직접 접촉시험과 고체배지의 확 산 시험에서 차이가 나타난다는 최근의 보고[21, 22]와도 부 분적으로 일치된다. 즉, 활성성분이 세포와 직접 접촉하는 액 체배지와 달리, 고체배지를 이용한 Disk paper method의 경우 활성성분의 확산도가 생육저지환 생성에 따른 활성평가 에 영향을 미칠 수 있음을 확인 하였다. 한편 가죽나무, 상수 리나무 추출물에서 보는 바와 같이 동일한 식물체임에도 불구하고 부위별 항균활성이 다르게 나타났으며, 이는 천연물 에서 활성 물질의 생성 시기, 생성 조직의 다양성; 활성물질 의 화학적 다양성에 기인하는 것으로 추측되었다.
즉, 활성성분이 세포와 직접 접촉하는 액 체배지와 달리, 고체배지를 이용한 Disk paper method의 경우 활성성분의 확산도가 생육저지환 생성에 따른 활성평가 에 영향을 미칠 수 있음을 확인 하였다. 한편 가죽나무, 상수 리나무 추출물에서 보는 바와 같이 동일한 식물체임에도 불구하고 부위별 항균활성이 다르게 나타났으며, 이는 천연물 에서 활성 물질의 생성 시기, 생성 조직의 다양성; 활성물질 의 화학적 다양성에 기인하는 것으로 추측되었다. 이러한 결 과는, 보다 다양한 식물체 부위별 활성을 조사할 필요성을 제기하며, 새로운 부위별 추출물에서 신규의 생리활성 물질 개발이 가능함을 의미한다.
mutans JC-2에 대한 항균 활성을 평가하였다. 항균 활성은 96 well microtiter method에 의한 생육저해능 측정 및 disk paper method에 의한 생육저지환 크기를 측정하여 평가하였으며, 그 결과 가죽나무(가지), 곰딸기(열매), 독활 (잎), 상수리나무(잎), 여뀌(전초), 작약(종자), 짚신나물(뿌리) 추출물에서 강한 활성을 확인하였다. 상기 7종 천연물의 최 소 생육저지농도(MIC)를 측정하여 항균 활성을 비교한 결과, 여뀌 상수리나무, , 가죽나무 추출물이 25 - 30 ug/ml의 농 도에서 생육을 완전히 억제하였다.
후속연구
한편 가죽나무, 상수 리나무 추출물에서 보는 바와 같이 동일한 식물체임에도 불구하고 부위별 항균활성이 다르게 나타났으며, 이는 천연물 에서 활성 물질의 생성 시기, 생성 조직의 다양성; 활성물질 의 화학적 다양성에 기인하는 것으로 추측되었다. 이러한 결 과는, 보다 다양한 식물체 부위별 활성을 조사할 필요성을 제기하며, 새로운 부위별 추출물에서 신규의 생리활성 물질 개발이 가능함을 의미한다.
mutans JC-2에 대한 생육 저해능을 평가하여, 여뀌, 상수리나 무, 독활, 작약, 짚신나물, 곰딸기, 가죽나무 추출물을 선정하였으며, 7종의 선정물질에 대한 MIC (Minimal Inhibitory Concentration)!- 측정하여 최종적으로 가죽나무(가지), 여뀌 (전초), 상수리나무(잎)에서 강력한 항균력을 확인하였다. 이러한 결과는 약용 및 야생 식물 자원으로부터 S. 에 대한 항균력을 나타내는 새로운 항우식증 예방 및 치료제 개 발이 가능함을 제시하며, 또한 활성성분의 규명에 따른 식품 첨가물 및 구강세척제 개발로 이어질 수 있음을 암시한다.
상기 7종 천연물의 최 소 생육저지농도(MIC)를 측정하여 항균 활성을 비교한 결과, 여뀌 상수리나무, , 가죽나무 추출물이 25 - 30 ug/ml의 농 도에서 생육을 완전히 억제하였다. 이러한 결과는 항균력이 우수한 천연물로부터 새로운 충치 예방 및 치료제 개발이 가 능함을 제시한다.
최근에는 광범위한 천연물 추출물을 대상으로 다양한 병원균, 식품 위해균에 대한 항균물질의 선 별[26]이 시도된 바 있으며, 항우식 활성의 경우에도 55종의 천연물에 대해 활성평가[4]가 시도된바 있다. 이러한 광범위한 천연물의 활성평가는 보다 효율적으로 신규의 안전성이 확보된 천연항균제를 개발하는데 도움이 될 것이다.
mutanse 대한 황련 메탄올 추출물μ이, 다시마 80% 에탄올 추출물[13] 및 두송실 추출물[23]의 MIC가 각각 130 ug/ml, 190 pg/ml, 100 ug/ml인 점을 감안하면, 선정 추출물의 낮은 MIC는 7종 시료의 추출물이 매우 강력한 항 균 활성물질을 포함하고 있음을 의미한다. 특히 S. mwtans에 대한 MIC가 50 ug/ml 이하인 가죽나무, 곰딸기 및 상수리나 무 추출물의 경우, 항우식 활성 및 활성물질이 알려져 있지 않으나, 활성물질의 정제를 통해 안전성이 우수한 물질이 확 보된다면 새로운 충치예방 및 치료제 개발이 가능할 것으로 판단된다.
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