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문제 정의
- 본 실험에서는 지유(地楡) n-BuOH 소분획물의 항산화활성을 확인하였으며, 치주질환 효능 소재로 활용하고자 GTase 억제 효과와 S. mutans 항균효과를 함께 검증하였다. 실험을 통하여 분석한 결과 아래와 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 항산화, 항균 효과가 우수한 천연소재 개발의 일환으로 한약재로 사용되어지고 있는 지유(地楡) 70% acetone 추출물에서 분획한 n-BuOH 분획물을 polystylene과 divinyl benzene이 중합된 수지 Diaion Hp-20 컬럼을 통과시켜 확보한 fraction(Fr-1∼Fr-5)에서 항산화활성을 확인하였으며, 치주질환 효능 소재의 개발을 위한 기초 자료를 제공하기 위하여 GTase 억제 효과와 S. mutans 항균 효과를 함께 검토 하였다.
제안 방법
- 1 mL접종하여 3~6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수가 약 1×107 cells이 되게 접종 하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 filter paper disc (8 mm, Whatman, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 50 uL/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18~24시간 배양하여 disc 주위의 clear zone (mm)의 직경을 측정하였다.
- 시료의 제조는 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 70% 아세톤을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출 하여 추출물을 얻었다. 지유(地楡) 아세톤 추출물을 수용액으로 현탁하여, 용매의 극성에 따라 CHCl, EtOAc, n-BuOH, H2O 층으로 순차적으로 용매 분획하여 Fig.
- 02% 첨가하여 GTase 조효소액을 제조하였다. 조효소액 0.5mL에 2% sucrose 1mL과 농도별 시료 0.05mL를 첨가하고 37℃, 24시간 반응시킨 후 voltex하여 생성된 glucan을 분산시키고 660 nm에서 탁도를 측정하여 sucrose 무첨가군과 비교한 상대치로 glucan 생성 억제 정도를 측정하였다.
- 지유(地楡) n-BuOH 분획물 fraction의 항균 효과를 알아보기 위하여 S. mutans 균 배양 한 후 시료를 농도별 (1. 2. 4 %)로 처리하여 24∼48 시간 후에 항균활성을 확인하였다.
- mutans의 활성을 저해하여 GTase 활성을 저해함으로써 치주질환을 개선시킬 수 있으며, 구강내의 종합적인 치료와 예방을 위해서는 항균과 항산화 반응을 핵심으로 연구하는 것이 중요하다고 사료된다. 지유(地楡) n-BuOH 분획물에서 활성이 높은 부분을 분리하기 위하여 Diaion Hp-20 컬럼을 통과시켜 유기화합물을 흡착시킨다음 유기용매의 비율을 높여 극성이 큰 화합물로 부터 극성이 작은 화합물 순으로 소분획하여 활성검증을 실시하였다. 본 연구의 실험결과에서 지유(地楡)에서 분리한 5가지 화합물 (Fr-1∼Fr-5)의 항균실험은 충치원인균인 S.
- 그리고 Fr-2, 5 에서는 항균활성을 나타내지 않았지만, Fr-3, 4, 5에서는 2% 농도에서 생육저해 환이 형성되었으며, 추출물의 농도에 비례하여 항균활성이 증가함을 알 수 있었다. 항산화력 측정실험에서는 Fr-2와 Fr-3에서 가장 높은 DPPH radical 소거능과 Superoxide anion radical 소거활성을 확인하였다. SOD 유사활성능 측정에서는 DPPH radical 소거능과 Superoxide anion radical 소거능 보다는 활성이 낮음을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 지유(地楡)는 경북 안동시 북후면에서 채취한 오이풀의 뿌리를 건조하여 이물질을 제거하고 세척한후, 음건하여 실험재료로 사용하였으며, 표본시료는 대구한의 대학교 화장품약리학과 신소재실험실에 보관하고 있다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, 그 외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 BOD Incubator (Hanbaek Co. Korea), autoclave (Hanbaek Scientific Co. Korea), ELISA reader (Molecular Devices, USA) 등을 사용하였다.
- 지유(地楡) 아세톤 추출물을 수용액으로 현탁하여, 용매의 극성에 따라 CHCl, EtOAc, n-BuOH, H2O 층으로 순차적으로 용매 분획하여 Fig. 1.과 같이 n-BuOH 분획물을 얻은 후, Diaion Hp-20컬럼을 이용하여 H2O : MeOH (0:100% → 100%:0) 통과 시켜 본 실험의 시료로 사용하였다.
- 항균력 측정 실험에서 사용한 공시 균주는 충치균 Streptococcus mutans (KCCM 11823)을 계대 배양하여 사용하였다. 전 배양 및 본 배양을 위한 액체배지는 brain heart infusion(BHI)를 Difco Lab.
이론/모형
- DPPH 전자공여능 (EDA; electron donating ability)은 Blois의16) 방법에 따라 측정하였다. 각 시료용액 2 mL에 0.
- SOD 유사활성은 Marklund의18) 방법에 따라 측정하였다. 각 시료용액 0.
- Superoxide anion radical 소거능은 nitro-blue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다17). 각 시료 용액 0.
- 각 시료의 GTase에 의한 gulcan의 합성을 저해하는 정도를 비교하기 위하여 Miyoshi의19) 방법을 사용하였다. S.
- 항균력 측정은 paper disc법20)으로 측정하였다. 평판 배지에 single colony 배양된 각 균주를 1 백금이를 취해서 액체 배지 10 mL에서 18～24시간 배양하여 활성화시킨 후, 다시 액체배지 10 mL에 균액을 0.
성능/효과
- 1. 지유(地楡) n-BuOH 분획물의 Fr-3이 DPPH radical과 Superoxide anion radical 소거능에서 가장 높은 효능 효과를 확인하였으며, 시료의 농도에 비례하여 활성이 증가함을 확인하였다.
- 2. 지유(地楡) n-BuOH 분획물(Fr-1∼Fr-5)의 SOD 유사활 성능은 500ug/ml의 농도에서 50% 이상의 효능으로 같은 농도에서 radical 소거능과 비교하면 낮은 효능효과를 확인하였다.
- 3. 지유(地楡) n-BuOH 분획물의 Gtase 억제능은 Fr-3이 가장 높은 효능을 나타내었으며, 500ug/ml의 농도에서 50%에 가까운 억제능을 확인하였다.
- 4. 지유(地楡) n-BuOH 분획물은 구강 내 충치원인균인 S. mutans의 활성을 효과적으로 저해하였으며, 농도 의존적으로 활성이 증가하였다.
- 대조군인 Vit.C와 비교하면 낮은 효능 효과를 확인하였지만, 시료의 농도가 증가함에 따라 활성이 증가함을 확인하였다.
- SOD 유사활성능 측정에서는 DPPH radical 소거능과 Superoxide anion radical 소거능 보다는 활성이 낮음을 확인하였다. GTase 억제능 실험에서는 전체 시료에서 60% 이하의 낮은 저해활성을 보였지만 양성대조군인 EGCG의 GTase 억제능이 60% 정도의 저해활성을 보임과 비교하면 양호한 활성을 확인 하였다. GTase 억제능에서도 Fr-3과 Fr-2의 시료가 가장 우수한 효능을 보임이 산화적 스트레스가 GTase 억제능에 연관관계가 있다는 보고와도 일치하였다.
- S. mutans의 GTase 활성저해가 가장 유효한 충치 예방수단으로 인정되고22) 있으므로 지유(地楡) n-BuOH 분획물 fraction의 Gtase의 활성에 미치는 영향을 확인한 결과 Fig. 5와 같이 전체 fraction에서 60% 이하의 낮은 저해활성을 보였지만 양성대조군인 EGCG의 GTase 억제능이 60% 정도의 저해활성을 보임과 비교하면 양호한 활성을 확인하였다. 또한 농도 의존적으로 GTase 활성이 증가하였다.
- 항산화력 측정실험에서는 Fr-2와 Fr-3에서 가장 높은 DPPH radical 소거능과 Superoxide anion radical 소거활성을 확인하였다. SOD 유사활성능 측정에서는 DPPH radical 소거능과 Superoxide anion radical 소거능 보다는 활성이 낮음을 확인하였다. GTase 억제능 실험에서는 전체 시료에서 60% 이하의 낮은 저해활성을 보였지만 양성대조군인 EGCG의 GTase 억제능이 60% 정도의 저해활성을 보임과 비교하면 양호한 활성을 확인 하였다.
- Xanthine oxidase에 의해 생성되는 radical의 생성저해 효과는 Fig. 3과 같이 지유(地楡) n-BuOH fraction (50 μg/mL)에서 Fr-3 (78%)와 Fr-2 (60%)의 높은 radical 소거능을 확인하였으며, Fr-2와 Fr-4, 5는 60% 이하의 radical 소거능을확인하였다.
- 6 에서 나타난 바와 같이, 지유(地楡) n-BuOH 분획물 fraction을 1%, 2%, 4%의 농도로 처리하였을 때 clear zone이 형성되었으며, a, b, f (water, Fr-1, 5)에서는 항균활성을 나타내지 않았다. c, d, e (Fr-2, 3, 4) 의 2% 농도에서 각 8 mm, 7 mm, 7 mm, 생육저해 환이 형성되었으며 추출물의 농도에 비례하여 효능이 증가하는 것을 알 수 있었다 (Table 2).
- 4 %)로 처리하여 24∼48 시간 후에 항균활성을 확인하였다. 결과 Fig. 6 에서 나타난 바와 같이, 지유(地楡) n-BuOH 분획물 fraction을 1%, 2%, 4%의 농도로 처리하였을 때 clear zone이 형성되었으며, a, b, f (water, Fr-1, 5)에서는 항균활성을 나타내지 않았다. c, d, e (Fr-2, 3, 4) 의 2% 농도에서 각 8 mm, 7 mm, 7 mm, 생육저해 환이 형성되었으며 추출물의 농도에 비례하여 효능이 증가하는 것을 알 수 있었다 (Table 2).
- mutans의 활성을 효과적으로 저해 시켰다. 그리고 Fr-2, 5 에서는 항균활성을 나타내지 않았지만, Fr-3, 4, 5에서는 2% 농도에서 생육저해 환이 형성되었으며, 추출물의 농도에 비례하여 항균활성이 증가함을 알 수 있었다. 항산화력 측정실험에서는 Fr-2와 Fr-3에서 가장 높은 DPPH radical 소거능과 Superoxide anion radical 소거활성을 확인하였다.
- 3과 같이 지유(地楡) n-BuOH fraction (50 μg/mL)에서 Fr-3 (78%)와 Fr-2 (60%)의 높은 radical 소거능을 확인하였으며, Fr-2와 Fr-4, 5는 60% 이하의 radical 소거능을확인하였다. 대조군인 vit-C와 비교할 때 Fr-5를 제외한 다른 fraction에서 vit-C보다 우수한 효능을 확인하였다.
- 본 연구의 실험결과에서 지유(地楡)에서 분리한 5가지 화합물 (Fr-1∼Fr-5)의 항균실험은 충치원인균인 S. mutans의 활성을 효과적으로 저해 시켰다.
- 이상의 실험결과 지유(地楡) n-BuOH 분획물이 우수한 항균력과 항산화 효능을 가지는 것으로 확인되었으며, 구강 질환을 개선하고 치료하는데 있어 합성제제 들을 대체 할 수 있는 치료 보조제로 적용 가능성이 있다고 본다.
- 또한 농도 의존적으로 GTase 활성이 증가하였다. 이와같은 결과로 GTase 억제능은 극성이 낮은 fraction 보다는 극성이 높은 fraction에서 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.
- 지유(地楡) n-BuOH 분획물 fraction 의 SOD 유사활성을 측정한 결과 Fig. 4과 같이 Fr-3 (1000μg/mL) 농도에서 76.1%의 효능 효과를 확인하였다.
- 지유(地楡) n-BuOH 분획물의 fraction의 전자공여능을 측정결과는 Fig. 2 에서와 같이 50 μg/mL 농도에서 Fr-2 (89.9%), Fr-3 (88.7%), Fr-4 (76.3%), Fr-1 (59.4%), Fr-5 (56.2%) 순으로 radical 소거능을 확인하였으며, Fr-2에서 가장 높은 전자공여능을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 2%) 순으로 radical 소거능을 확인하였으며, Fr-2에서 가장 높은 전자공여능을 확인 할 수 있었다. 대조군 EGCG와 비교하면 동일한 농도에서 다소 낮은 효능을 나타냈지만 EGCG는 단일물질이며 Fr-2를 ODS colum으로 분리 한다면 더 높은 효능효과를 기대 할 수 있으리라 사료된다.
- GTase 억제능에서도 Fr-3과 Fr-2의 시료가 가장 우수한 효능을 보임이 산화적 스트레스가 GTase 억제능에 연관관계가 있다는 보고와도 일치하였다. 본 연구를 종합한 결과 지유(地楡)는 우수한 항산화 활성, 항균활성 및 GTase억 제능을 확인함으로 구강의 종합적인 질환들을 개선하고 예방할 수 있음을 기대할 수 있다고 사료되며, 관련 제품을 개발 할때 본 연구결과를 기초자료로 활용할 수있으리라 사료된다.
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