[논문]율피 추출물이 티로시나아제 유전자 발현에 미치는 효과

진종언; 김관천

율피 추출물이 티로시나아제 유전자 발현에 미치는 효과
Effect of Chestnut Bark Extracts on Tyrosinase Gene Expression 원문보기

大韓衛生學會誌 = The Korean journal of sanitation, v.20 no.3 = no.57, 2005년, pp.10 - 16

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Chestnut bark extract by methanol repressed the expression of tyrosinase gene of B16 mouse melanoma cell containing tyrosinase promoter. $10{\mu}g/ml{\ell}\;100{\mu}g/m{\ell}$, $1mg/m{\ell}$ of the extract repressed expression of tyrosinase gene about $38\%,\;47\%,\;and\;78\%$, respectively, compared with control. In the MTT assay, the same extract exhibited very low cytotoxicity at $1{\mu}g/m{\ell},\;10{\mu}g/m{\ell},\;100{\mu}g/m{\ell},\;and\;1mg/m{\ell}$, respectively. The fractions of Methylene chloride and ethyl acetate did not showed the repressive effect on the expression of tyrosinase gene, but the fraction of butyl alcohol repressed highly at $10{\mu}g/m{\ell}\;and\;100{\mu}g/m{\ell}$.

주제어

AI 본문요약
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1. Values are the means of results from triplicate experiments.

제안 방법

B16 mouse melanoma cell 을 RPMI Medium 1640 평판배지에 세포수가 3~이 되도록 접 종한 후 24시간 배양한 다음, 배양액 1 ㎖에 6 pl LipofectAmine 과 2 ug 의 total plasmid DNA/를 5시간 처리함으로써 형질전환을 실시하였다.
B16 mouse melanoma celle 10%(v/v)의 Fetal Bovine Serum(FBS, GibcoBRL), l%(v/v) Ant- ibiotic(Gibco BRL), 그리고 2mM의 L-glutamine이 포함된 RPMI Medium 1640(GibcoBRL, RMPI Medium 1640 완전배지)에서 CC>2 분압을 5.0%로 조절하여 37℃에서 배양하였으며, 세포는 36-48 시간 주기로 계대배양하여 유지하였다.
B16 mouse melanoma cell내에 티로시나아제 프 로모터가 삽입된 유전자를 도입하기 위해 Lipo- fectAMINE(Life Technologies Inc.)을 이용한 다음과 같은 방법으로 stable transfection을 실시하였다.
Plasmid DNA는 luciferase gene-fr 지닌 pGL2- vector(Promega) SmaL site 에 1.5Kb 의 neomycin 저항성 유전자를 삽입한 다음 1.0 Kb의 사 람 티로시나아제 프로모터를 EcoBI/KpnL site에 클로닝을 하였다.
Stable transfection 처리 5시간 후 B16 mouse melanoma cell로부터 LipofectAMINE 시약과 재조 합 된 DNA가 함유된 배지를 제거한 후 콜로니가 형성될 때까지 Geneticin(600 jig/mZ)이 들어있는 선택배지에서 배양한 후 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell을 선별하였다.
형질전환 된 B16 mouse melanoma cell을 RPMI Medium 1640 완전배지가 들어있는 24 well plate에 세포수가 well당 6xl04 되게 접종한 다음 24시간 배양하였다. 그 후 각각의 well에 율피 메탄올 추출물은 10 μg/㎖, 100 μg/㎖, 1 mg/M의 농도로, 그리고 용매 분획물은 각각 1 pg/m£, 10 μg/㎖, 100 μg/㎖, 500 μg/㎖ 농도로 6 시간 처리한 다음 luciferase 활성도를 측정하여 티로시나아제유전자 발현에 미치는 효과를 조사하였다.
2xl04 되게 접종한 다음 24시간 배양하였다. 그 후 율피 메탄올 추출물을 각각의 well에 1 μg/㎖, 10 μg/㎖, 50 μg/㎖, 그리고 100 μg/㎖의 농도로 6 시간 처리한 다음 Mos- mann2®의 방법에 따라 MTT assay를 실시하여 세포독성을 평가하였다.
분말로 된 추출물 및 분획물 100 mg에 에탄올과 디메칠설퍼옥사이드 (dimethyl sulfoxide) 가 1:1로 혼합된 용매 1 ㎖씩을 가하여 완전히 용해시킨 후 여과하여 티로시나아제 유전자 발현율과 세포독성 측정에 이용하였다.
본 연구에서는 티로시나아제 효소의 활성을 저 해하는 효과가 있다고 알려진 참나무과(Fagaceae) 식물 밤나무(Costanea mollissma) 열매의 속껍질, 즉 율피(Chestnut bark)로부터 물질을 추출 . 분획 하여 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처 리하여 티로시나아제 유전자의 발현 및 세포독성 에 미치는 효과를 조사하였다.
세포 내 유전자 도입을 통해 얻은 B16 mouse melanoma cell의 형질전환 유무를 확인하기 위하여 luciferase 활성도를 측정하였다. 형질전환을 통하여 얻은 콜로니들을 Trypsin-EDTA를 처리하여 떼어낸 후 24 well plate에 세포수가 well당 6xl04 되게 분주하여 24시간 배양하였다.
시료의 추출은 건조된 생약을 세절하여 0.1 kg씩 을 취한 다음 메탄올을 가하여 실온에서 1 주일 동안 정치시킨 후 3회 추출 . 여과 하였다.
건조시킨 후 분말형태로 제조하였다. 용매분획은 농축된 메탄올 추출물 을 증류수로 현 탁한 다음, 극성도가 다른 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물을 이용하여 4개의 층으로 분획하여 메탄올 추출물과 같은 방법으로 농축하였다. 그리고, 이 농축물은 동결 .
티로시나아제 프로모터를 도입하여 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell 은 위의 RPMI Medium 1640 완전배지에 Geneticin(200 ug/mC)을 가한 선 택배지를 이용하여 유지하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 율피는 광주시내 한약 건재상 에서 구입하여 감정한 후 사용하였으며, 표품은 동 강대학 피부미용과 향장연구실에 보관하였다.
본 연구에서는 티로시나아제 효소의 활성을 저 해하는 효과가 있다고 알려진 참나무과(Fagaceae) 식물 밤나무(Costanea mollissma) 열매의 속껍질, 즉 율피(Chestnut bark)로부터 물질을 추출 . 분획 하여 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처 리하여 티로시나아제 유전자의 발현 및 세포독성 에 미치는 효과를 조사하였다.
8의 25 mM Tris-Phosphate 완충용액으로 용해하였다. 용해된 세포들을 취하여 원심분리한 다음 얻어진 상등액에 대해 Luminometer(Lumat LB 9507, BertholdX 이용하여 luciferase 활성도를 측정하 였으며 luciferase 활성도가 가장 높게 나타난 B16 mouse melanoma cell을 선별하여 본 실험에 이용 하였다.

이론/모형

Then, the cells were solubilized with lysis buffer and centrifuged at 13,000 × g for 2~3 minutes. The supernatants were used for luciferase assay. Values are the means of results from triplicate experiments.

성능/효과

2. Transfected B16 melanoma cells were incubated with 6×104 in RPMI 1640 medium for 24 hours and treated solvent fractions of chestnut bark for 6 hours. Then, the cells were solubilized with lysis buffer and centrifuged at 13,000 × g for 2—3 minutes.
그러나 methylene chloride 용매 분획 물은. 500 μg/㎖의 고농도 에서 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내었지만 세포가 분해될 정도로 매우 심한 독성을 나타내 그 효과는 세포독성과 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었다. Butyl alcohol과 물 용매로 분획하여 얻은 율피 주줄물은 methylene chloride 또는 ethyl acetate 용매로 분획하여 얻은 것과는 달리 저농도에서도 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다.
500 μg/㎖의 고농도 에서 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내었지만 세포가 분해될 정도로 매우 심한 독성을 나타내 그 효과는 세포독성과 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었다. Butyl alcohol과 물 용매로 분획하여 얻은 율피 주줄물은 methylene chloride 또는 ethyl acetate 용매로 분획하여 얻은 것과는 달리 저농도에서도 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다. 특히, 율피의 butyl alcohol 분획물은 lpg/me, 10iig/m£, lOOpg/me, 500μg/㎖의 농도로 처리하였을 때 모든 농도에서 대조군에 비해 약 18-66% 정도 티로시 나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 보여 주 었으며, 세포독성은 매우 낮게 나타났다.
멜라닌 색소 생성에 관여하는 티로시나아제 유 전자의 발현을 억제하는 물질을 탐색하고자 티로 시나아제 프로모터를 지닌 B16 mouse melanoma cell에 율피 메탄올 추출물을 처리한 바 율피 메탄 올 추출물은 lOμg/㎖, 100μg/㎖, lmg/㎖의 농도에서 대조군에 비해서 약 38%, 47% 78%의 억제효과를 나타냈으며, 세포생존율은 lμg/㎖ 10μg/㎖, 100μg/㎖, 의 율피 메탄올 추출물 농도에서 약 98%, 98%, 79%, 74%로서 세포독성이 낮게 나타났다. Methylene chloride와 ethyl acetate 분획물은 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과가 없었지만 buthyl alcohol과 물 분획물은 유전 자 발현 억제효과를 나타내었으며, 특히 butyl alcohol 분획물은 lOμg/㎖, 100μg/㎖, lmg/㎖의 농도 에서 각각 약 38%, 36%, 34%의 발현율을 나타냄 으로써 대조군에 비해 티로시나아제 유전자의 발 현을 크게 억제하였다.
특히, 율피의 butyl alcohol 분획물은 lpg/me, 10iig/m£, lOOpg/me, 500μg/㎖의 농도로 처리하였을 때 모든 농도에서 대조군에 비해 약 18-66% 정도 티로시 나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 보여 주 었으며, 세포독성은 매우 낮게 나타났다. 그리고,이 분획물의 티로시나아제 유전자의 발현 억제효 과는 lμg/㎖, lOμg/㎖, lOOμg/㎖의 농도에서 메탄올 추출물에 비하여 약 15-24% 정도로 보다 향 상되었다. 한편, 율피의 물 분획물은 티로시나제 유전자의 발현을 억제하였지만 butyl alcohol 용매 분획물에 비해 그의 효과가 상대적으로 낮게 나타났다.
멜라닌 색소 생성에 관여하는 티로시나아제 유 전자의 발현을 억제하는 물질을 탐색하고자 티로 시나아제 프로모터를 지닌 B16 mouse melanoma cell에 율피 메탄올 추출물을 처리한 바 율피 메탄 올 추출물은 lOμg/㎖, 100μg/㎖, lmg/㎖의 농도에서 대조군에 비해서 약 38%, 47% 78%의 억제효과를 나타냈으며, 세포생존율은 lμg/㎖ 10μg/㎖, 100μg/㎖, 의 율피 메탄올 추출물 농도에서 약 98%, 98%, 79%, 74%로서 세포독성이 낮게 나타났다. Methylene chloride와 ethyl acetate 분획물은 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과가 없었지만 buthyl alcohol과 물 분획물은 유전 자 발현 억제효과를 나타내었으며, 특히 butyl alcohol 분획물은 lOμg/㎖, 100μg/㎖, lmg/㎖의 농도 에서 각각 약 38%, 36%, 34%의 발현율을 나타냄 으로써 대조군에 비해 티로시나아제 유전자의 발 현을 크게 억제하였다.
세포 내 유전자 도입을 통하여 제조된 B16 mouse melanoma cell에 율피 메탄올 추출물을 처리하여 티로시나아제 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사한 결과, 율피 메탄올 추출물은 티로시 나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타냈 다(Fig. 1). 율피 메탄올 추출물의 농도를 각각 10 μg/㎖, 100 μg/㎖, 1 mg/㎖로 달리하여 세포에 처리하였을 때 억제 효과는 대조군에 비해 각각 약 38%, 47%, 78%로서 추출액 농도에 비례하는 경향을 나타냈다.
2). 율피 메탄올 추출물을 처리하였을 때 농 도의 증가에 세포의 생존율이 감소하는 결과를 보 여주었으나 1 μg/㎖, 10 μg/㎖, 100 μg/㎖, 그리고 1 mg/me의 농도로 처리하였을 때 세포의 생존율이 대조군에 비해 각각 약 98%, 98%, 79%, 74%로 세포독성이 매우 낮게 나타났다. 이와 같이 율피메탄올 추출물은 세포독성이 낮으면서도 티로시나 아제 효소의 유전자 발현을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타나 효과적인 멜라닌 색소의 생성 억제 제로서의 응용이 기대된다.
1). 율피 메탄올 추출물의 농도를 각각 10 μg/㎖, 100 μg/㎖, 1 mg/㎖로 달리하여 세포에 처리하였을 때 억제 효과는 대조군에 비해 각각 약 38%, 47%, 78%로서 추출액 농도에 비례하는 경향을 나타냈다. 이는 티로시나아제 효소 활성을 저해 하는 것으로 알려진 대황(2) 감초⑸, 목단피16)등의 추출물들과는 다른 결과를 보여 주었다.
한편, 율피의 물 분획물은 티로시나제 유전자의 발현을 억제하였지만 butyl alcohol 용매 분획물에 비해 그의 효과가 상대적으로 낮게 나타났다. 이 결과는 티로시나아제 유전자의 발현을 억 제하는 성분들이 물 분획물보다는 butyl alcohol 용매 분획물에 주로 함유되어 있다는 것을 보여 주 었다. 이를 통해서 볼 때 율피 추출물 내에 함유되어 있는 티로시나아제 유전자의 발현 억제 성분들 은 비교적 극성도가 높은 물질이라 생각되어진다.
이는 티로시나아제 효소 활성을 저해 하는 것으로 알려진 대황(2) 감초⑸, 목단피16)등의 추출물들과는 다른 결과를 보여 주었다. 즉 대황, 감초, 목단피 등의 주줄물은 티로시나아제 유전자 발현을 억제하기 보다는 증진시키는 결과를 보여 주었으나, 양 등에 의하여 티로시나아제 효소 활 성 저해효과가 있다고 알려진 율피 추출물은 티로 시나아제 유전자의 발현을 크게 억제하는 효과를 나타내었다. 따라서 율피 추출물은 효소 티로시나 아제의 활성저해 뿐만 아니라 유전자의 발현을 억제하여 멜라닌 색소의 생합성을 효과적으로 제 어할 수 있는 천연물질이라 판단된다.
Butyl alcohol과 물 용매로 분획하여 얻은 율피 주줄물은 methylene chloride 또는 ethyl acetate 용매로 분획하여 얻은 것과는 달리 저농도에서도 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다. 특히, 율피의 butyl alcohol 분획물은 lpg/me, 10iig/m£, lOOpg/me, 500μg/㎖의 농도로 처리하였을 때 모든 농도에서 대조군에 비해 약 18-66% 정도 티로시 나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과를 보여 주 었으며, 세포독성은 매우 낮게 나타났다. 그리고,이 분획물의 티로시나아제 유전자의 발현 억제효 과는 lμg/㎖, lOμg/㎖, lOOμg/㎖의 농도에서 메탄올 추출물에 비하여 약 15-24% 정도로 보다 향 상되었다.
그리고,이 분획물의 티로시나아제 유전자의 발현 억제효 과는 lμg/㎖, lOμg/㎖, lOOμg/㎖의 농도에서 메탄올 추출물에 비하여 약 15-24% 정도로 보다 향 상되었다. 한편, 율피의 물 분획물은 티로시나제 유전자의 발현을 억제하였지만 butyl alcohol 용매 분획물에 비해 그의 효과가 상대적으로 낮게 나타났다. 이 결과는 티로시나아제 유전자의 발현을 억 제하는 성분들이 물 분획물보다는 butyl alcohol 용매 분획물에 주로 함유되어 있다는 것을 보여 주 었다.

후속연구

본 연구에서 멜라닌 색소 생합성에 관여하는 효 소 티로시나아제 활성 저해 효과가 있는 것으로 알려진 율피, 추출물에는 티로시나아제 유전자의 발현을 억제하는 효과가 높은 성분도 함유하고 있다는 것이 확인 되었으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 율피 추출물이 피부를 희고 아름답게 가꾸어주는 미백 화장품 및 의약품의 천연원료로 서 보다 널리 이용될 것으로 기대된다.
율피 메탄올 추출물을 처리하였을 때 농 도의 증가에 세포의 생존율이 감소하는 결과를 보 여주었으나 1 μg/㎖, 10 μg/㎖, 100 μg/㎖, 그리고 1 mg/me의 농도로 처리하였을 때 세포의 생존율이 대조군에 비해 각각 약 98%, 98%, 79%, 74%로 세포독성이 매우 낮게 나타났다. 이와 같이 율피메탄올 추출물은 세포독성이 낮으면서도 티로시나 아제 효소의 유전자 발현을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타나 효과적인 멜라닌 색소의 생성 억제 제로서의 응용이 기대된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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