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문제 정의
- 지금까지 노니 추출물이 나타내는 생리활성기전을 살펴보면 대표적인 작용으로 항산화 작용을 볼 수 있다. 본 연구는 사람이 노니를 복용시 소화기계에서 소화되는 과정과 유사한 처리를 하였을 때 in vitro assay와 cell system에서 항산화 작용의 변화를 관찰 흐)였다.
제안 방법
- 배양기에서 배양하였다. Histaminee 유리하는 비만 세포인 RBL 2H3 세포를 이용흐)여 superoxide 생성 , 세 포내 H2O2 생성, 세포 내 hydroperoxide 생성 및 지질과 산화를 측정하였다.
- 세포막의 지질과 산화를 측정하기 위하여 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)의 형광을 이용하였다. 노니 추출물을 처리한 RBL 2H3 세포를 0.5 mM DTT를 함유한 PBS buffer 로 세척한 후 sonication하고 50% trichloroacetic acid를 가하여 최종 5% 농도로 조절하였다. 동량의 0.
- 노니 추출물의 항산화 작용을 확인하기 위하여 DPPH 라디칼 소거 반응과 xanthine oxidase에 의한 superoxide의 소거 반응을 관찰하였다. DPPH 라디칼 소거 반응에 있어서 노니의 수용성 분 획과 지용성 분획 모두 농도 의존적으로 라디칼을 소거하였다.
- 산 처리와 trypsin 처치를 하지 않은 군을 대조군으로 삼아 상기와 같은 절차를 거쳐 분말을 얻었다. 동결건조한 분말을 증류수에 녹여 수용성분획을 얻었으며, 증류수에 녹지 않은 침전물은 다시 건조시킨 후 DMSO에 녹여 지용 성 분획으로 간주하여 실험하였다.
- 분리한 상층액을 rotary vaccum evaporatoi에서 감압 농축한 후 freeze-dryer로 동결 건조하여 분말을 얻었다. 산 처리와 trypsin 처치를 하지 않은 군을 대조군으로 삼아 상기와 같은 절차를 거쳐 분말을 얻었다. 동결건조한 분말을 증류수에 녹여 수용성분획을 얻었으며, 증류수에 녹지 않은 침전물은 다시 건조시킨 후 DMSO에 녹여 지용 성 분획으로 간주하여 실험하였다.
- 산과 trypsin을 처리한 노니 추줄물의 생리활성 변화를 관찰하기 위하여 in vitro assay와 cellular system을 이용한 항산화 작용을 관찰하였다. DPPH 라디칼 소거 반응에 있어서 노니의 수용 성 분획과 지용성 분획 모두 농도 의존적으로 라디칼을 소거하였다.
- 위 실험에서는 시험관에서 노니 추출물의 직접적인 항산화 활성을 측정하였다. 세포 내에서 생성되는 superoxide anion 생성을 DHE를 이용하여 측정하였다.13)Silica 1 mg/m/은 RBL 2H3 세포에서 superoxide 생성을 2.
- 세포막의 지질과 산화를 측정하기 위하여 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)의 형광을 이용하였다. 노니 추출물을 처리한 RBL 2H3 세포를 0.
- 세포에서 생성되는 reactive oxygen species들은 세포막이나 세포 내 소기관의 막을 산화시키게 되는데 지질과산화를 thiobarbituric acid를 이용하여 생성된 TBARS를 측정하였다.成 Silica lmg/m/과 CuSO4 10)iMe RBL 2H3 세포에서 유의한 지질과 산화를 유발하지 않지만 동시에 투여 시 안정 상태의 지질 과산화0.
- 위 실험에서는 시험관에서 노니 추출물의 직접적인 항산화 활성을 측정하였다. 세포 내에서 생성되는 superoxide anion 생성을 DHE를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 노니 열매를 건조시킨 분말은 Huong Thanh Co.(Viet Nam) 로부터 구입하였다. DPPH(l-diphenyl-2-picrylhydroazyl), xanthine oxidase(XO), NBT(nitroblue tetrazolium chloride), hypoxanthine, 2-thiobarbituric acid, malonyldialdehyde, hexadecyltrimethyl ammonium bromide(HTAB), 3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine(TMB), N, N-dimethylformamide (DMF)들은 Sigma사 로부터 구입하였으며, dihydrorhodamine, dihydroethidium, 2', 7'- dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)는 Molecular Probe Co.
- 에서 구입하였다. RBL 2H3 세포는 서울대학교 세포주은행으 로부터 구입하였다.
- RBL 2H3(rat basophilic leukemia) 세포는 10% fetal bovine serum 과 penicillin/streptomysin(100 IU/50 μg/m/) 을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 용액으로 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Histaminee 유리하는 비만 세포인 RBL 2H3 세포를 이용흐)여 superoxide 생성 , 세 포내 H2O2 생성, 세포 내 hydroperoxide 생성 및 지질과 산화를 측정하였다.
- 세포 내에서 생성되는 superoxide와 H2O2 및 hydroperoxide를 측정하기 위하여 각각 dihydroethidiume)과 DCF-DAe 및 DHR如)를 이용하였다. RBL 2H3 세포를 10 m2의 Krebs buffer 용액(mM: NaCl 137, KCI 2.
- 325% 2-thiobarbituric acid(in 50% acetic acid)를 첨가하여 95℃에서 30 min 배양하였 匸E 원 심분리 후 200 0를 96 well plate에 옮기고 Ex: 485 nm, Em: 535nm에서 형광 측정하였다. 표준물질로서는 malonyldial- dehyde(l, l, 3, 3-tetraethoxypropane, Sigma)를 사용하였다.蘆)조 직 내 lipid peroxidatione 균 질액을 이용하여 상기와 같은 방법으로 측정하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균土표준편차로 표기하였으며, 실험성적은 unpaired Student's t-test로 검정하였고 P 값이 5% 미만일 때 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
성능/효과
- 이러한 결과는 산과 효소를 처리한 노니 추출물에서 항산화 작용이 강화되는 것을 시사하여준다. DPPH assay 와 NBT/XO assay에서 각각 양성대조물질으로 사용한 ascorbic acid IOOjiM와 xanthine oxidase 억제제로 알려진 allopurinol 10 μ1研의 항산화 작용에 비하여 노니 추출물의 항산화 작용은 미약한 것으로 나타났다.(2)
- Xanthine oxidase에 의한 superoxide의 소거 반응에 있어서 수용성과 지용성 노니 추출물은 100 ng/ml 농도에서 각각 10%와 15% 라디칼 소거 활성을 보였다. 양성대조군으로 사용한 allopurinole 10)iM에서 50% 소거 활성을 보였다.
- DPPH 라디칼 소거 반응에 있어서 노니의 수용 성 분획과 지용성 분획 모두 농도 의존적으로 라디칼을 소거하였다. xanthine oxidase에 의한 superoxide의 소거 반응에 있어서 대조군의 수용성과 지용성 노니 추출물은 100 p回m/ 농도에서 각각 10%와 15% 라디칼 소거 활성을 보였으나 산과 trypsin 을 처리한 지용성 분획은 대조군의 지용성 분획에 비하여 통계적으로 유의하게 30% 소거 활성을 증가시켰다. 이러한 결과는 산과 효소를 처리한 노니 추출물에서 항산화 작용이 강화되는 것을 시사하여준다.
- 1) 한편 산과 trypsirr을 처치한 노니 추출물은 산과 切ypsiir을 처치하지 않은 추출물과 유사한 라디칼 소거 반응을 보였다. 그러나 통계적으로 유의하지는 않지만 수용성 분획에서는 산과 trypsin을 처리한 노니 추출물이 라디칼 소거 반응이 약하게 나타났으며, 지용성 분획에서는 반대 현상이 나타났다.
- 4배, 포도씨 분말보다 는 L1 배강한 항산화 작용이 있다는 것이 밝혀졌다. 사염화탄소에 의한 간세포의 lipid hyperoxidatione 노니 추출물을 12일간 투여시 사염화탄소 투여3시간 후 지질과 산화를 20~・50% 감소시켰다.9M)
- 3배 증가시켰다. 수용성 노니 추출물에서 산과 tr戏siir을 처리한 추출물보다 처리하지 않은 추출물이 유의하게 억제하였으나, 지용성 분획에서는 수용성 분획 과 반대로 산과 trypsin을 처리한 분획이 유의하게 더 많이 억제 하였다(Fig. 6). 이러한 결과는 산과 trypsin 처리시 지질과 산화 물의 생성을 억제하는 물질이 수용성분획에서 지용성 분 획으로 전환되었다는 것을 시사하여 준다.
- 5배 증가시켰다.수용성 노니 추출물은 30 μM 이하 농도에서는 silica 에 의한 세포 내 H2O2 생성에 별다른 영향을 주지 않았지만 100 pM 농도에서 silica에 의한 H2O2 생성을 27% 억제하였다.지용 성분획은 silica에 의한 세포 내 H2O2 생성을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.
- DPPH 라디칼 소거 반응에 있어서 노니의 수용성 분 획과 지용성 분획 모두 농도 의존적으로 라디칼을 소거하였다. 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid 100은 78%의 라디칼 소거 반응을 보였지만, 노니의 수용성 분획과 지용성 분획 Img/ m2은 각각 45%, 50%의 소거 반응을 나타냈다(Fig. 1) 한편 산과 trypsirr을 처치한 노니 추출물은 산과 切ypsiir을 처치하지 않은 추출물과 유사한 라디칼 소거 반응을 보였다. 그러나 통계적으로 유의하지는 않지만 수용성 분획에서는 산과 trypsin을 처리한 노니 추출물이 라디칼 소거 반응이 약하게 나타났으며, 지용성 분획에서는 반대 현상이 나타났다.
- 한편 산과 trypsin을 처리한 추출물과 처리하지 않은 추출물 사이에 있어서 유의한 차이는 없었지만 지용성 분 획 100 pg/mZ에 있어서산과 trypsin을 처리한 분획 이유의성 있게 더 많이 억제하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 산과 trypsin을 처리하면 지용성 분 획에서 세포 내에서 항산화 작용이 더 강한 물질이 많이 생성되는 것을 제시하여 준다.
- 분획에서 지용성 분획으로 전환되었다는 것을 시사하여준다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 in vitro assay와 cellular system에서 노니의 항산화 작용은 산과 trypsin 처리 시 지용성 분획에서 항산화 작용이 더 강하게 나타는 것으로 사료된다.
- 수용성 노니 추출물은 silica에 의한 세포 내 ROS 생성에 별다른 영향을 주지 않았으나 지용성 분획은 silica 에 의한 세포 내 ROS 생성을 농도 의존적으로 억제하였다. 지질 과산화에 있어서 수용성 분획에서는 산과 trypsin을 처리하지 않은 추출물이, 지용성 분획에서는 수용성분획과 반대로 산과 trypsin을 처리한 추출물이 지질과 산화를 억제하였다. 이러한 결과는 산과 trypsin 처리 시 지질과 산화물 생성을 억제하는 물질이 수용성.
- 양성대조군으로 사용한 allopurinole 10)iM에서 50% 소거 활성을 보였다. 한편 산과 trypsin을 처리한 노니 추출물은 수용성분획은 별다른 차이가 없었지만 지용성 분획은 통계적으로 유의하게 30% 소거 활성을 나타냈다(Fig. 2). 이러한 결과는 산과 효소를 처리한 노니 추출물에서 항산화 작용이 강화되는 것을 시사하여준다.
- 4). 한편 산과 trypsin을 처리한 추출물과 처리하지 않은 추출물 사이에 있어서 유의한 차이는 없었지만 지용 성분획에 있어서산과 tripsin을 처리한 분획이 더 많은 억제 경향을 나타냈다.
- 5). 한편 산과 trypsin을 처리한 추출물과 처리하지 않은 추출물 사이에 있어서 유의한 차이는 없었지만 지용성 분 획 100 pg/mZ에 있어서산과 trypsin을 처리한 분획 이유의성 있게 더 많이 억제하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 산과 trypsin을 처리하면 지용성 분 획에서 세포 내에서 항산화 작용이 더 강한 물질이 많이 생성되는 것을 제시하여 준다.
후속연구
- 이에 대한 기전은 이 실험의 결과만으로는 설명하기가 어려운 상태이다. 이러한 현상은 배당 체 형태가 가수분해되거나 단백질 결합형보다는 유리형으로 전환될 가능성이 있으며 앞으로 단일 물질을 분리하는 실험을 진행하면서 산과 효소 처리에 의한 새로운 물질의 형성을 확인하는 것이 필요할 것이다.
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