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문제 정의
- 18,19) 생성된 peroxynitrite는 강력한 산화제로 여러가지 심각한 손상을 일으켜 과도한 양의 peroxynitrite는 알쯔하이머병, 류마티스 관절염, 암, 동맥경화와 같은 질환과 직접적인 관련이 있다.2" 본 실험은 peroxynitrite 소거능 실험으로 활성산소종의 생성을 효과적으로 방지 할 수 있는지를 살펴보고자 하였다. 톳 자숙액 에탄올 추출물(EBH) 의 peroxynitrite 소거 활성을 검토한 결과를 Fig.
- 왔다. 따라서 본 연구에서는 톳 자숙액의 항산화 활성을 조사하여 저렴한 천연 항산화제로서의 활용 방안을 검토하고, 낮은 항산화 활성과 비교적 고가인 천연 항산화제의 단점을 보완한 자료로도 활용하고자 하였다.
제안 방법
-
DPPH 라디칼을 이용한 전자 공여능 측정.
- 5 ml를 실험 시작 전에 바로 혼합하여 사용하였다. DPPH용액 900 μl와 증류수에 녹인 각 농도별 시료(최종농도 1000 μg/ml, 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml) 100 μl를 혼합하여 20~30초간 세차게 흔들고 10분간 실온에서 반응시킨 후 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료 대신 증류수를 첨가한 음성 대조구의 흡광도는 0.
- 97이 되도록 조정하여 실험하였고, 기존의 항산화제로 알려진 BHA, L-ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid 및 (-)-catechin을 양성 대조구로 하여 동일한 방법으로 실험하였다. EDA는 시료첨가구와 음성 대조구의 흡광도를 구하여 다음과 같이 백분율로 나타내었으며, 각 실험은 3회 반복하여 얻은 결과를 평균한 값으로 나타내었다.
- 상등액 5 m세 증류수 5 ml와 1 ml의 ferric chloride(l mg/mZ)를 잘 혼합하여 700nm 에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 상등액에 ferric chloride 대신 증류수를 사용하여 시료 자체 색깔이 미치는 영향을 조사하였고, 항산화제인 BHA, L-ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid, (-)-catechin을 양성 대조구로 하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 reducing power를 비교하였다. 실험측정은 3번 반복하여 평균값을 사용하였다.
- 5 ml를 첨가하고 2, 000×g 에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액 5 m세 증류수 5 ml와 1 ml의 ferric chloride(l mg/mZ)를 잘 혼합하여 700nm 에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 상등액에 ferric chloride 대신 증류수를 사용하여 시료 자체 색깔이 미치는 영향을 조사하였고, 항산화제인 BHA, L-ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid, (-)-catechin을 양성 대조구로 하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 reducing power를 비교하였다.
- DPPH용액 900 μl와 증류수에 녹인 각 농도별 시료(최종농도 1000 μg/ml, 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml) 100 μl를 혼합하여 20~30초간 세차게 흔들고 10분간 실온에서 반응시킨 후 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료 대신 증류수를 첨가한 음성 대조구의 흡광도는 0.94~0.97이 되도록 조정하여 실험하였고, 기존의 항산화제로 알려진 BHA, L-ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid 및 (-)-catechin을 양성 대조구로 하여 동일한 방법으로 실험하였다. EDA는 시료첨가구와 음성 대조구의 흡광도를 구하여 다음과 같이 백분율로 나타내었으며, 각 실험은 3회 반복하여 얻은 결과를 평균한 값으로 나타내었다.
- 2 filter paper로 여과한 후 4CTC에서 rotary evaporator로 에탄올을 제거하면서 농축시켰다. 점착성의 잔류물에 75% 에탄올을 가해 주줄하고 40℃에서 rotary evaporator로 농축한 후 동결건조하여 분말화 한 톳 자숙액 에탄올 추출물(EBH>을 실온에 보관하면서 분석 시료로 사용하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약이 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색 되는 원리를 이용하여 분석하였다.15)顺 증류수에 녹인 각 농도별 톳 자숙액 에탄올 추출물(1 μg/ml~2000 μg/ml) 100 μl에 2% Na2CO3 2ml을 혼합하고 2분간 실온에 정치한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μl를 첨가하였다.
- 공시험은 반응혼합물에 50% Folin-Ciocalteu reagent시약 대신 증류수를 가한 혼합액을 사용하였다. 표준곡선은 (-)-catechin을 0~L0mg/m/의 농도로 조제하여 y = 3.6348x + 0.051(R2= 0.9954)에서 작성하여 검량하였고, 모든 처리는 3회 반복하여 평균한 값으로 나타내었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 DPPH(l, l-diphenyl-2- picrylhydrazyl), Folin & Ciocalteu's phenol reagent, BHA, caffeic caid, gallic acid, (-)-catechin, L-ascorbic acid는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, peroxynitrite(ONOO-)는 Cayman(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, 그 외의 시약은 특급시약을 사용하였다. 분석에 이용된 UV-visible spectrophotometer는 Mecasys사의 Optizen 2120UV를 사용하였고, EILSA reader기는 PerkiyElmer사의 Wallac 1420(Finland)을 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였고, peroxynitrite(ONOO-)는 Cayman(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, 그 외의 시약은 특급시약을 사용하였다. 분석에 이용된 UV-visible spectrophotometer는 Mecasys사의 Optizen 2120UV를 사용하였고, EILSA reader기는 PerkiyElmer사의 Wallac 1420(Finland)을 사용하였다.
- 3 N NaOH를 사용하였구, 각 실험은 3번 반복한 결과를 평균하연 계산하였다. 양성대조구로 BHA, L-ascorbic acid, penicillamine을 사용하였다.
- 전라남도 완도에서 8월에 채집한 톳을 수돗물로 수세하여 염분을 제거하고, 120℃, nkg/cm2에서 50분간 가열하여 얻어진 톳 자숙액을 냉장 보관을 하면서 실험재료로 사용하였다. 톳 자숙액에 에탄올을 1 : 3(v/v) 비율로 첨가하고 4, 200Xg에서 20분간 원심분리를 행하여 상등액과 침전물을 분리하였다.
데이터처리
- Excitation 파장은 485 nm, emission 파장은 530 nm로 하여 실온에서 측정하였다. 그리고 ONOO-(최종농도 10 μM)의 희석용액은 0.3 N NaOH를 사용하였구, 각 실험은 3번 반복한 결과를 평균하연 계산하였다. 양성대조구로 BHA, L-ascorbic acid, penicillamine을 사용하였다.
- 공시험은 상등액에 ferric chloride 대신 증류수를 사용하여 시료 자체 색깔이 미치는 영향을 조사하였고, 항산화제인 BHA, L-ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid, (-)-catechin을 양성 대조구로 하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 reducing power를 비교하였다. 실험측정은 3번 반복하여 평균값을 사용하였다.
이론/모형
- Peroxynitrite(ONOb) 소거 활성은 Kooy 등1)의 방법에 따라 dihydrorhodamine 123(DHR 123)이 산화되는 정도를 측정함으로써 검색하였다. Dimethyl- formamide로 녹인 DHR 123(5 mM) stock 용액은 질소로 충진하여 -80℃에 보관하고, DHR 123(최종농도 5 μM) 용액의 희석은 암실의 얼음 위에서 사용하기 전에 조제하였다.
- Reducing power는 Oyaizu14)의 방법에 따라 측정하였다. 증류수에 녹인 각 농도별 시료(최종농도 1000μg/ml,100μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml) 2.
- 톳 자숙액 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼에 대한 전자 공여능(electron donating ability, EDA)은 Blois'2) 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. DPPH 시약 2 mg을 정확히 칭량하여 에탄올 15 ml에 용해시 킨 용액 1.
성능/효과
- 이 결과로부터 EBH는 BHA, L-ascorbic acid, caffeic acid, gallic acid 및 (-)-Catechin의 항산화제와 같이 뛰어난 reducing power를 생성하는 활성을 지니고 있음을 알 수 있었고, 10㎍/㎖과 1 ㎍/㎖ 의 농도에서는 BHA와 L-ascorbic acid보다도 높은 reducing pger를 나타내었다. EBH의 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH 라디칼 및'"peroxynitrite 소거 활성능을 실험한 결과와 일치하여, EBH의 농도별로 유리 라디칼 소거 활성이 클수록 reducing power도 높음을 알 수 있었다. 이와 유사한 연구로 Giilein 등23)에 의하면 Pinus nigra Am.
- 1은 톳 자숙액의 에탄올 추출물(EBH)에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성을 검토한 결과이다. (-)-catechin 의 최종농도가 반응액 1ml당 1000 ㎍, 100㎍, 10 ㎍, 1 ㎍의 농도에서 각각 85.23 ± 1.39%, 62.36±1.69%, 49.17±1.87%,6.74±0.78%의 소거 활성을 나타내었고, 같은 농도에서 EBH는 85.68 ±0.16%, 77.37±1.39%, 44.32 ± 0.32%, 16.53 ±0.22%의 소거 활성을 나타내 시판 항산화제인 (-)-catechin과 비슷한 효과를 가지며 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성이 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 양성 대조구로 사용한 항산화제 BHA, L-ascorbic acid, caffeic acid 및 gallic acid의 경우 최종농도가 100μg/ml의 농도에서 각각 95.
- 예를 들면, Kaneda 등16)은 일본 해안에 생육하는 21종의 해조류 중 김에서 항산화력을 가진 phospholipids를 분리 보고하였고, Fujimoto 등17)은 36종의 해조류 중 홍조류인 빨간 검동이과의 Rhodomela속과 Polysiphonia속에서 5-bromo-3, 4-hydroxybenz-aldehyde라는 활성이 뛰어난 새로운 천연 항산화 물질을 분리 보고하였다. DPPH 라디칼 소거 활성능을 측정한 본 연구 결과로부터, 식용되고 있는 톳을 가열한 후 생성되는 톳 자숙액에는 효과적인 항산화성을 가진 성분이 존재하는 것이 시사되었다.
- 22%의 소거 활성을 나타내 시판 항산화제인 (-)-catechin과 비슷한 효과를 가지며 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성이 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 양성 대조구로 사용한 항산화제 BHA, L-ascorbic acid, caffeic acid 및 gallic acid의 경우 최종농도가 100μg/ml의 농도에서 각각 95.30 ± 0.12%, 96.74 ± 0.22%, 93.06±0.76% 및 89.16±0.21%로 뛰어난 소거 활성을 나타내었고, 최종농도 에서도 60.35 ± 0.12%, 96.74±0.28%, 88.43±0.65% 및 81.04±1.11%의 우수한 소거 활성을 나타내었다. 한편, 최종농도가 1 μg/ml의 농도인 경우에는 각각 25.
- 72%로 여전히 우수한 peroxynitrite 소거 활성 효과를 나타내었다. 본 연구 결과로부터 톳 자숙액의 에탄올 추출물은 1000μg/ml의 농도에서 L-ascorbic acid 및 penicillamine과 견줄만한 peroxynitrite 소거 활성을 지니고 있음을 알 수 있었다.
- 01 이었다. 이 결과로부터 EBH는 BHA, L-ascorbic acid, caffeic acid, gallic acid 및 (-)-Catechin의 항산화제와 같이 뛰어난 reducing power를 생성하는 활성을 지니고 있음을 알 수 있었고, 10㎍/㎖과 1 ㎍/㎖ 의 농도에서는 BHA와 L-ascorbic acid보다도 높은 reducing pger를 나타내었다. EBH의 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH 라디칼 및'"peroxynitrite 소거 활성능을 실험한 결과와 일치하여, EBH의 농도별로 유리 라디칼 소거 활성이 클수록 reducing power도 높음을 알 수 있었다.
- 944)5. 증가되어 페놀성 물질과 항산화 활성과의 상관관계가 높은 것으로 나타났으며 항산화 활성을 나타내는 물질은 총 페놀 함량이 크게 기여함을 알 수 있었다. Lu 등24)과 Kim 등25)은 DPPH 라디칼 소거능과 총 polyphenol 함량과는 높은 상관관계를 가진다고 보고하였고, Pyo 등26) 역시 DPPH 라디칼 소거능에 polyphenol이 중요한 역할을 한다고 보고하였다.
- 3은 톳 자숙액 에탄올 추출물(EBH)의 reducing power를 BHA, L-ascorbic acid, caffeic acid, gallic acid 및 (-)-catechin의 항산화제와 비교한 결과를 나타낸 것이다. 최종농도가 1000 μg/ml 일 때 EBH, BHA, L-ascorbic acid, caffeic acid, gallic acid 및 (-)-catechin의 흡광도는 각각 2.813 ±0.02, 2.379 ± 0.19, 2.730±0.15, 2.757±0.03, 2.641 ±0.05 및 2.684±0.01 을 나타내었고, 최종농도가 100 ㎍/㎖인 경우는 각각 1.644±0.01, 1.270 ± 0.07, 2.651 ±0.05, 2.727±0.03, 1.717±0.05 및 2.644+0.02 의 흡광도를 나타내었다. 또한, 최종농도가 10㎍/㎖의 농도일 때 흡광도는 각각 0.
- 2에 나타내었다. 최종농도가 1000μg/ml일 때 EBH와 대조구로 사용된 BHA, L-ascorbic acid 및 penicillaminee 각각 96.97± 1.41%, 95.72 ± 0.40%, 98.96±0.33% 및 97.45±0.15%를 나타내어 EBH는 탁월한 peroxynitrite 소거 효과가 있음을 알 수 있었다. EBH 의 최종농도가 반응액 1ml당 100 ng, 10 μg, 1 μg의 농도인 경우에는 각각 87.
후속연구
- 이상의 연구결과들로부터 톳 자숙액 에탄올 추출물은 효과적인 항산화 활성을 지니고 있음을 알 수 있었고, 앞으로 항산화 물질에 대한 분리가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 아울러 최근에는 해조류를 비롯한 천연물로부터 인체에 무해한 항산화제를 채발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 시점에서, 폐기처분되고 있는 톳 자숙액의 활용은 우수한 항산화력과 저렴한 가격을 가진 천연 항산화제로서의 상업적 활용 가능성이 기대되었다.
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