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문제 정의
- pylori 자체에 대한 연구와 근본적인 예방이나 치료를 위한 새로운 방법에 대한 연구가 시도 될 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 in vitro assay systems을 사용하여 백부자의 항산화 효과와 Helicobacter pylorie 대한 항균효과를 측정하여 기능성 식품소재로 이용할 수 있는지 알아보고자 하였다.
- 백부자(Acoriti koreani Rhizoma)를 이용한 항암효과와 노화 억제를 위한 기능성 식품 소재로 개발하기 위하여 항균 및 항산화 효과를 조사하였다. 백부자 추출물의 pheno성 물질의 추출 수율은 열수추출물이 8.
제안 방법
- TBARS는 Buege와 Aust의 방법16)에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들어 emulsion 0.8 ml와 각 추출물 0.2 ml를 진탕한 후 50℃ water bath에서 10시간 반응시킨 후 반응액 1ml에 TBA/TCA 시약 2ml를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉각시킨 후 15분간 1000 rpm으로 원심분리 하여 상등액을 532nm에서 흡광도를 측정하였으며, TBARS값은 1ml 반응혼합물에 대해서 생성된 1, 1, 3, 3 -tetraethoxy propane(TEP)의 X 100 ㎍으로 표시하였다.
- ABTS radical cation decolorization 측정. ABTS의 즉정은 Pellegrini 등의 방법14)에 의하여 측정하였다.
- 전자공여능(DPPH) 측정. DPPH(a, a-diphenyl-β-picrylhydraz)l) radical 소거활성은 Blois의 방법에 준하여 변형하여 측정하였다. 각 추출물 1 m/에 60 |1M DPPH 3 ml를 넣고 vortex한 후 15분 동안 암소에 방치한 다음 517mn에서 흡광도를 측정하여 다음 식에 의하여 나타내었다.
- 실험에 사용한 균주는 위, 십이지장궤양 원인균인 H pykS로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. H. pylor의 배양에는 최적배지(special peptone 0.5 g, agar 0.75 g, NaCl 0.25 g, yeast extract 0.25 g, beef extract 0.2 g 및 pyruvic acid 0.025 g)를 사용하고 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 10% CO2 incubator를 이용하였으며, incubator의 습도는 항상 95% 이상으로 유지하였고, agar plate 상에서 배양은 37℃로 48~72시간 동안 실시하였다.
- Beta-carotenee Andarwulan과 Shetty의 방법으로 측정하였다. 10mg -β-carotene/50mA의 chloroform 용액 1 m/에 20 |i/ linoleic acid, 184 g/ Tween 40과 50 ml HQ?를 가하여 emulsione- 만들고, emulsion액 5 m/에 각 추출물 100㎕를 혼합하여 진탕한 뒤 5(FC에서 30분간 방치한 후 식혀주고, 470nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 식으로 계산하여 PF 값을 측정하였다.
- 의한 phenol 성분 함량분석. 백부자의 열수와 ethanol 추출물에 대하여 표준물질로 생리활성 효과가 높다고 알려진 protocatecuic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, coumaric acid, rosemarinic acid 종 5종을 methanol에 용해 시켜 사용하였고, 추출액은 0.2 gm filter로 2 ml를 여과한후 그 중 5 μl를 분취하여 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석용 columne Xterra (RP-18, 250X4.
- Biitylatedhydroxytoluene(BHT), yeast extract, beef extract, pyruvic acid, P-carotene, H2O2, linoleic acid, tween 40, a, a-diphenyl- p-picrylhydrazy 1(DPPH), gallic acid 등은 Sigma사(USA)의 특급시약을 사용하였으며, formic acid, fblin-ciocaltm시약, trichloroacetic acid, N&COe HC1 등은 일제 특급시약을 사용하였다. 시료의 페놀 분리에 사용한 분광광도계는 UV/Vis Spectrophotometer(Jasco, Japan)를 사용하였으며, HPLC는 Waters 2690 separtions Module과 2487 UV detector를 사용하였고, 이동상으로 사용한 acetonitilefr J.T.Baker 사의 HPLC급을 사용하였다.
- 추출물의 Helicobacter pylori 항균활성 검색. 실험구는 H. pylori 최적배지 plate에 H. pylori 배양액 100μl를 분주하여 멸균 유니봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper(O 8 mm)를올리고 0.45 |im membrane filtere- 제균한 각 주줄물 100 μl를흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 3TC의 미호기성 조건에서 24시간 동안 incubation한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다.
- 추출물의 Phenol 성분 분석. 백부자의 추출용매에 따른 페놀 성분을 분석한 결과 Table 2와 같이 백부자 추출물의 페놀성물질은 protocatecuic acid, caflfeic acid, cholrogenic acid, rosemarinic acid로 확인되었다.
대상 데이터
- 시약 및 실험장치. Biitylatedhydroxytoluene(BHT), yeast extract, beef extract, pyruvic acid, P-carotene, H2O2, linoleic acid, tween 40, a, a-diphenyl- p-picrylhydrazy 1(DPPH), gallic acid 등은 Sigma사(USA)의 특급시약을 사용하였으며, formic acid, fblin-ciocaltm시약, trichloroacetic acid, N&COe HC1 등은 일제 특급시약을 사용하였다. 시료의 페놀 분리에 사용한 분광광도계는 UV/Vis Spectrophotometer(Jasco, Japan)를 사용하였으며, HPLC는 Waters 2690 separtions Module과 2487 UV detector를 사용하였고, 이동상으로 사용한 acetonitilefr J.
- 재료. 본 실험에 사용한 백부자(Aconritum koreani Rhizome)는: 2004년 6월에 대구 약령시장 및 한의원에서 약재로 사용되는 것을 구입하여 실온의 그늘에서 건조시킨 것을 분말화하여 보관하면서 실험에 사용하였다.
- Helicobacter pylori 배양. 실험에 사용한 균주는 위, 십이지장궤양 원인균인 H pykS로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. H.
데이터처리
- 2. Antioxidant effect of ethanol extracts from Aconiti koreani Rhizoma by DPPH radical, a~d: Mean values (n=6) with the different letters in a row are significantly different by Duncan's multiple range test (p < 0.05).
- 1. Content of total phenol in ethanol extracts from Aconiti koreuni Rhizoma, a~e: Mean values (n=6) with the different letters in a row are significantly different by Duncan's multiple range test (pv0.05).
- 5. Effect of ethanol extracts from Aconiti koreani Rhizoma on TBARS of antioxidation, a-e: Mean values (n=6) with the different letters in a row are significantly different by Duncan's multiple range test (p < 0.05).
- 4. Effect of ethanol extracts from Aconiti koreani Rhizoma on antioxidant protection factor a~d: Mean values (n=6) with the different letters in a row are significantly different by Duncan's multiple range test (p < 0.05).
- 통계 분석. 측정값은 반복실험을 통하여 SPSS(Statistical Package for the Social Science) 통계 package로 분산분석 및 Duncan 다중범위검정법(Duncan's multiple range test)을 사용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- ABTS radical cation decolorization 측정. ABTS의 즉정은 Pellegrini 등의 방법14)에 의하여 측정하였다. 7mM ABTS 5 m/와 140 mM K2S2O8 88 μl를 섞은 용액 1 m7와 ethan이 88 mZ를 혼합한 ABTS용액 1 ml와 시료용액 50 ml를 혼합하여 30 초간 진탕한 후 2.
- 측정. Beta-carotenee Andarwulan과 Shetty의 방법으로 측정하였다. 10mg -β-carotene/50mA의 chloroform 용액 1 m/에 20 |i/ linoleic acid, 184 g/ Tween 40과 50 ml HQ?를 가하여 emulsione- 만들고, emulsion액 5 m/에 각 추출물 100㎕를 혼합하여 진탕한 뒤 5(FC에서 30분간 방치한 후 식혀주고, 470nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 식으로 계산하여 PF 값을 측정하였다.
- 측정. TBARS는 Buege와 Aust의 방법16)에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들어 emulsion 0.
- Total polyphenole! 측정. 총 polyphenol 함량은 Folin-Denis 방법(2)으로 측정하였으며, 백분자 추출액 IrW에 95% ethanol 1 m/와 증류수 5 m/, 1 N Folin-ciocalte니 reagent 0.5 mA을 가하고 5분간 정치시킨 후 5% Nap% 용액 1 ml를 가하였다. 이혼합액을 1시간 동안 정치한 다음 분광광도계를 사용하여 725nm에서 흡광도를 즉정하였다.
성능/효과
- Hertong 등19)은 전자공여능이 시료의 flavonoids 및 phenolic성 물질 등에 대한 항산화 작용의 지표라 하였으며, 이러한 물질들이 free radical을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크면 높은 항산화 활성 및 활성 산소를 비롯한 다른 라디칼에 대한 소거 활성을 기대할 수 있으며 인체 내에서 free radical에 의한 노회를 억제하는 척도로도 이용할 수 있다고 하였다.20) 백부자 추출액의 전자공여능을 측정한 결과 Fig. 2와 같이 열수추출물 보다 에탄올추출물의 전자공여능이 우수하였으며, 20% 에탄올추출물이 93.69±0.19%로 가장 높은 값을 나타내었으나, 60% 에탄올추출물에서도 93.64±0.18%의 높은 전자공여능을 나타내었다. 그러나 열수추출물은 60.
- . ABTS radical decolorization과 antioxidant protection factor(PF)를 살펴 본 결과 ABTS는 60% 에탄올추출물에서 94.25±0.68%로 가장 높은 저해율을 나타내었고, PF 역시 60% 에탄올추출물에서 1.14±0.05로 비교적 높은 protection factor을 나타내었다. DPPH에 대한 전자공여능은 20% 에탄올추출물에서 93.
- 05로 비교적 높은 protection factor을 나타내었다. DPPH에 대한 전자공여능은 20% 에탄올추출물에서 93.69±0.19%의 가장 높은 활성을 나타내었으나, 40%, 60%, 80%간의 유의적인 차이는 없었고, 열수추출물에서는 60.10±1.63%의 낮은 활성을 나타내었다. 활성산소 중 지방산화를 일으키는데 중요한 역할을 하는 hydroxyl radical에 대한 각 추출물들의 영향은 80% 에탄올추출물이 다른 농도의 추출물들에 비하여 낮은 TBARS 값을 나타내었다.
- pylorie 대한 항균효과. H. pylori 평판 최적 배지 plate에 H. pylori 균 100 μl를 도말하고, 백부자 주줄 물을 처리하여 disc 주위의 clear zone 크기를 측정한 결과 Table 3에서와 같이 열수 추출물의 경우 clear zone이 관찰되지 않았으며, 추출수율이 가장 좋은 60% 에탄올추출물의 경우 50 ng/m/, 100 μg/mZ, 150 ng/m/, 200 μg/m/의 농도일때, 10, 11, 13, 13 mm clear zone이 관찰되어 H. pylori6^ 대하여 60% 에탄올추출물만이 비교적 높은 항균활성을 갖는 것으로 확인되었다.
- Antioxidant Protection Factor(PF) 측정. PF의 측정을 위하여 ^-carotene을 첨가한 linoleic acid emulsion을 사용하여 백부자 추출물의 항산화력을 측정한 결과 Fig. 4에서와 같이 60% 에탄올주줄물이 PF 1.14±0.05정도의 antioxidant protection factor를 나타내 지용성 물질에 대한 항산화력이 비교적 높은 것으로 확인되었다. Duval과 Shettty21^ 완두에 함유되어있는 phenol성 물질의 PF가 1.
- 22%의 저해율을 나타냈으나 100% 에탄올 추출물에서는 저해가 나타나지 않았다. 따라서 60% 에탄올 추출물이 친수성 및 lipophilic 물질에 대한 항산화력이 우수한 것으로 판단되었다.
- ABTS radical cation decolorization 측정. 물질의 친수성 및 lipophilic 물질의 항산화력을 측정하기 위해 ABTS radical cation decolorization을 측정한 결과 Fig. 3과 같이 60% 에탄올 추출물의 inhibition이 94.25 ±0.68%로 가장 높게 나타났고, 열수 추출물은 69.98±0.22%의 저해율을 나타냈으나 100% 에탄올 추출물에서는 저해가 나타나지 않았다. 따라서 60% 에탄올 추출물이 친수성 및 lipophilic 물질에 대한 항산화력이 우수한 것으로 판단되었다.
- 조사하였다. 백부자 추출물의 pheno성 물질의 추출 수율은 열수추출물이 8.45±0.27 mg/g이었으며 , 에탄올 추출물은 20, 40, 60, 80, 100% 농도별로 각각 6.40±0.10mg/g, 6.53±0.26 mg/g, 6.96+0.25 mg/g, 2.44± 0.04 mg/g, 0.31 + 0.17 mg/g으로 열수추출물의 phenol 함량이 다소 높게 나타났다. 항산화 효과가 높다고 알려진 phenol 성분의 함량을 HPLC 분석 결과 항산화 효과가 높은 protocatecuic acid, chlorogenic acid, rosemarinic acid의 함량이 높게 나타났다.
- 백부자의 추출용매에 따른 페놀 성분을 분석한 결과 Table 2와 같이 백부자 추출물의 페놀성물질은 protocatecuic acid, caflfeic acid, cholrogenic acid, rosemarinic acid로 확인되었다. 백부자에 함유되어 있는 페놀 화합물은 열수추출물에서 protocatecuic acid와 chlorogenic acid 가 0.82±0.06 mg/g과 0.37±0.11 mg/g의 함량을 나타내었고, 추출 수율이 가장 좋은 60% 에탄올추출물에서는 protocatecuic acid와 rosemarinic acid가 0.93±0.05 mg/g와 0.25±0.40mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 백부자의 HPLC 분석결과 생리활성 효과가 높은 rosemarinic acid, protocatecuic acid, chlorogenic acid의 함량이 많은 것으로 보아18) 생리활성 효과가 우수한 것으로 사료되며, 60% 에탄올추출물의 rosemarinic acid 로 인해 식품이나 화장품 등의 변질을 막는 천연 방부제의 역할을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- 17 mg/g으로 열수추출물의 phenol 함량이 다소 높게 나타났다. 항산화 효과가 높다고 알려진 phenol 성분의 함량을 HPLC 분석 결과 항산화 효과가 높은 protocatecuic acid, chlorogenic acid, rosemarinic acid의 함량이 높게 나타났다. H.
- 63%의 낮은 활성을 나타내었다. 활성산소 중 지방산화를 일으키는데 중요한 역할을 하는 hydroxyl radical에 대한 각 추출물들의 영향은 80% 에탄올추출물이 다른 농도의 추출물들에 비하여 낮은 TBARS 값을 나타내었다. 이상의 결과로 볼 때 백부자로부터 추출한 페놀성 물질은 60%의 ethanol로 추출한 추출물이 천연항산화 물질로 활용이 가능한 기능성 식품의 소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
후속연구
- 활성산소 중 지방산화를 일으키는데 중요한 역할을 하는 hydroxyl radical에 대한 각 추출물들의 영향은 80% 에탄올추출물이 다른 농도의 추출물들에 비하여 낮은 TBARS 값을 나타내었다. 이상의 결과로 볼 때 백부자로부터 추출한 페놀성 물질은 60%의 ethanol로 추출한 추출물이 천연항산화 물질로 활용이 가능한 기능성 식품의 소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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