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문제 정의
- 본 연구에서는 벼에 있어서 저온 스트레스 특이적인 발현을 보이는 단백질을 이차원전기 영동으로 분리한 후, MALDI-TOF MS를 이용하여 동정함으로써 저온 스트레스 관련 유전자 들을 확보하고 이들의 기능을 규명하며, 나아.가 이 유전자들을 이용한 저온재해 저항성 신품종 개발을 위한 자료를 확보하고자 수행하였다.
제안 방법
- 벼 종자를 스포탁 유제 (Samgong, Korea)를 사용하여 1 2—16 시간 표면살균 후, 증류수로 충분히 세 정한 후 2일간 30℃ 암 조건에서 발아를 유도 하였다. 발아시킨 종자는 tray 위에 균일하게파종하여 30℃/30℃, 16 h light/8 h dark, 15,000 lux, 싱대습도 50—60% 조건으로 growth chamber 에서 20일간 수경재배 하였다 (Nakamura 등, 1993). Growth chamber에서 20일간 생육시킨 유묘를 10#에서 0, 1, 3 및 5일 동안 저온처 리한 후, 시료를 채취하여 액체질소로 동결시 킨 후 -80 #에 보관 하였다.
- Dongjin-byeo)를 사용하였다. 벼 종자를 스포탁 유제 (Samgong, Korea)를 사용하여 1 2—16 시간 표면살균 후, 증류수로 충분히 세 정한 후 2일간 30℃ 암 조건에서 발아를 유도 하였다. 발아시킨 종자는 tray 위에 균일하게파종하여 30℃/30℃, 16 h light/8 h dark, 15,000 lux, 싱대습도 50—60% 조건으로 growth chamber 에서 20일간 수경재배 하였다 (Nakamura 등, 1993).
- 본 연구에서는 벼에 있어서 저온 스트레스 특이적인 발현을 보이는 단백질을 이차원전기 영동으로 분리한 후, MALDI-TOF MS를 이용하여 동정함으로써 저온 스트레스 관련 유전자 들을 확보하고 이들의 기능을 규명하며, 나아.가 이 유전자들을 이용한 저온재해 저항성 신품종 개발을 위한 자료를 확보하고자 수행하였다.
- 이차원 전기영동이 끝난 gel의 silver staininge Blum 등 (1987)의 방법에 준하여 실시하였으며, Coloidal Coommasie Blue 염색은 전기영 동이 끝난 gel을 Neuhoff 등 (1988)의 방법에 준하여 실시한 후, 특이적인 단백질을 gel에서 잘라내어 MALDI-TOF MS를 이용한 단백질 동 정에 사용하였다. 염색이 끝난 gele GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad)로 scan한 뒤 전 용 이미지 분석 프로그램인 PDQuest (Bio-Rad, Ver. 7.2)를 이용하여 비교 분석하였다.
- (Pandy 및 Mann 2000). 이러한 프로테옴 분석은 이차원전기영동 (2-DE)을 통하여 특정 조건에 따라 다르게 발현되는 단백질을 net charge와 분자량에 따라 분리 한 후 각각의 단백질을 질량분석기로 분석하여 아 미노산 서열을 결정하고, 이를 바탕으로 단백질 또는 genome database를 bioinformatics tool로 찾아 단백질의 정체를 확인하는 과정으로 구성된다. (Rabilloud, 2002).
- 3, 4). 이와 같이 저 온처리 후의 발현양이 증가 또는 감소하는 단백질 spot을 gel 에서 잘라내어 trypsin 처리 후 in-gel digestion 과정을 거쳐 추출된 peptides를 MALDI-TOF MS 분석을 실시하여 단백질을 동 정하였다. 그 결과 10℃ 저온 처리 후 15% PEG 상등액에서 점진적으로 발현양이 증가된 8개의 단백질 spot 중에서 6개의 단백질 spot이 동정 되어졌으며, 감소된 10개의 단백질 spot 중에서 8개의 단백질 spot이 동정되어졌다 (Table2).
- 각각의 단백질 시료는 170ug 씩 loading하고 일차원 전기 영동 을 실시하였다. 일차원 전기영동은 250 V 에서 30분, 300 V에서 30분, 400 V에서 30분, 600 V 에서 12시간, 800 V에서 6시간, 1000 V에서 3 시간 동안 fbcusing을 수행하였다. 일차원 전기 영동이 끝난 gele 5 mL의 equilibration buffer [10% glycerol, 2.
- 일차원 전기영동은 직경 2 mm, 길이 23 cm의 glass tube로 수행하였다. 일차원 전기영동을 위한 gel 용액은 4.5% polyacrylamide solution, 9 M urea, 2% NP-40,2.5% carrier ampholytes (pH 3~10:pH 5~8:pH 4~6.5 = 1:3.5:2.5), 0.02% ammonium persulfate, 0.07% TEMED로 조제하였다. 각각의 단백질 시료는 170ug 씩 loading하고 일차원 전기 영동 을 실시하였다.
- 저온처리한 벼의 단백질 발현 양상을 분석하기 위하여, 10℃의 저온처리를 한 잎으로부터 분리된 total soluble 단백질을 15% PEG로 fiactionation하여 상등액 및 pellet 분획을 2-DE 분석 하였고, silver staining을 이용하여 염색을 실시하였으며, PDQuest software를 이용하여 분 석하였다. 분리된 단백질을 전개시킨 gel을 대 조구와 비교한 결과 15% PEG 상등액에서는 8 개의 단백질 spot이 증가하였고, 10개의 단백질 spot이 감소하여 총 18개의 단백질 spot이 변화를 보였으며 (Fig.
- Sigma에서 구입한 Bradykinin, Neurotensin을 이용하였다. 최소 질량값은 500 m/z로 사용하였고, 질량값 측정 후에 MS-Fit (http://prospector.ucsf.edU/ucsfhtml4.0/msfit.httn) 를 이용하여 단백질을 동정 하였다. Search para- meter로 적용된 것은 다음과 같다.
- 프로테오믹스 기법을 이용하여 벼 저온 스트 레스 관련 단백질을 분리 동정하기 위하여 저 온처리한 벼로부터 단백질을 분리하였다. 분리 한 단백질로부터 Rubisco 단백질을 제거하기 위해 15% PEG fractionation!- 실시한 후 15% PEG 상등액과 pellet 분획을 각각 이차원전기 영동으로 단백질을 분석하였고, MALDI-TOF MS를 이용하여 단백질을 동정하였다 15% PEG 상등액에서 8개의 단백질 spot이 증가하였고 10 개의 spot 이 감소하였다.
대상 데이터
- Standard solution에 사용된 peptide는 .Sigma에서 구입한 Bradykinin, Neurotensin을 이용하였다. 최소 질량값은 500 m/z로 사용하였고, 질량값 측정 후에 MS-Fit (http://prospector.
-
1. 식물재료 및 저온처리
저온관련 단백질 분석을 위한 재료로는 영남 농업연구소에서 분양받은 동진벼 (#za salivaL. cv. Dongjin-byeo)를 사용하였다. 벼 종자를 스포탁 유제 (Samgong, Korea)를 사용하여 1 2—16 시간 표면살균 후, 증류수로 충분히 세 정한 후 2일간 30℃ 암 조건에서 발아를 유도 하였다.
이론/모형
- 잎에서 추출한 total soluble protein에 50% w/v PEG stock so나tion을 첨가하여 4℃에서 30분간 정치 후 12,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 15% PEG fractionation 한 상등액 분획은 O'FarrelFs solubilization buffer에 용해시키고 Lovyry 방법을 이용하여 단백질 농도를 결정한 후 일차원 전기영동에 이용하였다 15% PEG pellet 분획은 NP-40 buffer와 phenol을 첨가하여 단백질을 추출하였다{Lowry 등, 1951; Kim 등, 2001; O'Farrel 1975).
- 단백질 동정은 MALDI-TOF MS 빙식인 Voyger ™-DE STR Biospectrometry Workstation을 사용 해 분석하였고, Jensen 등 (1999)의 방법으로 시료를 처리하였다. Standard solution에 사용된 peptide는 .
- 이차원 전기영동이 끝난 gel의 silver staininge Blum 등 (1987)의 방법에 준하여 실시하였으며, Coloidal Coommasie Blue 염색은 전기영 동이 끝난 gel을 Neuhoff 등 (1988)의 방법에 준하여 실시한 후, 특이적인 단백질을 gel에서 잘라내어 MALDI-TOF MS를 이용한 단백질 동 정에 사용하였다. 염색이 끝난 gele GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad)로 scan한 뒤 전 용 이미지 분석 프로그램인 PDQuest (Bio-Rad, Ver.
성능/효과
- 프로테오믹스 기법을 이용하여 벼 저온 스트 레스 관련 단백질을 분리 동정하기 위하여 저 온처리한 벼로부터 단백질을 분리하였다. 분리 한 단백질로부터 Rubisco 단백질을 제거하기 위해 15% PEG fractionation!- 실시한 후 15% PEG 상등액과 pellet 분획을 각각 이차원전기 영동으로 단백질을 분석하였고, MALDI-TOF MS를 이용하여 단백질을 동정하였다 15% PEG 상등액에서 8개의 단백질 spot이 증가하였고 10 개의 spot 이 감소하였다. 증가한 8개 단백질spot 중에서 epimerase/dehydratase, fructokinase, ribose-5-phosphate isomerase (Rpi), chaperonin 21 precursor, photosystem II oxygen-envolving complex (PS II OEC) protien 2 precursor, thioredoxin h-type (Trx-h) 등 6개의 단백질이 확인되어졌다.
- 증가한 8개 단백질spot 중에서 epimerase/dehydratase, fructokinase, ribose-5-phosphate isomerase (Rpi), chaperonin 21 precursor, photosystem II oxygen-envolving complex (PS II OEC) protien 2 precursor, thioredoxin h-type (Trx-h) 등 6개의 단백질이 확인되어졌다. 15% PEG pellet 분획에서 13개의 단백질 spot이 증가하였고 14 spot이 감소하였으며, 증가한 13개 단백질 spot 중에서 OSJNB b059K02.15, hypothetical protein, mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK), 20S proteasome beta 7 subunit, Rubisco small subunit 등 5개의 단백질이 확인되어졌다. 확인되어진 단백질들 은 기능별로 분류해 본 결과, 세포대사관련 단 백질, energy 생성에 관련된 단백질, 산화환원 조절관련 단백질, 식물 병 방어관련, 단백질 합 성 및 신호전달 관련 단백질 등으로 분류되었다.
- 이와 같이 저 온처리 후의 발현양이 증가 또는 감소하는 단백질 spot을 gel 에서 잘라내어 trypsin 처리 후 in-gel digestion 과정을 거쳐 추출된 peptides를 MALDI-TOF MS 분석을 실시하여 단백질을 동 정하였다. 그 결과 10℃ 저온 처리 후 15% PEG 상등액에서 점진적으로 발현양이 증가된 8개의 단백질 spot 중에서 6개의 단백질 spot이 동정 되어졌으며, 감소된 10개의 단백질 spot 중에서 8개의 단백질 spot이 동정되어졌다 (Table2).
- 본 실험을 통하여 벼에 있어서 MAPKK가 저온 스트레스에 의해 조절된다. 는 것을 프로테오믹스 기법을 이용하여 처음으 로 확인할 수 있었으며, 이는 MAPKK 단백질이 저온 스트레스 하에서 중요한 기능을 담당할 것임을 시사하는 결과이다. 또한 이러한 rare protein의 발견은 15% PEG ftactionation을 이용한 2-D 분석법의 효율성을 보여주는 것이다.
- 동정되어진 단백질을 그 기능별로 분류해 보면 세포대사관련 단백질로서 잉utamine synthetase shoot isozyme, chloropalst precursor (spot 4), putative aminotrasnferase (spot 5), putative epimerase서ehydratase (spot 6), betanidin-5-O-glucosyl- transferase (spot 11), energy 에 관련된 glycealdehyde -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH; spot 7, 8), fructokinase (spot 10), ribose-5-phosphate isomerase (Rpi; spot 14), photosystem II oxygen-envolving complex (PS II OEC) protein 2 precursor (spot17), 단백질 합성에 관련된 mRNA binding protein precursor (spot 9), disease/defense°l] 관련된 TCP-l/cpn60 chaperonin family protein (spot 3), chaperonin 21 precursor (spot 15), 산 화환원 조절관련 단백질인 thioredoxin h-type (spot 18) 및 아직까지 그 기능이 알려져 있지 않은 hypothetical protein (spot 12) 등의 단백질 들을 확인할 수 있었다. Ribose-5-phosphate isomease (Rpi; EC 5.
- 저온처리한 벼의 단백질 발현 양상을 분석하기 위하여, 10℃의 저온처리를 한 잎으로부터 분리된 total soluble 단백질을 15% PEG로 fiactionation하여 상등액 및 pellet 분획을 2-DE 분석 하였고, silver staining을 이용하여 염색을 실시하였으며, PDQuest software를 이용하여 분 석하였다. 분리된 단백질을 전개시킨 gel을 대 조구와 비교한 결과 15% PEG 상등액에서는 8 개의 단백질 spot이 증가하였고, 10개의 단백질 spot이 감소하여 총 18개의 단백질 spot이 변화를 보였으며 (Fig. 1), 15% PEG pellet 분획에 서는 13개의 단백질 spot이 증가 하였고, 14개의 단백질 spot이 감소하여 총 27개의 단백질 spot이' 변화를 보인 것으로 관찰되었다 (Fig.2). 대부분의 변화를 보인 단백질 spot들은 저 온처리시간에 따라 점진적인 증가 또는 감소하는 경향을 나타내었다 (Fig.
- 확인되어진 단백질들 은 기능별로 분류해 본 결과, 세포대사관련 단 백질, energy 생성에 관련된 단백질, 산화환원 조절관련 단백질, 식물 병 방어관련, 단백질 합 성 및 신호전달 관련 단백질 등으로 분류되었다. 이들 중 RPi와 MAPKK가 저온 스트레스에 의해 발현되는 것이 본 실험의 프로테옴 분석을 통하여 최초로 동정되었다.
- 분리 한 단백질로부터 Rubisco 단백질을 제거하기 위해 15% PEG fractionation!- 실시한 후 15% PEG 상등액과 pellet 분획을 각각 이차원전기 영동으로 단백질을 분석하였고, MALDI-TOF MS를 이용하여 단백질을 동정하였다 15% PEG 상등액에서 8개의 단백질 spot이 증가하였고 10 개의 spot 이 감소하였다. 증가한 8개 단백질spot 중에서 epimerase/dehydratase, fructokinase, ribose-5-phosphate isomerase (Rpi), chaperonin 21 precursor, photosystem II oxygen-envolving complex (PS II OEC) protien 2 precursor, thioredoxin h-type (Trx-h) 등 6개의 단백질이 확인되어졌다. 15% PEG pellet 분획에서 13개의 단백질 spot이 증가하였고 14 spot이 감소하였으며, 증가한 13개 단백질 spot 중에서 OSJNB b059K02.
- 한편 10℃ 저온처리 후 15% PEG pellet 분 획에서 점진적으로 발현양이 증가된 13개의 단백질 spot 중에서 5개의 단백질 spot이 동정되어 졌으며, 감소된 14개의 단백질 spot 중에서 6개의 단백질 spot이 동정되어졌다 (Table 2). 동정 mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK; 되어진 단백질은 신호전달에 관련된 putative spot 9), 단백질.
- 15, hypothetical protein, mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK), 20S proteasome beta 7 subunit, Rubisco small subunit 등 5개의 단백질이 확인되어졌다. 확인되어진 단백질들 은 기능별로 분류해 본 결과, 세포대사관련 단 백질, energy 생성에 관련된 단백질, 산화환원 조절관련 단백질, 식물 병 방어관련, 단백질 합 성 및 신호전달 관련 단백질 등으로 분류되었다. 이들 중 RPi와 MAPKK가 저온 스트레스에 의해 발현되는 것이 본 실험의 프로테옴 분석을 통하여 최초로 동정되었다.
후속연구
- 또한 벼 는 게놈연구에 있어서 화본과식물의 모델식물 로 많이 이용되고 있어서, 최근에는 전체 게놈 의 염기서열이 밝히는 genome prefect가 거의 완성단계에 있어 database가 잘 갖추어져 있다. 따라서 genome database 정보가 많이 축적되어 있는 벼를 모델로 하여 프로테옴 분석을 실시 하면 저온 특이적인 유전자를 쉽게 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 나아가 저온재해 저항성 신 품종개발에 효율적으로 활용할 수 있을 것이다.
- (Rabilloud, 2002). 따라서 식물에 있어서 저온 스트레스 환경 하에서 차별적으로 발현되는 단백질들을 프로테옴 분석을 통하여 동정함으로서 저온 스트레스 조건 하에서 실제 적으로 기능하는 유전자들을 효율적으로 동정 하는 것이 가능할 것이다.
- 본 실험을 통하여 얻어진 프로테옴 mape 식물의 저온 스트레스에 대한 반응기작을 이해 하는데 있어서 중요한 정보를 제공할 수 있을 것이며, 나아가 각각의 단백질을 code 하고 있는 유전자를 분리함으로서 식물체로 도입을 통한 저온재해 저항성 신품종 개발에 효율적으로 활용될 수 있을 것이다.
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