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문제 정의
- 본 연구에서는 벼의 줄기에 있어서 고온 스트레스 특이적인 발현을 보이는 단백질을 이차원전기영동으로 분리한 후, MALDI-TOF MS를 이용하여 동정함으로써 고온 스트레스 관련 유전자들을 확보하고 이들 유전자들을 이용하여 내하고성 목초 또는 사료작물 신품종 개발을 위한 유용유전자를 확보하고자 수행하였다.
제안 방법
- Acetone으로 침전시켜 회수한 150 μg의 단백질을 reswelling buffer (8M urea, 1% CHAPS, 0.5% IPG buffer pH 4-7, 20 mM DTT, BPB)에 용해시킨 후, IPG strip pH 4-7에 12시간동안 rehydration 시키면서 loading한 다음, IPGphor를 이용하여 47500 Vh로 등전점 전기영동을 실시하였다.
- Dongjin-byeo)를 사용하였다 (see Lee 등, 2007). 벼 종자를 스포탁 유제 (Samgong, Korea)를 사용하여 12~16시간 표면살균 후 증류수로 충분히 세정한 후 2일간 28℃ 암 조건에서 발아를 유도하였다. 발아시킨 종자는 tray 위에 균일하게 파종하여 28℃ 28℃ 16 h light/8 h dark, 15,000 lux, 상대습도 50~60% 조건으로 growth chamber에서 재배하였다 (Nakamura 등, 1993).
- 프로테오믹스 기법을 이용하여 벼 고온 스트레스 관련 단백질을 분리 동정하기 위하여 42에서 고온처리한 벼의 줄기로부터 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질로부터 Rubisco 단백질을 제거하기 위해 15% PEG fractionation을 실시한 후 상등액 분획의 단백질을 이차원전기 영동한 후, CBB 염색을 통해 차별적 발현을 보이는 단백질을 분석하였다. 총 46개의 단백질 spot이 발현양에 변화를 보였으며, 그 중 24개의 단백질이 고온 스트레스에 의해 발현이 증가되었으며, 22개의 단백질이 감소하는 발현 양상을 나타내었다.
- 이차원 전기영동이 끝난 gel의 silver staining은 Blum 등 (1987)의 방법에 준하여 실시하였으며, Colloidal Coommasie Blue 염색은 전기영동이 끝난 gel을 Neuhoff 등 (1988)의 방법에 준하여 실시한 후, 특이적인 단백질을 gel에서 잘라내어 MALDI-TOF MS를 이용한 단백질 동정에 사용하였다. 염색이 끝난 gel은 GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad)로 scan한 뒤 전용 이미지 분석 프로그램인 PDQuest (Bio-Rad, Ver. 7.2)를 이용하여 비교 분석 하였다.
- 이와 같이 고온처리 후의 발현양이 2배 이상 증가 또는 감소하는 단백질 spot들을 gel에서 잘라내어 trypsin 처리 후 in-gel digestion 과정을 거쳐 추출된 peptides를 MALDI-TOF MS 분석을 실시하고 database를 통해 단백질을 동정하였다. 그 결과 42℃ 고온 처리 후 점진적으로 발현양이 증가된 24개의 단백질 spot 중에서 7개의 단백질 spot이 동정되어졌으며, 감소된 22개의 단백질 spot 중에서 3개의 단백질 spot이 동정되어졌다.
- 5% IPG buffer pH 4-7, 20 mM DTT, BPB)에 용해시킨 후, IPG strip pH 4-7에 12시간동안 rehydration 시키면서 loading한 다음, IPGphor를 이용하여 47500 Vh로 등전점 전기영동을 실시하였다. 일차원 전기영동이 끝난 IPG strip은 equilibration buffer (50 mM of Tris-HCl, pH 8.8, 6 M urea, 30% v/v glycerol, 2% w/v SDS, and a trace of bromophenol blue)에서 평형시킨 후 12% SDS-PAGE를 실시하였다.
- 프로테오믹스 기법을 이용하여 벼 고온 스트레스 관련 단백질을 분리 동정하기 위하여 42에서 고온처리한 벼의 줄기로부터 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질로부터 Rubisco 단백질을 제거하기 위해 15% PEG fractionation을 실시한 후 상등액 분획의 단백질을 이차원전기 영동한 후, CBB 염색을 통해 차별적 발현을 보이는 단백질을 분석하였다.
대상 데이터
- 단백질 동정은 MALDI-TOF MS 방식인 VoygerTM-DE STR을 사용해 분석하였고, Standard solution에 사용된 peptide는 Sigma에서 구입한 Bradykinin, Neurotensin을 이용하였다. Database 검색은 Protein prospector(http://prospector.ucsf.edu)를 이용하였으며, 단백질 sequence database는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)를 이용하였다(Lee 등, 2007).
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1. 식물재료 및 고온처리
고온관련 단백질 분석을 위한 재료로는 동진벼 (Oryza sativa L. cv. Dongjin-byeo)를 사용하였다 (see Lee 등, 2007). 벼 종자를 스포탁 유제 (Samgong, Korea)를 사용하여 12~16시간 표면살균 후 증류수로 충분히 세정한 후 2일간 28℃ 암 조건에서 발아를 유도하였다.
이론/모형
- 추출한 total soluble protein의 PEG (poly ethylene glycol) fractionation은 Lee 등 (2007)의 방법에 준하여 실시하였다. 15% PEG fractionation한 상등액 (supernatant) 분획은 acetone으로 침전시켜 회수한 후 1차원 전기영동 buffer인 rehydr-ation buffer에 용해시키고 Lowry 방법을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다 (Lowry 등, 1951).
- 차별적 발현을 보인 단백질 spot은 잘라내어 Lee 등 (2007)의 방법에 준하여 전처리한 후 trypsin으로 in-gel digestion하여 절단된 peptide를 추출하였다. 단백질 동정은 MALDI-TOF MS 방식인 VoygerTM-DE STR을 사용해 분석하였고, Standard solution에 사용된 peptide는 Sigma에서 구입한 Bradykinin, Neurotensin을 이용하였다. Database 검색은 Protein prospector(http://prospector.
- 이차원 전기영동이 끝난 gel의 silver staining은 Blum 등 (1987)의 방법에 준하여 실시하였으며, Colloidal Coommasie Blue 염색은 전기영동이 끝난 gel을 Neuhoff 등 (1988)의 방법에 준하여 실시한 후, 특이적인 단백질을 gel에서 잘라내어 MALDI-TOF MS를 이용한 단백질 동정에 사용하였다. 염색이 끝난 gel은 GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad)로 scan한 뒤 전용 이미지 분석 프로그램인 PDQuest (Bio-Rad, Ver.
- 차별적 발현을 보인 단백질 spot은 잘라내어 Lee 등 (2007)의 방법에 준하여 전처리한 후 trypsin으로 in-gel digestion하여 절단된 peptide를 추출하였다. 단백질 동정은 MALDI-TOF MS 방식인 VoygerTM-DE STR을 사용해 분석하였고, Standard solution에 사용된 peptide는 Sigma에서 구입한 Bradykinin, Neurotensin을 이용하였다.
- 추출한 total soluble protein의 PEG (poly ethylene glycol) fractionation은 Lee 등 (2007)의 방법에 준하여 실시하였다. 15% PEG fractionation한 상등액 (supernatant) 분획은 acetone으로 침전시켜 회수한 후 1차원 전기영동 buffer인 rehydr-ation buffer에 용해시키고 Lowry 방법을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다 (Lowry 등, 1951).
성능/효과
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Ⅲ. 결과 및 고찰
고온처리한 벼의 단백질 발현 양상을 분석하기 위하여 42℃의 고온처리를 한 벼의 줄기 조직으로부터 분리된 total soluble 단백질을 15% PEG로 fractionation하여 상등액 분획의 단백질을 이차원전기영동한 후, colloidal CBB 염색을 실시한 결과, 다양한 차별적 발현을 보이는 단백질 spot들을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1). 대부분의 변화를 보인 단백질 spot들은 고온처리시간에 따라 점진적인 증가 또는 감소하는 경향을 나타내었다.
- 이와 같이 고온처리 후의 발현양이 2배 이상 증가 또는 감소하는 단백질 spot들을 gel에서 잘라내어 trypsin 처리 후 in-gel digestion 과정을 거쳐 추출된 peptides를 MALDI-TOF MS 분석을 실시하고 database를 통해 단백질을 동정하였다. 그 결과 42℃ 고온 처리 후 점진적으로 발현양이 증가된 24개의 단백질 spot 중에서 7개의 단백질 spot이 동정되어졌으며, 감소된 22개의 단백질 spot 중에서 3개의 단백질 spot이 동정되어졌다. 최종적으로 동정되어진 단백질들의 종류와 기능을 표 1에 나타낸 바와 같다 (Table 1).
- CuZnSOD는 일반적으로 세포질이나 엽록체에 존재하는 효소로서 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는 핵심역할을 담당하고 있다. 본 실험에서 CuZN SOD는 고온 스트레스에 의해 그 발현이 감소하였다. 이와 같이 산화스트레스나 고온 스트레스에 의해 SOD 발현이 감소한 결과가 Sweetlove 등 (2002)과 Shin 등 (2005) 등에 의해서도 보고 된 바 있다 이러한 결과는 SOD가 온도 스트레스에 대해서 다양하고 복잡한 발현기구를 가지고 있거나 isoform에 따라 각각 서로 다르게 조절되고 있을 가능성을 나타낸다.
- 그 중에서도 특히 식물의 경우 다양한 종류의 저분자량 small HSP가 multigene family로 code되어져 있으며 5가지의 group으로 분류된다. 본 연구에서 미토콘드리아에 존재하는 small HSP는 고온 특이적으로 발현이 급격히 유도되었다 (Fig. 3). 이러한 결과는 미토콘드리아 small HSP도 다른 기관에 존재하는 small HSP와 마찬가지로 고온 스트레스 하에서 미토콘드리아 내의 단백질들의 변성 방지 또는 변성된 단백질들의 재생에 있어서 중요한 기능을 담당함으로서 세포를 보호하는 것으로 추측된다.
- 2). 이들 각각의 단백질 spot들의 발현정도의 차이를 PDQuest software를 이용하여 대조구와 비교한 결과, 42℃ 고온처리 후 발현정도가 대조구에 비해 최소한 2배 이상 증가 또는 감소하는 경향을 나타내었으며, spot 20과 21의 경우 고온 처리 후 12시간 째에 일시적으로 증가하다가 24시간째에 감소하는 발현양식을 보이기도 하였다 (Fig. 3).
- 총 46개의 단백질 spot이 발현양에 변화를 보였으며, 그 중 24개의 단백질이 고온 스트레스에 의해 발현이 증가되었으며, 22개의 단백질이 감소하는 발현 양상을 나타내었다. 이들 단백질을 MALDITOF MS와 database를 통해 동정한 결과 에너지 대사관련 단백질, 산화 환원 관련 단백질 및 저분자량 small HSP 등, 10개의 단백질이 동정되었다. 이들 동정된 단백질들은 식물의 고온 스트레스에 대한 적응기작을 이해하는데 중요한 단서를 제공할 것이며, 특히 미토콘드리아 small HSP는 프로테옴 분석법에 의해 최초로 동정되었으며, 금후 내하고성 목초 분자육종에 활용될 수 있는 좋은 유전자로 판단된다.
- 이들 단백질을 MALDITOF MS와 database를 통해 동정한 결과 에너지 대사관련 단백질, 산화 환원 관련 단백질 및 저분자량 small HSP 등, 10개의 단백질이 동정되었다. 이들 동정된 단백질들은 식물의 고온 스트레스에 대한 적응기작을 이해하는데 중요한 단서를 제공할 것이며, 특히 미토콘드리아 small HSP는 프로테옴 분석법에 의해 최초로 동정되었으며, 금후 내하고성 목초 분자육종에 활용될 수 있는 좋은 유전자로 판단된다.
- 대부분의 변화를 보인 단백질 spot들은 고온처리시간에 따라 점진적인 증가 또는 감소하는 경향을 나타내었다. 이들 이차원 전기영동 gel을 PDQuest software를 이용하여 대조구와 비교한 결과 24개의 단백질 spot이 고온 스트레스 처리에 의해 증가하였고, 22개의 단백질 spot이 감소하여 총 46개의 단백질 spot이 차별적 발현을 보였다 (Fig. 2). 이들 각각의 단백질 spot들의 발현정도의 차이를 PDQuest software를 이용하여 대조구와 비교한 결과, 42℃ 고온처리 후 발현정도가 대조구에 비해 최소한 2배 이상 증가 또는 감소하는 경향을 나타내었으며, spot 20과 21의 경우 고온 처리 후 12시간 째에 일시적으로 증가하다가 24시간째에 감소하는 발현양식을 보이기도 하였다 (Fig.
- 3). 이러한 결과는 미토콘드리아 small HSP도 다른 기관에 존재하는 small HSP와 마찬가지로 고온 스트레스 하에서 미토콘드리아 내의 단백질들의 변성 방지 또는 변성된 단백질들의 재생에 있어서 중요한 기능을 담당함으로서 세포를 보호하는 것으로 추측된다. 지금까지 미토콘드리아 small HSP를 과발현시킴으로써 식물체의 고온내성이 증가되었다고 보고된 바 있다 (Sanmiya 등, 2004).
- 분리한 단백질로부터 Rubisco 단백질을 제거하기 위해 15% PEG fractionation을 실시한 후 상등액 분획의 단백질을 이차원전기 영동한 후, CBB 염색을 통해 차별적 발현을 보이는 단백질을 분석하였다. 총 46개의 단백질 spot이 발현양에 변화를 보였으며, 그 중 24개의 단백질이 고온 스트레스에 의해 발현이 증가되었으며, 22개의 단백질이 감소하는 발현 양상을 나타내었다. 이들 단백질을 MALDITOF MS와 database를 통해 동정한 결과 에너지 대사관련 단백질, 산화 환원 관련 단백질 및 저분자량 small HSP 등, 10개의 단백질이 동정되었다.
후속연구
- 또한 벼는 게놈연구에 있어서 화본과식물의 모델식물로 많이 이용되고 있어서 최근에는 전체 게놈의 염기서열이 밝혀져 genome database가 잘 갖추어져 있다. 따라서 genome database 정보가 많이 축적되어있는 벼를 모델로 하여 프로테옴 분석을 실시하면 고온 특이적인 유전자를 쉽게 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 나아가 고온재해 저항성 신품종 개발에 효율적으로 활용할 수 있을 것이다.
- 이러한 프로테옴 분석은 이차원전기영동 (2-DE)을 통하여 특정 조건에 따라 다르게 발현되는 단백질을 전하와 분자량에 따라 분리한 후 각각의 단백질을 질량분석기로 분석하여 아미노산 서열을 결정하고 이를 바탕으로 단백질 또는 genome database를 bioinformatics tool로 찾아 단백질의 정체를 확인하는 과정으로 구성된다(Rabilloud, 2002). 따라서 식물에 있어서 고온 스트레스 환경 하에서 차별적 발현을 보이는 단백질들을 프로테옴 분석을 통하여 동정함으로서 고온 스트레스 조건 하에서 실제적으로 기능하는 유전자를 효율적으로 동정하는 것이 가능할 것이다. 또한 이와 같이 실제로 고온 스트레스 하에서 직접 working 하고 있는 유전자를 분리하여 내하고성이 약한 목초에 도입하게 되면 내하고성이 증가 된 목초의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 지금까지 미토콘드리아 small HSP를 과발현시킴으로써 식물체의 고온내성이 증가되었다고 보고된 바 있다 (Sanmiya 등, 2004). 따라서 이 단백질 유전자를 분리하여 내열성이 약하여 하고현상이 빈발하고 있는 국내재배 목초 품종에 도입하게 되면 내하고성 목초개발이 가능해질 것이다.
- 따라서 식물에 있어서 고온 스트레스 환경 하에서 차별적 발현을 보이는 단백질들을 프로테옴 분석을 통하여 동정함으로서 고온 스트레스 조건 하에서 실제적으로 기능하는 유전자를 효율적으로 동정하는 것이 가능할 것이다. 또한 이와 같이 실제로 고온 스트레스 하에서 직접 working 하고 있는 유전자를 분리하여 내하고성이 약한 목초에 도입하게 되면 내하고성이 증가 된 목초의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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