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문제 정의
- 한편 천연물을 이용한 지구력 등의 운동능력을 향상시키는데 있어서 여러 물질들이 효과가 있다는 것으로 보고되어 있으며 특히 인삼과 홍삼 등에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.I*5") 본 연구에서는 지구력 증진 및 성 기능을 향상시킬 수 있는 기 능성 식품을 개발하기 위하여 이미 지구력 증진 효능이 있다고 보고된 octacosanol과 수박껍질 추출 엑스를. 적정비율로 혼합한 시제품을 in vivo 실험과 생화학적 분석을 통하여 지구력 효능을 검증하여 지구력 증강용 기능성 식품의 소재 및 제품으로 개발하고자 이 연구를 수행하였다.
- I*5") 본 연구에서는 지구력 증진 및 성 기능을 향상시킬 수 있는 기 능성 식품을 개발하기 위하여 이미 지구력 증진 효능이 있다고 보고된 octacosanol과 수박껍질 추출 엑스를. 적정비율로 혼합한 시제품을 in vivo 실험과 생화학적 분석을 통하여 지구력 효능을 검증하여 지구력 증강용 기능성 식품의 소재 및 제품으로 개발하고자 이 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 표준용액의 조제는 표품 citrulline의 100 ppm stock solution을 제조, 이를 100, 50, 25 ppm으로 희석하고, 각각의 희석액 0.5 m/에 10 mM 9-fluorenylmethyl chloroformate solution을 lm/ 첨가하여 vortexing하고 10분 후 n-hepthan 3 mE를 첨가하여 채취한 하등 액을 표준용액으로 사용하였고, IE。) 각 표준용액을 20 以씩 취하여 HPLC hromatogrami 얻었으며, 여기서 얻은 농도에 따른 peak area을 바탕으로 검량선을 작성하였다. HPLC 분석조건은 Columne C18 Luna Phenomenex(150 x4.
- 以씩 취하여 HPLC hromatogrami 얻었으며, 여기서 얻은 농도에 따른 peak area을 바탕으로 검량선을 작성하였다. HPLC 분석조건은 Columne C18 Luna Phenomenex(150 x4.6 mm, 5 Rm)을 사용하여 Solvent A(CH3CN) : Solvent B(25mM sodium citrate buffei; pH 6.4)의 전개 용매를 60:40의 비율인 Isotonic solvent system으로 실온에서 1.0 m〃min의 유속으로 전 개하였고 파장은 254nm에서 측정하였다.
- HPLC를 이용한 수박껍질 추출 엑스 내의 citrulline 함량은 citrulline의 standard peak를 확인하고 이에 대한 검량선을 작성, 수박 껍질 추출엑스(1000 ppm)을 HPLC 하여 citrulline의 standard peak의 reaction time(RT)과 같은 시간의 peak의 면적 수치를 검량선에 대입하여 함량을 계산하였으며 수박껍질 추출 엑스 내의 citrulline 함량은 0.29%로 확인하였다(Table I, Fig. 1).
- 以씩 취하여 HPLC hromatogrami 얻었으며, 여기서 얻은 농도에 따른 peak area을 바탕으로 검량선을 작성하였다. HPLC 분석조건은 Columne C18 Luna Phenomenex(150 x4.
- 대조군① 및 실험군으로서 1% octacosanol 투여군(U), citrulline 투여군(HI), 80% EtOH로 추출한 수박껍질 추출 엑스 투여군(IV), 1% octacosanol과 수박껍질 추출 엑스를 6:4 비율로 혼합한 시제품 투여군(V)으로 구분되며 각 group 당 7마리씩 사용하였다.
- 시료의 투여량은 I 군은 증류수만을 투여하였고, II 군은 1% octacosanol 3 g/kg, HI군은 citrulline 30 ㎎/㎏, IV군은 수박 추 출 엑스 3g/kg 그리고 V 군은 시제품 3g/kg을 각각 2주간 경구 투여(3 功하였다.2侦2)
- 유영 실험 후 흰쥐의 하대정맥에서 혈액 약 5~7 血를 채혈, 곧바로 3, 000 rpm으로 원심분리 후 상층액인 혈장을 수득하여 녹 십자의료재단에 분석을 의뢰하였다.
- 유영 실험은 투명하게 제작한 아크릴 수조(가로 80cmX세로 50 cmX높이 90 mg)에 물을 2/3가량 채우고 수온을 24℃로 유 지시켜 흰쥐의 복부에 몸무게의 8~10%의 무게추를 달아 자유 수영을 실시하였고, 흰쥐의 머리가 수면위로 10초 이상 떠오르지 못하는 시점까지를 측정하였다.⑹ 긴의 total cholesterol, HDL-cholest
대상 데이터
- In vivo 실험에 사용된 재료인 1% octacosan이과 citrullinee (주)성균바이오텍에서, 1% octacosan이과 수박껍질 추출물을 혼합한 시제품은 (주)주신 알앤디에서 제공받았으며, 함량분석에 사용된 citrullinee Sigma사(USA)에서 구입하였다. 그리고 수박 껍질 추출 엑스는 80% EtOH로 추출하여 사용하였다.
- , USA) 를 수박추출물 내의 citrullin 함량분 석시에 사용하였다. 시약으로는 간의 total cholesterol, triglyceride, HDL-cholesterol 농도, GOT 및 GPT 활성 측정을 위한 kits는 (주)아산제약(경기도 화성)제품을 사용하였고, 혈청의 total cholesterol, triglyceride, HDL-cholesterol, GOT GPT, creatine kinase 및 inorganic phosphate는 Bayer사 (Japan) 제품을, lactic acid kits는 Roche 사(Swizerland)제품을, glucose kits는 Roche 사(USA)제품을 사용하였고 녹십자 의료재 단(경기도 용인시)에 분석을 의뢰하였다. 그 이외의 시약들은 특급 및 1급 시약橹 사용하였다.
- 체중은 160±5g의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 한림실험 동물원(경기도)으로부터 구입하여 사용하였다. 중앙대학교 약학 대학 동물실험실에서 1주일 동안 순응시킨 뒤 실내온도는 23± 1℃, 습도는 40-60%, 명함 주기는 12시간 등 실험 기간 동안 일정한 조건하에 사육하였으며, 기본사료(고형사료, 한림동물원, 경기도)와 식수는 제한 없이 공급하였다. 단 채혈 하루 전에는 식수만 공급하였다.
- 체중은 160±5g의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 한림실험 동물원(경기도)으로부터 구입하여 사용하였다. 중앙대학교 약학 대학 동물실험실에서 1주일 동안 순응시킨 뒤 실내온도는 23± 1℃, 습도는 40-60%, 명함 주기는 12시간 등 실험 기간 동안 일정한 조건하에 사육하였으며, 기본사료(고형사료, 한림동물원, 경기도)와 식수는 제한 없이 공급하였다.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과는 통계처리하여 평균값과 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군의 간 및 혈청에 대한 유의성 검정은 Student' t-test를 이용하여 통계처리한 후 신뢰구간이 P<0.05 경우를 통계학적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- Total cholesterol 함량은 Allain 등의 효소법에 의하여 시판 Idt(아산제약(주), 경기도 화성)를 사용하여 흡광도 500 nmnm에서 측정하고 각각의 실험은 검량선에 준하여 그 함량을 mg/ dZ로 표시하였다. GOT 및 GPT 함량은 Reitman-Frankel 법에 따라 시판 kit(아산제약(주), 경기도 화성)를 사용하여 흡광도 505 nm에서 측정하고 각각의 실험은 검량선에 준하여 그 함량을 IU/1로 표시하였다.
- 유영 실험 후 간을 적출하여 무게를 측정하고, 생리식염수를 세척한 후 Forch 등의 지질 추출법 23)에 따라 간을 곱게 갈아 균질 용 tube에 넣고 초음파 세포막 분쇄기로 세포막을 파괴하고 chloroform: methanol=2:1 혼합액으로 지질을 추출한 후 2,000 rpm에서 원심분리하여 그 상등액을 시료로 하여 지질 분석에 이용하였다. Total cholesterol 함량은 Allain 등의 효소법에 의하여 시판 Idt(아산제약(주), 경기도 화성)를 사용하여 흡광도 500 nmnm에서 측정하고 각각의 실험은 검량선에 준하여 그 함량을 mg/ dZ로 표시하였다. GOT 및 GPT 함량은 Reitman-Frankel 법에 따라 시판 kit(아산제약(주), 경기도 화성)를 사용하여 흡광도 505 nm에서 측정하고 각각의 실험은 검량선에 준하여 그 함량을 IU/1로 표시하였다.
- Total cholesterol 함량은 Emzymatic, colorimetry 검사법으로 cholesterol reagent kits(Bayer사, Japan)를 이용하였고, HDL- cholesterol 함량은 Emzymatic, colorimetry 검사법으로 Direct HDLcholeste血 kits(Bayei사, USA)를 이용, GOT 및 GPT 함량은 IFCC 검사법으로 각각 ALT reagent kits(Bayer사, USA) 와 AST reagents kits(Bayer사, USA)를 이용, creatine kinase 함량은 DGKC method 겁사법으로 creatine kinase reagent kits(Bayer사, USA)를 이용, inorganic phosphate 함량은 Phosphomolyte, UV 겁사법으로 inorganic phosphate reagent kdts(Bayer사, USA)를 이용하여 ADVIA 1650(Bayer사, USA)기 기로 각각 측정하였다. lactic acid 함량은 Emzymatic method 검사법으로 lactate kits(Roche사, Swizerland)를 이용하여 Cobas Integra 800(Roche사, Swizerland)기기로 측정하였고, glucose 함량은 Emzymatic method 검사법으로 Gluco-quant kits(Roche사, USA)를 이용호k겨 Hitachi 7180(Hitachi사, Japan)기기를 이용하여 측정하였다.
- Total cholesterol 함량은 Emzymatic, colorimetry 검사법으로 cholesterol reagent kits(Bayer사, Japan)를 이용하였고, HDL- cholesterol 함량은 Emzymatic, colorimetry 검사법으로 Direct HDLcholeste血 kits(Bayei사, USA)를 이용, GOT 및 GPT 함량은 IFCC 검사법으로 각각 ALT reagent kits(Bayer사, USA) 와 AST reagents kits(Bayer사, USA)를 이용, creatine kinase 함량은 DGKC method 겁사법으로 creatine kinase reagent kits(Bayer사, USA)를 이용, inorganic phosphate 함량은 Phosphomolyte, UV 겁사법으로 inorganic phosphate reagent kdts(Bayer사, USA)를 이용하여 ADVIA 1650(Bayer사, USA)기 기로 각각 측정하였다. lactic acid 함량은 Emzymatic method 검사법으로 lactate kits(Roche사, Swizerland)를 이용하여 Cobas Integra 800(Roche사, Swizerland)기기로 측정하였고, glucose 함량은 Emzymatic method 검사법으로 Gluco-quant kits(Roche사, USA)를 이용호k겨 Hitachi 7180(Hitachi사, Japan)기기를 이용하여 측정하였다.
- 유영 실험 후 간을 적출하여 무게를 측정하고, 생리식염수를 세척한 후 Forch 등의 지질 추출법 23)에 따라 간을 곱게 갈아 균질 용 tube에 넣고 초음파 세포막 분쇄기로 세포막을 파괴하고 chloroform: methanol=2:1 혼합액으로 지질을 추출한 후 2,000 rpm에서 원심분리하여 그 상등액을 시료로 하여 지질 분석에 이용하였다. Total cholesterol 함량은 Allain 등의 효소법에 의하여 시판 Idt(아산제약(주), 경기도 화성)를 사용하여 흡광도 500 nmnm에서 측정하고 각각의 실험은 검량선에 준하여 그 함량을 mg/ dZ로 표시하였다.
성능/효과
- Glucose 수치는 대조군(I)과 비교하여 V 군의 수치가 약 23%, m군이 약 18%의 감소치를, U 군이 약 13%, 그리고 IV군은 약 10%의 농도로 모든 군에서 유의한 감소치를 나타내었다(TableIV). 지구력 운동에 따른 혈당 농도의 감소는 인슐린 감수성의 개선이라는巴 의미에서 당뇨 환자 뿐만 아니라 비만 환자, 건강한 사람과 실험동물에서도 널리 보고되고 있다.
- Octacosanol과 수박 추출물을 주성분으로 하는 스태미너 기능성 식품을 개발하고자 시작한 이 연구는 흰쥐를 이용한 유영실 험과 생화학적 분석을 통하여 지구력 증진 효능을 실험한 결과 citrulline이 가장 유의한 지구력 증진 효능을 나타냈고, 1% octacosan이과 수박 껍질 추출 엑스를 6:4의 혼합비율로 제조한 시제품 역시 유의한 지구력 개선 효능을 가진다고 판단되었다. 그러나 1% octacosanol과 수박 껍질 주줄 엑스의 지구력증진 효능에 비하여 이 시료들을 혼합 제조한 시제품의 효능이 더 유의하게 증가한 결과는 두 시료가 혼합하여 어떠한 시너지 효과를 나타낸 것으로 생각되며 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.
- 각 군별로 시료를 2주간 경구투여한 흰쥐를 몸무게의 약 8~L0%무게의 무게추를 배에 달아 자유 수영시킨 결과 대조군(I)의 유영 시간 29225±10.81(sec) 와 비교하여 citrullin 투여군 (UI) 의 유영 시간이 369.87±9.87(sec)으로 약 26%의 유의한 증가율을 보였고, 시제품 투여군(V)의 유영 시간은 358.87±8.66(sec) 로 약 22% 유의한 증가율을 보였고, 1% octacosanol 투여군(II)의 유영 시간은 319.50±7.5.0(sec)로 약 9%의 유의한 증가율을, 그리고 수박 껍질 추출 엑스 투여군(IV)의 유영 시간은 301.25+7.06(sec)로 약 3%의 증가율을 나타내었다(Eble II).
- 근육세포에서 ATP를 재합성하는데 촉매 역할을 하는 creatine kinase의 수치는 대조군(I)과 비교하여 시제품 투여군(V)이 약 18% 증가치를 나타내었고, citrullin 투여군(ID)은 약 17% 증가치를 나타내었지만 1% octacosanol 투여군(U>은 대조군과 비슷한 측정치를, 수박 껍질 추출 엑스 투여군(IV)은 약간의 감소치를 나타내었다(Eble IV). 위 결과로 무산소 운동 중인 근육세포에서 ATP를 재합성하는데 필요한 creatine phosphate의 합성을 촉매하는 효소인 CK의 수치가 증가했다는 것은 계속 운동을 할 수 있는 에너지를 더 많이 가지고 있다는 것으로 유의한 증가치를 나타낸 n, m, V 군의 시료가 지구력을 향상시키는데 영향을 주었다고 판단할 수 있다.
- 이는 무산소 운동 중에 근세포 질에 축적되는 피로물질의 일종인 lactic acid가 운동에 의해 체내에 축적되면 체내 환경의 산성화가 야기 되며, 후자는 phosphorylase의 활성을 저하시키므로 무산소 상태에서 운동에너지의 급원이 되는 포도당의 신생을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 대조군에 비하여 젖산 농도 수치가 유의한 감소치를 보인 IU, V 군의 시료가 지구력이 향상되는데 영향을 준 것으로 판단할 수 있다.26)
- 또한 각 시료를 투여, 2주 후에 유영 실험을 실시한 후 곧바로 쥐를 도살, 관류하여 간을 적출한 후 습중량을 측정한 결과 대조군(I)의 7.54±0.24 g과 비교하여 1% octacosanol 투여군(H)의 습중량은 7.41 ±0.40 g, citrullin 투여군(皿은 7.82 ± 0.48 g, 수 박 껍질 추출 엑스 투여군(IV)은 7.41±0.34 g 그리고 시제품 투 여군(V)은 7.57±0.25 g으로 모든 군에서 거의 일정하게 측정되었으며, 실험동물 중 사망한 개체가 없는 것으로 보아 투여한 양으로 인한 부작용은 없는 것으로 판단하였다.
- 무산소 운동 중 근세포 질에 축적되는 피로물질의 일종인 lactic acid 수치는 대조군①과 비교하여 HI군이 약 17% 감소치를 나 타내었고, V 군은 약 11% 감소치를, II 군은 약 5% 감소치를, 나타내었고, IV군은 약간의 감소치를 나타내었다(Table IV). 이는 무산소 운동 중에 근세포 질에 축적되는 피로물질의 일종인 lactic acid가 운동에 의해 체내에 축적되면 체내 환경의 산성화가 야기 되며, 후자는 phosphorylase의 활성을 저하시키므로 무산소 상태에서 운동에너지의 급원이 되는 포도당의 신생을 억제하는 것으로 알려져 있다.
- 근육세포에서 ATP를 재합성하는데 촉매 역할을 하는 creatine kinase의 수치는 대조군(I)과 비교하여 시제품 투여군(V)이 약 18% 증가치를 나타내었고, citrullin 투여군(ID)은 약 17% 증가치를 나타내었지만 1% octacosanol 투여군(U>은 대조군과 비슷한 측정치를, 수박 껍질 추출 엑스 투여군(IV)은 약간의 감소치를 나타내었다(Eble IV). 위 결과로 무산소 운동 중인 근육세포에서 ATP를 재합성하는데 필요한 creatine phosphate의 합성을 촉매하는 효소인 CK의 수치가 증가했다는 것은 계속 운동을 할 수 있는 에너지를 더 많이 가지고 있다는 것으로 유의한 증가치를 나타낸 n, m, V 군의 시료가 지구력을 향상시키는데 영향을 주었다고 판단할 수 있다.2425)
- 위 결과로 투여한 시료들에 대한 독성이 없다는 것으로 판단하였으며, 식용으로서의 안정성에도 문제가 없다고 판단하였다.
- 유영 실험 후 적출한 간 및 채혈한 혈청을 생화학적 분석한 결과 total cholesterol 수치는 대조군①과 비교하여 모든 실험군에서 유의한 감소치를 나타내었고, 간의 HDL-cholesterol 수치는 대조군(I)과 비교하여 U, m 그리고 V 군이 유의한 증가치를 나 타내었으며, 혈청의 HDL-cholesterol 수치는 대조군(I)과 비교하여 m, IV V 군이 유의한 증가치를 보였다. GOT 및 GPT 수치 는 대조군(I)과 비교하여 모든 실험군에서 비슷한 측정치를 나타 내었다(Eble IH).
- 흰쥐를 구입한 날부터 4일 간격으로 몸무게를 측정하여 체중의 변화를 그래프로 작성한 결과 사육실 환경에 1주일 적응 기간 과 2주간 각각의 시료를 경구투여 기간 동안 몸무게가 시간에 비례적으로 증가하는 결과를 나타내었다(Fig. 2).
후속연구
- 그러나 1% octacosanol과 수박 껍질 주줄 엑스의 지구력증진 효능에 비하여 이 시료들을 혼합 제조한 시제품의 효능이 더 유의하게 증가한 결과는 두 시료가 혼합하여 어떠한 시너지 효과를 나타낸 것으로 생각되며 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. citrullinee 현재 의약품으로 사용되어지고 있기 때문에 기능성 식품 소재로의 사용이 적합하지 않지만 1% octacosanol 과 수박 껍질 추출 엑스를 6:4의 혼합비율로 제조한 시제품은 새로운 지구력 증진 건강 기능성 식품의 소재로 개발될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 축적된 자료는 보다 우수한 지구력 증진 기 능성 식품을 개발하는데 기초 자료로 활용될 것으로 판단된다.
- Octacosanol과 수박 추출물을 주성분으로 하는 스태미너 기능성 식품을 개발하고자 시작한 이 연구는 흰쥐를 이용한 유영실 험과 생화학적 분석을 통하여 지구력 증진 효능을 실험한 결과 citrulline이 가장 유의한 지구력 증진 효능을 나타냈고, 1% octacosan이과 수박 껍질 추출 엑스를 6:4의 혼합비율로 제조한 시제품 역시 유의한 지구력 개선 효능을 가진다고 판단되었다. 그러나 1% octacosanol과 수박 껍질 주줄 엑스의 지구력증진 효능에 비하여 이 시료들을 혼합 제조한 시제품의 효능이 더 유의하게 증가한 결과는 두 시료가 혼합하여 어떠한 시너지 효과를 나타낸 것으로 생각되며 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. citrullinee 현재 의약품으로 사용되어지고 있기 때문에 기능성 식품 소재로의 사용이 적합하지 않지만 1% octacosanol 과 수박 껍질 추출 엑스를 6:4의 혼합비율로 제조한 시제품은 새로운 지구력 증진 건강 기능성 식품의 소재로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
- citrullinee 현재 의약품으로 사용되어지고 있기 때문에 기능성 식품 소재로의 사용이 적합하지 않지만 1% octacosanol 과 수박 껍질 추출 엑스를 6:4의 혼합비율로 제조한 시제품은 새로운 지구력 증진 건강 기능성 식품의 소재로 개발될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 축적된 자료는 보다 우수한 지구력 증진 기 능성 식품을 개발하는데 기초 자료로 활용될 것으로 판단된다.
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