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문제 정의
- 예로부터 한국은 콩 및 칡의 여러 부위를 민간에서 약용으로 入용 하여 왔고 갈근은 phytoestrogen0] 다량 함유되어있다. 이에 본 연구에서는 발효 기법을 이용하여 콩, 갈근, 갈 화의 효능을 한층 더 강화시켜 갱년기 질환 예방 및 치료에 대한 효능 연구로 실험동물을 이용하여 본 실험을 실시하였다.
가설 설정
- C; Negative control group, severe atrophy arrangement of uterus cells. T3; Extraction of ferment arrowroot group, minimal atrophy arrangement of uterus cells.
제안 방법
- 조직 검사 - 시험물질을 7주, 14주간 연속 경구투여 후, 부검 시 대퇴골 및 자궁 조직을 10% 중성 포르말린에 고정한 후 xylene, 에탄올 탈수 및 함수 과정을 거쳐 파라핀을 침투하여 포 매 한다. 4 pirn 두께로 절편을 만들어 Hematoxyline-Eosin(H&E) Stain 하여, 광학현미경으로 대퇴골 골간 및 골간 단내 소주(小柱), 파골세포의 출현 정도 및 골수 내 지방축적을 상대적 평가로 측정하였다. 대퇴골 뼈 지주의 값은 골다공증 정도를 평가할 수 있는 가장 중요한 평가 항목이며, 파골세포의 출현 정도는 파골세포의 활성도를 개략적으로 평가할 수 있다.
- HPLC(YMCAM 303-A coloum 4.6*250 mm; kyoto, Japan) 을 이용하여 분석하였다. 성분 분석 방법은 0.
- 각각의 시험물질은 건조함량(5g/kg)을 기준으로 멸균 생리식 염수(lOmZ/kg)에 녹여 투여물질로 사용하였으며, 배부 피부 고정 법으로 실험동물을 고정하고 경구투여용 금속제 존데와 주 사관 을 이용하여 위 내에 강제 경구투여하였다. 대조군 및 N.
- 시험 동물의 복 측 정중선을 중심으로 하복부를 1cm 정도 절개하고 핀셋으로 난소를 노출시킨 후 난관을 견사로 결찰하여 난소를 제거하였다. 감염방지를 위해 항생제(쎌파포르테-4, 유니 화학 주식회사) 0.4 m2를 복강 내 주입하였고 견사로 복막, 복근 및 피부를 봉합하였다. 부검소견 - 투여 7주 및 14주째에 Ether 마취하에서 하복부를 개복한 후, 복대동맥에서 채혈하였으며 내부 장기를 육안으 로 관찰하였다.
- 골다공증 유발 - 골다공증을 유발하^ 동물모델은 페경기 이후의 lype I으로, 골다공증을 유발시키는 흰쥐 암컷을 대상으로 난 소 적출 모형을 선택하여 갱년기 질환의 치료효능을 연구하였다. 난소 적출술 - 마취약(염산 ketamine 50 ml, 유한양행 + xylazine 20mg/mZ, 바이엘코리아 주식회사)을 시험 동물 등 배부에 근육 주사하여 전신마취 시킨 다음, 하복부의 털을 제거하고 배 복위 (dorsoventral recumbency)로 보정흐}였으며, 요오드(삼일제 약)로 수술 부위를 소독한 후, 난소적출을 시행하였다.
- 골밀도 측정 - 동물 부검 시, 우측 대퇴골을 적출하여 근육을 제거하고 10% 중성 포르말린에 7일간 고정하였다. 골밀도 측정은 포르말린을 제거한 후 Dual Energy X-ray Absortion(LUNAR® Corp.
- 골밀도 측정 - 동물 부검 시, 우측 대퇴골을 적출하여 근육을 제거하고 10% 중성 포르말린에 7일간 고정하였다. 골밀도 측정은 포르말린을 제거한 후 Dual Energy X-ray Absortion(LUNAR® Corp. P1X1 mus. Madison, W1 U.S.A) 기기를 사용하여 7주 및 14주에 각각 측정하였다.
- 골다공증 유발 - 골다공증을 유발하^ 동물모델은 페경기 이후의 lype I으로, 골다공증을 유발시키는 흰쥐 암컷을 대상으로 난 소 적출 모형을 선택하여 갱년기 질환의 치료효능을 연구하였다. 난소 적출술 - 마취약(염산 ketamine 50 ml, 유한양행 + xylazine 20mg/mZ, 바이엘코리아 주식회사)을 시험 동물 등 배부에 근육 주사하여 전신마취 시킨 다음, 하복부의 털을 제거하고 배 복위 (dorsoventral recumbency)로 보정흐}였으며, 요오드(삼일제 약)로 수술 부위를 소독한 후, 난소적출을 시행하였다. 시험 동물의 복 측 정중선을 중심으로 하복부를 1cm 정도 절개하고 핀셋으로 난소를 노출시킨 후 난관을 견사로 결찰하여 난소를 제거하였다.
- 각각의 시험물질은 건조함량(5g/kg)을 기준으로 멸균 생리식 염수(lOmZ/kg)에 녹여 투여물질로 사용하였으며, 배부 피부 고정 법으로 실험동물을 고정하고 경구투여용 금속제 존데와 주 사관 을 이용하여 위 내에 강제 경구투여하였다. 대조군 및 N.C군은 주사용 멸균 생리식염수(10m//kg)를 투여하였다. 투여는 매일 오전에 개체별로 경구 투여하였다.
- 흰쥐 암컷((주) 오리엔트, 서울시 금천구 가산동 459-24) 8주령을 사용하였다. 동물입수 시 외관을 육안으로 검사한 후, 7일간 시험을 실시하는 동물 실에서 순화시키고 난소 적출술을 시행하였다. 난소적출 7일 후, 군 분리하여 건강한 동물 중 90마리를 선별하여 시험에 사용하였다.
- 그러나 estrogen을 장기간 복용할 경우 자궁 비대 및 자궁암을(endometrial cancer) 유발할 수 있다는 부작용이 보고되어 있기도 하다"). 본 연구에서 Sprague- Daweley계 암컷의 난소적출 모형을此) 이용하여 골다공증을 유발하였으며, 페경기 이후 Type I의 유형인 갱년기 질환의 예방 및 치료효능 연구에 사용하였다.
- 4 m2를 복강 내 주입하였고 견사로 복막, 복근 및 피부를 봉합하였다. 부검소견 - 투여 7주 및 14주째에 Ether 마취하에서 하복부를 개복한 후, 복대동맥에서 채혈하였으며 내부 장기를 육안으 로 관찰하였다.
- , Miami, FL, USA)를 이용하여 측정하였다. 생화학분석기(Airon 200, Italy)를 人용하여 무기인, 칼슘, ALP(alkaline phosphatase) 농도를 각각 측정하였다.
- 6*250 mm; kyoto, Japan) 을 이용하여 분석하였다. 성분 분석 방법은 0.1% acetic acid in acetonitrile solvent A와 0.1% acetic acid in water solvent B를 혼합하여 Iml/min 유속으로 254nm에서 검출하였다.
- 난소 적출술 - 마취약(염산 ketamine 50 ml, 유한양행 + xylazine 20mg/mZ, 바이엘코리아 주식회사)을 시험 동물 등 배부에 근육 주사하여 전신마취 시킨 다음, 하복부의 털을 제거하고 배 복위 (dorsoventral recumbency)로 보정흐}였으며, 요오드(삼일제 약)로 수술 부위를 소독한 후, 난소적출을 시행하였다. 시험 동물의 복 측 정중선을 중심으로 하복부를 1cm 정도 절개하고 핀셋으로 난소를 노출시킨 후 난관을 견사로 결찰하여 난소를 제거하였다. 감염방지를 위해 항생제(쎌파포르테-4, 유니 화학 주식회사) 0.
- 시험물질 추출 방법은 시료 건조함량의 10배수로 1차 증류수를 가하여 180분간 열수 추출하였으며 추출한 시험물질에 유산균을 접종하여 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 배양한 시험 물질을 동결건조하여 필요량을 산출하여 시험에 사용하였다.
- 먼저, 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정 후, 5 g 간격으로 구분하여 각각의 평균 체중에 가까운 동물 90마리를 선택하였다. 이렇게 선택된 90마리를 각 군에 15마리씩 균등한 체중으로 분배되도록 순위화한 체중과 난수를 이용한 무작위 법으로 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모의 색소염색법과 개체식별 카드 표시법으로 실시하였다.
- 장기 무게 측정 - 부검 시 채혈한 후, 잔 혈은 방혈하였으며 자궁, 뇌, 뇌하수체, 비장, 부신, 신장, 간, 폐 및 심장의 무게를 저울 (Mettler; AT261)을 이용하(1) 측정하였다.
- 파골세포 측정 - 암컷 흰쥐의 난소를 강제로 적출하여 골다공증을 유발시키고 본 시험물질을 투여하여 대퇴골에서 파골세포를 분리하였으며, 활성을 측정하여 시험물질의 효과를 관찰하였다. 조직 검사 - 시험물질을 7주, 14주간 연속 경구투여 후, 부검 시 대퇴골 및 자궁 조직을 10% 중성 포르말린에 고정한 후 xylene, 에탄올 탈수 및 함수 과정을 거쳐 파라핀을 침투하여 포 매 한다. 4 pirn 두께로 절편을 만들어 Hematoxyline-Eosin(H&E) Stain 하여, 광학현미경으로 대퇴골 골간 및 골간 단내 소주(小柱), 파골세포의 출현 정도 및 골수 내 지방축적을 상대적 평가로 측정하였다.
- 투여는 매일 오전에 개체별로 경구 투여하였다. 투여 기간은 7주 및 14주로 결정하였으며, 투여액량은 매주 1회 측정된 체중을 기준으로 하여, 각각의 군별 투여량에 맞게 투여액량을 계산하였다.
- C군은 주사용 멸균 생리식염수(10m//kg)를 투여하였다. 투여는 매일 오전에 개체별로 경구 투여하였다. 투여 기간은 7주 및 14주로 결정하였으며, 투여액량은 매주 1회 측정된 체중을 기준으로 하여, 각각의 군별 투여량에 맞게 투여액량을 계산하였다.
- 46% 감소되었다. 파골세 포 측정 2De 난소를 적출한 후, 골다공증을 유발한 흰쥐를 이용하여 대퇴골에서 분리한 파골세포의 활성을 비교 평가하였다. 파 골세포의 활성은 난소적출 동물에서 증가되었으며, 시험물질 7주 처리한 T3 군에서는 음성대조군에 비해 미약한 활성을 보였다.
- 파골세포 측정 - 암컷 흰쥐의 난소를 강제로 적출하여 골다공증을 유발시키고 본 시험물질을 투여하여 대퇴골에서 파골세포를 분리하였으며, 활성을 측정하여 시험물질의 효과를 관찰하였다. 조직 검사 - 시험물질을 7주, 14주간 연속 경구투여 후, 부검 시 대퇴골 및 자궁 조직을 10% 중성 포르말린에 고정한 후 xylene, 에탄올 탈수 및 함수 과정을 거쳐 파라핀을 침투하여 포 매 한다.
- 혈구 및 혈액생회학 분석 - 혈액학적 검사는 WBC(white blood cell), RBC(red blood cell), HGB(hemoglobin), HCT(hematocrit), MCHC(Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration), MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin), MCV(Mean Corpuscular Volume), PIT(platelet)를 혈구 분석기 (Coulter Co., Miami, FL, USA)를 이용하여 측정하였다. 생화학분석기(Airon 200, Italy)를 人용하여 무기인, 칼슘, ALP(alkaline phosphatase) 농도를 각각 측정하였다.
대상 데이터
- 각 시험물질은 한국식품연구원에서 제공받았으며 멸균 생리식 염수(중외제약 주식회사)로 녹여서 사용하였다.
- 동물입수 시 외관을 육안으로 검사한 후, 7일간 시험을 실시하는 동물 실에서 순화시키고 난소 적출술을 시행하였다. 난소적출 7일 후, 군 분리하여 건강한 동물 중 90마리를 선별하여 시험에 사용하였다.
- 동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정 후, 5 g 간격으로 구분하여 각각의 평균 체중에 가까운 동물 90마리를 선택하였다. 이렇게 선택된 90마리를 각 군에 15마리씩 균등한 체중으로 분배되도록 순위화한 체중과 난수를 이용한 무작위 법으로 분배하였다.
- 본 시험물질은 콩과식물 중, phytoestrogen0] 다량 힘유된 식물을 선정하여 시험물질로 사용하였으며, 시험물질 건조함량 5 陞 k君을 용매(1차 증류수)로 추출하여 투여용량으로 결정하였다.
- 흰쥐 암컷((주) 오리엔트, 서울시 금천구 가산동 459-24) 8주령을 사용하였다. 동물입수 시 외관을 육안으로 검사한 후, 7일간 시험을 실시하는 동물 실에서 순화시키고 난소 적출술을 시행하였다.
데이터처리
- 모든 실험군에 대하여 동물측정용 저울로 체중을 즉정하고 평균과 표준 편차를 구하였다. 용매 대조군과 처치군 사이의 통계 학적 유의차는 Dunnett test에 의하여 검정하였고, p<0.
- 모든 실험군에 대하여 동물측정용 저울로 체중을 즉정하고 평균과 표준 편차를 구하였다. 용매 대조군과 처치군 사이의 통계 학적 유의차는 Dunnett test에 의하여 검정하였고, p<0.05를 실 험군 간의 유의성 있는 차이로 판정하였다.
이론/모형
- 이렇게 선택된 90마리를 각 군에 15마리씩 균등한 체중으로 분배되도록 순위화한 체중과 난수를 이용한 무작위 법으로 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모의 색소염색법과 개체식별 카드 표시법으로 실시하였다.
성능/효과
- 7주 및 14주간 시험물질 경구투여 후, 대조군의 모든 동물에서 대퇴골의 뼈 지주(Trabeculae), 파골세포(Osteogast)의 출현 빈도 및 골수 내 지방축적(联itty accumulation)이 관찰되었다. N.
- 그러나 T3 군에서는 구별이 가능한 정도의 감소 (+2) 가 확인되었다. 결론적으로 7주 및 14주 시험 모두에서 T3 군은 대퇴골 뼈 지주와 파골세포의 출현 빈도에서 개선 효과가 확인되었고 특히 14주 시험의 경우 대퇴골 뼈 지주에서 7주 시험보다 더 현저한 개선 효과가 관찰되었을 뿐만 아니라 지방축적에 서도 구별이 가능한 정도의 개선 효과가 있는 것으로 나타났다. 시험물질 갈근은 발효 전.
- 골밀도 측정에서 7주 부검 시 흉골 및 대퇴골의 골 밀도 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 14주째 대퇴골 골밀도는 대조군에 비해 N.C군 9.33%, T3군 5.46% 감소되었다. 파골세 포 측정 2De 난소를 적출한 후, 골다공증을 유발한 흰쥐를 이용하여 대퇴골에서 분리한 파골세포의 활성을 비교 평가하였다.
- 7주 부검 동물에서 흉골 및 대퇴골의 골밀도 변화는 측정되지 않았다. 그러나 난소적출 14주 대퇴골에서 대조군에 비해 N.C군 9.33%, T3군 5.46% 감소되었으며, 시험물질 14주 경구투여 시, 그 감소된 양의 41.48%를 회복시키는 것으로 나타났다.
- 그러나 부작용으로 생식능력 이상, 고환이나 유방암과 같은 에스트로겐 의존 적인 암의 발병률을 증가 시킨다 18-2。). 난소 적출 시 에스트로 겐 함량은 대조군에 비해 21.37% 감소하였으며 T1군 4.49%, T2 군 7.62%로 각각 에스트로겐 농도는 N.C® 보다. 증가하는 경향을 보였고, T3군 100.
- 난소를 적출한 시험 동물의 체중이 대조군에 비해 1주부터 유 의성(pvO.Ol) 있게 증가되었으며, 시험물질 2주간 연속 경구투여 시 증가됐던 체중이 T3 군에서 유의성 (pcO.Ol) 있게 감소됐음을 확인하였다(Table II).
- 난소적출 동물에서 파골세포의 활성이 증가하였으며, 시험물 질 7주 처리 T3 군에서는 음성대조군에 비해 미약한 활성을 보였다(Photo 3).
- 난소적출 시 에스트로겐 함량은 대조군에 비해 2137% 감소하는 것으로 나타났으며 시험물질 투여 T1 군 4.49%, T2군 7.62 %로 각각의 에스트로겐 농도는 음성대조군보다 증가하는 경향을 보였고 시험물질 투여 T3군 100.46%, T4군 117.65%로 대조군보다 각각 증가되었다. 특히 T4 군은 통계적으로 유의성(p＜O.
- 또한 골수 내 지방 축적이 현저히 증가하였다. 난소적출 후에 시험물질 Tl, T2 및 T4 투여 시 미세한 개선 효과가 형태학적으로 관찰되었으며, T3 군에서는 시험물질 7주 및 14주 경구 투여 시, 대퇴골 뼈 지주와 파골세포의 출현 빈도에서 N.C군에 비해 개선 효과가 확인되었고 특히 14주 시험의 경우 대퇴골 뼈 지주에서 7주 시험보다 더 뚜렷한 개선 효과가 관찰되었을 뿐만 아니라 지방축적에서도 구별이 가능한 정도의 축적억제 효과가 있는 것으로 나타났다(Photo 4). 자궁조직에 대한 병리소견은 Control군에서는 정상적인 자궁조직 소견이 관찰되었으나 N.
- C 군과 비교할 때 구별이 가능한 정도의 감소(7주 +1, 14주 +2) 를 확인하였다. 대퇴골에서의 뼈 지주와 파골세포 출현 빈도 외에 본 실험에서 평가한 골수 내 지방축적에 있어서는 Control군에서는 골수 내 지방축적이 정상적으로 적게(7주 및 14주 +1) 관찰되었으며 N.C군에서는 골수 내 지방축적이 현저히 증가(7주 및 14주+3)하였다. 그러나 T3 군에서는 구별이 가능한 정도의 감소 (+2) 가 확인되었다.
- 1). 비장은 대조군에 비해 난소 적출 군에서 증대되었으며 시험물질 14주 연속 경구투여 시, 비대된 비장을 유의성(p<0.05) 있게 감소시켰다(Fig. 2).
- 시험물질 투여에 의한 장기의 육안적 이상 변화는 관찰되지 않았으나, 난소 적출에 의한 자궁 위축 현상이 N.C 군에서 뚜렷이 나타났다.
- 01) 있게 되었다가 갈근 발효 투여 2주부터. 유의성(p＜O.Ol) 있게 감소됨을 확인하였다. 부검소견으로는 난소 적출에 의한 자궁 위축 현상이 N.
- C군에 비해 개선 효과가 확인되었고 특히 14주 시험의 경우 대퇴골 뼈 지주에서 7주 시험보다 더 뚜렷한 개선 효과가 관찰되었을 뿐만 아니라 지방축적에서도 구별이 가능한 정도의 축적억제 효과가 있는 것으로 나타났다(Photo 4). 자궁조직에 대한 병리소견은 Control군에서는 정상적인 자궁조직 소견이 관찰되었으나 N.C, T1 및 T4 군에서는 현저한 자궁위축 소견이 나타났다. 그러나 T3 군에서는 미약한 자궁위축 소견이 관찰되었다(Photo 2).
- C® 보다. 증가하는 경향을 보였고, T3군 100.46%, T4군 117.65%로 대조군보다 각각 증가되었다. 골밀도 측정에서 7주 부검 시 흉골 및 대퇴골의 골 밀도 변화는 관찰되지 않았다.
- 파골세 포 측정 2De 난소를 적출한 후, 골다공증을 유발한 흰쥐를 이용하여 대퇴골에서 분리한 파골세포의 활성을 비교 평가하였다. 파 골세포의 활성은 난소적출 동물에서 증가되었으며, 시험물질 7주 처리한 T3 군에서는 음성대조군에 비해 미약한 활성을 보였다. 병리조직 소견에서 Control군은 대퇴골의 뼈 지주(trabeculae)가 정상적으로(+4) 관찰되었으며(7주 및 14주), 파골세포 (osteoclast)의 출현 빈도는 매우 미약(7주 +/-, 14주 +/-)하였다.
후속연구
- 따라서 실험동물 암컷 흰쥐에서, 난소 제거에 의한 호르몬 불균형으로 과량의 지방이 체내 축적되고 이로 인하여 골다공증, 고지혈증, 지방간 등의 각종 대사성 질환이 유발된다. 따라서 시험물질 갈근 발효 추출액을 14주간 연속경구 투여 시, 호르몬 균형을 일정 부분 유지시켜 지방축적을 저해하는 물질로 작용하는 것으로 생각되며 골다공증 Type I뿐만 아니라 각종 내분비 질환 예방, 치료에 도움이 될 것으로 사료된다.
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