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문제 정의
- 본 연구에서는 수용성 약물의 서방화를 위해서 전보의 실험에서 사용하였던 W/O/W의 복잡한 절차를 간소화하고 실험단계에 따른 계의 자유에너지 증가로 인하여야기되는 이중층 미립구의 붕괴를 막고자 내부층으로는 다당류인 덱스트란을, 외부층으로는 생분해성 고분자 PLGA로 이루어진 이중층 미립구를 초고주파 분쇄의 유무에 따른 두 가지 O/W 용 매 증발법을 이용하여 제조하였다. 따라서 본 연구의 목적은 (1) O/W 용 매 증발법으로 이중층 미립구를 제조하여 절차를 간소화하고 (2) PLGA가 이중층 미립구의 형성에 미치는 영향을 알아보고자 PLGA의 함량에 따라 덱스트란을 10, 30, 50, 100, 150, 및 300 w/w%로 변화시켜 이중층 미립구를 제조하였다. 제조된 이중층 미립구의 크기를 현미경을 통하여 관찰하였으며 동초점 레이저형광 현미경(CLFM) 관찰을 통해 제조한 이중층 미립구의 형성을 관찰하였다.
제안 방법
- Hgure 7 (a), (b), 및(c)는 초고주파 분쇄 후 물리적 교반을 이용하여 제조한 이중 층 미립구의 CFLM 관찰 결과이다. Figure 6(a)의 결과와 마찬가지로 Figure 7(a)에서 형광물질을 확인하였으며 이에 위의 두 가지 방법으로 덱스트란을 포 접하는 PLGA 이중층 미립구를 제조하였음을 확 인하였다.
- 5 g의 PVA 및 0.5 g의 덱스트란을 첨가하여 용해시킨 분산상을 제조하고 5 mL의 DCM에 10, 30, 50, 100, 150, 및 300 w/w%의 PLGA를 각각 용해시킨 분산매를 한 방울씩 떨어뜨려 초고주파 분쇄 없이 7시간 이상의 지속적인 물리적 교반으로 제조하였으며 Figure 2(b)와 같이 50 mL의 증류수에 1.5 g의 안정화제인 PVA 및 0.5 g의 덱스트란을 첨가하여 용해시킨 분산상을 제 조하고 5 mL의 DCM에 10, 30, 50, 100, 150, 및 300 w/w%의 PLGA를 각각 용해시킨 분산매를 함께 섞어 7시간 이상의 지속적인 물리적 교반으로 제조하였다.
- 성질이 유사한 용매끼리는 서로 상분리되지 못하고 섞이기 때문에 이중 중 미 립구 의 제조가 어렵다.*'6 ' 따라서 본 연구에서는 성질이 아주 다른 친수성의 덱스트란과 소수성의 PLGA의 상분리를 이용하여 미립구를 제조하였다. 그러나 성질의 큰 차이로 인해서 두고분자 사이의 반발력이 강하여 오히려 그들의 공존을 방해하게 된다.
- 제조된 이중층 미립구의 크기를 현미경을 통하여 관찰하였으며 동초점 레이저형광 현미경(CLFM) 관찰을 통해 제조한 이중층 미립구의 형성을 관찰하였다. 또한 이중층 미립구의 표면과 단면의 모폴로지를 관찰하기 위하여 전자주사 현미 경(scanning election microscope, SEM)으로 관찰하였다.
- 본 연구에서 초고주파 분쇄유무에 따른 O/W용매 증발법을 이용하여 PLGA 함량에 따라 제조한 이중층 미립구의 크기와 특성을 캠스코프를 이용하여 관찰하였으며, 각각 제조한 이중층 미립구를 비교하여 Table 2와 Figures 3 및 4에 나타내었다.
- 본 연구에서는 수용성 약물의 서방화를 위해서 전보의 실험에서 사용하였던 W/O/W의 복잡한 절차를 간소화하고 실험단계에 따른 계의 자유에너지 증가로 인하여야기되는 이중층 미립구의 붕괴를 막고자 내부층으로는 다당류인 덱스트란을, 외부층으로는 생분해성 고분자 PLGA로 이루어진 이중층 미립구를 초고주파 분쇄의 유무에 따른 두 가지 O/W 용 매 증발법을 이용하여 제조하였다. 따라서 본 연구의 목적은 (1) O/W 용 매 증발법으로 이중층 미립구를 제조하여 절차를 간소화하고 (2) PLGA가 이중층 미립구의 형성에 미치는 영향을 알아보고자 PLGA의 함량에 따라 덱스트란을 10, 30, 50, 100, 150, 및 300 w/w%로 변화시켜 이중층 미립구를 제조하였다.
- , Tokyo, Japan)으로 교류전압(ACC voltage) 15 kV에서 각각 60, 500, 및 800배율로 관찰하였으며 또한 단면의 관찰을 위하여 액체질소에서 동결시켜 잘라내어 실시하였다. 본 연구에서는 이중층 미립구의 SEM 관찰을 위하여 플라스마스퍼터 (Emiteck, K575, UK)를 이용하여 아르곤 가스 하에서 백금 코팅을 실시한 후 관찰하였다.
- 형광물질을 감지하는 CFLM 특성상 덱스트란에 형광물질이 존재하는지 FITC-덱스트 란을 사용하였다. 본 측정은 일정량의 제조된 이중층 미립구가 뿌려진 슬라이드 글라스에 커버를 덮어 고정시킨 후 200배율로 실시하였다.
- 소수성인 PWA와 친수성인 덱스트란의 서로 다른 성질의 고분자를 이용하여 초고주파 분쇄 유무에 따른 O/W 용매증발법을 이용하여 전보의 실험에서 사용하였던 W/O/W 이 중유화 용매증발법보다 절차를 간소화하였으며 비교적 용이하게 이중층 미립구를 제조하였다. 이를 캠스코프, SEM 관찰을 통하여 초고주파 분쇄유무에 관계없이 제조한 이중층 미립구가 매그러운 표면을 갖고 있는 구형의 형태를 띠며 내부층 이 외부층과 뚜렷히 구분되어 있는 즉 이중층 미립구가 형성되어 있음을 확인하였다.
- 이 중층 미립구의 표면과 단면의 모폴로지를 관찰하기 위하여 SEM (model S-2250N, Hitachi Co., Tokyo, Japan)으로 교류전압(ACC voltage) 15 kV에서 각각 60, 500, 및 800배율로 관찰하였으며 또한 단면의 관찰을 위하여 액체질소에서 동결시켜 잘라내어 실시하였다. 본 연구에서는 이중층 미립구의 SEM 관찰을 위하여 플라스마스퍼터 (Emiteck, K575, UK)를 이용하여 아르곤 가스 하에서 백금 코팅을 실시한 후 관찰하였다.
- 그러나 성질의 큰 차이로 인해서 두고분자 사이의 반발력이 강하여 오히려 그들의 공존을 방해하게 된다. 이러한 현상을 방지하기 위하여 안정화제인 PVA를 분산 매인 덱스트란 수용액에 용해시켜 이중층 미립구를 제조하였다. 그러나 PV\의 침전에 따른 영향으로 제조한 미립구들 간의 회합 현상이 존재하였으며 이러한 현상은 초고주파 분쇄를 실시하였을 경우 더 많이 보였으나 초고주파 분쇄의 유무에 관계없이 발생하였으며 이는 안정화제인 PVA의 양과 미립구의 제조조건을 조절한다면 미립구와 안정화제의 고른 분산으로 배제시킬 수 있다고 사료된다”"
- 또한 외부의 다 공이 많은 구조는 PLGA로 구성되었기 때문으로 보인다. 이에 O/W용매 증발법을 이용하여 덱스트란을 포함하는 PLGA 이중층 미립구를 제조하였음을 확인하였다.
- 따라서 본 연구의 목적은 (1) O/W 용 매 증발법으로 이중층 미립구를 제조하여 절차를 간소화하고 (2) PLGA가 이중층 미립구의 형성에 미치는 영향을 알아보고자 PLGA의 함량에 따라 덱스트란을 10, 30, 50, 100, 150, 및 300 w/w%로 변화시켜 이중층 미립구를 제조하였다. 제조된 이중층 미립구의 크기를 현미경을 통하여 관찰하였으며 동초점 레이저형광 현미경(CLFM) 관찰을 통해 제조한 이중층 미립구의 형성을 관찰하였다. 또한 이중층 미립구의 표면과 단면의 모폴로지를 관찰하기 위하여 전자주사 현미 경(scanning election microscope, SEM)으로 관찰하였다.
- 제조한 미립구의 SEM의 단면 관찰을 통해 확인한 서로 다른 외부층과 내부층의 구성물질을 확인하고자 FTTC가 결합되어 있는 덱스트란을 이용하여 CFLM을 관찰하였다. Figuxe 6의(a), (b), 및(c)는 본 연구에서 초고주파 분쇄 없이 실시한 물리적 교반을 이용하여 제조한 이중층 미립구의 CFLM 관찰 결과이다.
- 제조한 이중층 미립구의 내부층 인 덱스트란이 PLGA에 의해 포접되어 있는지를 확인하기 위해서 CFLM을 이용하였다. 형광물질을 감지하는 CFLM 특성상 덱스트란에 형광물질이 존재하는지 FITC-덱스트 란을 사용하였다.
- 제조한 이중층 미립구의 외부 형태, 및 크기를 측정하기 위해 캠스코프(Camscope, Model SV-32, Sometech, Korea)를 통하여 300배의 배율에서 실시하였으며 관찰된 이미지는 IT PRO(Sometech, Korea)< 통하여 분석하였다.
- KG, Schwabach, Germany)을 사용하였으며 회전속도는 분당 300 rpm으로 하였다. 초고주파 분쇄기는 ultrasonic dismembrator model 500 (Fisher Scientific, USA)을 사용하여 출력 30%에서 30초간 실시하였다. 교반 후 용액을 증류수로 희석시켜 원심분리기에서 2000 rpm으로 4분간 원심분리하여 미립구를 가라앉힌 후에 상 등액을 걸러내어버린 다음 5번의 증류수 세척 과정을 통해 미립구를 얻어내었다.
- 제조한 이중층 미립구의 내부층 인 덱스트란이 PLGA에 의해 포접되어 있는지를 확인하기 위해서 CFLM을 이용하였다. 형광물질을 감지하는 CFLM 특성상 덱스트란에 형광물질이 존재하는지 FITC-덱스트 란을 사용하였다. 본 측정은 일정량의 제조된 이중층 미립구가 뿌려진 슬라이드 글라스에 커버를 덮어 고정시킨 후 200배율로 실시하였다.
대상 데이터
- Ltd.(Tolg, o, Japan) 제품을 사용하였다. CLFM 관찰을 위해 사용된 플루오르 신 5-이소시아네이트- 덱스트란(FTTC-dextram)은 분자량이 40000 g/mol로 Sigma Chem.
- CLFM 관찰을 위해 사용된 플루오르 신 5-이소시아네이트- 덱스트란(FTTC-dextram)은 분자량이 40000 g/mol로 Sigma Chem. Co제 품을 구입하여 사용하였다. 이염화 메탄(DCM)은 Merck Co(Menheim, Gennany)에서 구입하여 사용하였다.
- 사(St・ Louis, Mo, USA)제품을 구입하여 사용하였다. PLGA는 분자량이 90000 g/mol 로 RESOMER RG 752(락타이드/글리 콜라이드 몰비, 75/25, Boehringer Ingetheim Chem. Co. Ltd., Manheim, Gennany) 제품을 구입하여 사용하였다. 덱스트란 수용액의 안정화제로 쓰인 폴리(비닐 알코올)(PVA)은 분자량이 1500 g/mol로 Showa Chem Co.
- 본 실험에서 사용한 물리적 교반기는 RZR 2102(Heidolph Instrument Gmbh & Co. KG, Schwabach, Germany)을 사용하였으며 회전속도는 분당 300 rpm으로 하였다. 초고주파 분쇄기는 ultrasonic dismembrator model 500 (Fisher Scientific, USA)을 사용하여 출력 30%에서 30초간 실시하였다.
- 본 연구에서 사용된 덱스트란은 생분해성 기능을 가진 고분자로서 단량체로는 a-D-글루코스로 분자량은 천연 상태에서 4000000 g/m이정 도이다. 이러한 덱스트란은 물에 잘 녹는 수용성으로 시럽제의 원료나 생리식염수의 첨가제로 사용되고 있다.
- Co제 품을 구입하여 사용하였다. 이염화 메탄(DCM)은 Merck Co(Menheim, Gennany)에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 이 중층 미립구의 제조는 Hguie 2(a)에서처럼 O/W 방법을 이용하였다. 우선 50 mL의 증류수에 안정화제인 1.
성능/효과
- 초고주파 분쇄 후 교반을 실시한 결과 DCM의 고른 분산으로 인해 휘발이 촉진되며 이때 DCM에 용해되어 있는 PLGA가 석출되어 재결정이 발생하며, 이로 인해 불투명한 흰색의 구체를 형성하는 것으로 사료된다.3 O/W 용매증발법을 이용하여 제조한 이중층 미립구는 초고주파 분쇄의 유무에 관계없이 수μm이하의 크기부터 수백 μm에 이르는 미립구가 존재하였으며 전체적으로 미립구의 크기가 증가하는 경향을 보였다. 이는 분산상인 PLGA의 농도 증가로 인한 점도 가 증가하여 포접된 분산매인 덱스트란이 빠져나가는 것을 느리게 함으로써 PLGA 이 중층 미립 구내의 덱스트란 포 접량을 증가시켜 크기가 증가하는 것으로 사료된다.
- 그러나 초고주파 분쇄 없이 실시한 물리적 교반을 이용하여 제조한 이중층 미립구와 초고주파 분쇄 후 교반법을 이용하여 제조한 이중층 미립구를 비교하여 보았을 때 Figure 6보다 Hgure 7의 외부층이 얇다는 것을 확인할 수 있었으며 이는 초고주파 분쇄로 인해 분산 매가 분산상에 고르게 분산되어 분산상을 용해시킨 용매의 증발 속도가 빨라 나타난 결과로 사료된다.
- 이에 형광물질인 FITC가 결합되어 있는 덱스트란을 이용한 CFLM 분석을 통해 분산 매인 친수성의 덱스트란을 포 접하고 있는 PLGA 이중층 미립구를 형성하였음을 확인하였다. 또한 분산상인 PLGA의 함량이 증가할수록 분상상의 점도 증가로 인하여 미립구의 크기가 증가함을 확인하였으며 이에 따라 안정화제와 미립구의 제조조건을 조절한다면 크기의 조절이 가능할 것으로 사료된다. 본 연구에서 제조한 이중층 미립구는 덱스트란 내부에 여러 약물 및 단백질로 포접시키고 PLGA에 환부로 목표 지향화할 수 있는 리셉터 /리간드를 포접시켜 특정 약물을 국부지향화할 수 있다고 사 료된다.
- 이 결과로부터, PLGA의 농도가 증가할수록 제조한 미립구의 크기가 증가함을 확인할 수 있었으며 초고주파 분쇄 유무에 관계없이 매끄러운 표면을 갖는 구형의 미립구의 형태를 띠고 있음을 확인할 수 있다. 그러나 제조한 미립구는 초고주파 유무에 따라, 즉 용매의 증발 속도에 따라 미립구의 투명도와 크기의 분산에서 큰 차이를 보이는 것으로 사료된다.
- 소수성인 PWA와 친수성인 덱스트란의 서로 다른 성질의 고분자를 이용하여 초고주파 분쇄 유무에 따른 O/W 용매증발법을 이용하여 전보의 실험에서 사용하였던 W/O/W 이 중유화 용매증발법보다 절차를 간소화하였으며 비교적 용이하게 이중층 미립구를 제조하였다. 이를 캠스코프, SEM 관찰을 통하여 초고주파 분쇄유무에 관계없이 제조한 이중층 미립구가 매그러운 표면을 갖고 있는 구형의 형태를 띠며 내부층 이 외부층과 뚜렷히 구분되어 있는 즉 이중층 미립구가 형성되어 있음을 확인하였다. 이에 형광물질인 FITC가 결합되어 있는 덱스트란을 이용한 CFLM 분석을 통해 분산 매인 친수성의 덱스트란을 포 접하고 있는 PLGA 이중층 미립구를 형성하였음을 확인하였다.
- 이를 캠스코프, SEM 관찰을 통하여 초고주파 분쇄유무에 관계없이 제조한 이중층 미립구가 매그러운 표면을 갖고 있는 구형의 형태를 띠며 내부층 이 외부층과 뚜렷히 구분되어 있는 즉 이중층 미립구가 형성되어 있음을 확인하였다. 이에 형광물질인 FITC가 결합되어 있는 덱스트란을 이용한 CFLM 분석을 통해 분산 매인 친수성의 덱스트란을 포 접하고 있는 PLGA 이중층 미립구를 형성하였음을 확인하였다. 또한 분산상인 PLGA의 함량이 증가할수록 분상상의 점도 증가로 인하여 미립구의 크기가 증가함을 확인하였으며 이에 따라 안정화제와 미립구의 제조조건을 조절한다면 크기의 조절이 가능할 것으로 사료된다.
후속연구
- 또한 분산상인 PLGA의 함량이 증가할수록 분상상의 점도 증가로 인하여 미립구의 크기가 증가함을 확인하였으며 이에 따라 안정화제와 미립구의 제조조건을 조절한다면 크기의 조절이 가능할 것으로 사료된다. 본 연구에서 제조한 이중층 미립구는 덱스트란 내부에 여러 약물 및 단백질로 포접시키고 PLGA에 환부로 목표 지향화할 수 있는 리셉터 /리간드를 포접시켜 특정 약물을 국부지향화할 수 있다고 사 료된다.
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