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제안 방법
- 23-26 소혈청 단백질을 함유한 이중층 나노미립구 제조, 폴리오쏘에스터(POE)/락타이드-글리콜라이드 공중합체(PLGA)를 이용한 이중층 나노 미립구 제조 등의 실험이 수행되어 단백질 약물의 서방 화 혹은 방출제어가 가능함을 알 수 있었다.10-12 따라서 본 실험에서는 수용성 약물의 서방화를 위해 덱스트란을 내부의 물질로 이용하였으며, PLGA를 외부 물질로 이용하여 생체 내에서 분해가 가능한 이중층 나노입자를 제조하였다.2나노 미립구 제 조를 위한 계면활성제는 수용성 고분자인 폴리(비닐 알코올)(PVA)을 이용하였다13,15 이중층 나노미립구의 물성은 고분자 용액의 부피비, 포접형성 온도, 고분자의 분자량 비, 고분자 용액의 농도 등에 의해 달라진다.
- 2나노 미립구 제 조를 위한 계면활성제는 수용성 고분자인 폴리(비닐 알코올)(PVA)을 이용하였다13,15 이중층 나노미립구의 물성은 고분자 용액의 부피비, 포접형성 온도, 고분자의 분자량 비, 고분자 용액의 농도 등에 의해 달라진다.12,13,14 본 실험에서는 계면활성제로 이용된 PVA의 농도에 따른 실험을 실시하였으며, 전자주사현미경(SEM) 및 전자투과 현미경 (TEM)을 통해 확인하였다. 덱스트란의 생체외방출 거동을 확인하기 위해 각 시료들을 직경 3X1 mm 몰드를 이용하여 각 샘플들을 웨이퍼로 제조하고 덱스트란의 방출 결과는 HPLC를 이용하여 확인하였다.
- 45 ㎛의 필터를 이용하여 단순 분산된 물질을 제거하였다. HPLC를 이용하여 용해된 덱스트란의 양을 측정하였다.
- , Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다. SEM 사진 촬영을 위해 시료를 금속판 위에 고정시킨 후, 플라즈마 스퍼터곤 가스를 충진하면서 1분 30초 동안 백금 코팅을 실시하였다. 코팅이 완료된 시료를 15kV에서 관찰하였다.
- TEM을 통해 미립구의 내부 형상을 관찰하였다(Figua 5). SEM사 진 판독 결과 나노미립구 형성이 가장 우수한 PVA 함량이 0.
- 유상 제조를 위해 DCM 12 mL에 PLGA를 15 mg 첨가하여 용해시켰다. W/O 에멀젼을 제조하기 위해 두 용액을 혼합한 후 초 음파분쇄(Power Sonic 510, Hwashin, Korea)를 이용하여 5초간 분산시켰다. 이 용액을 250 mL의 PBS에 첨가한 후 교반기를 이용하여 교반하였다.
- 제조된 시료(5 mg)를 증류수(10 mL)에 희석하여 상층액을 취하여 실험을 수행하였다. W/O/W에 의해 이중층 나노미립구의 반응에 참여하지 못한 PLGA를 제거하기 위해 장시간 방치하여 침전시키고 육안으로 완전히 용해된 상층액을 실험에 이용하였다. 200.
- 100 Psi의 압력을 5초간 가하여 웨이퍼를 제조하였다. 각 시료당 3개씩 제조하여 증류수에서 in vitro 방출거동을 확인하였으며 7일간 방출 후 동결건조하여 웨이퍼의 물성을 현미경(Sometech, Korea)을 이용하여 40배 확대하여 관찰하였다.
- 나노미립구의 물성 확인을 위해 SEM을 측정하였다. Figures 1과 2에는 대조군(순수한 덱스트란, 순수한 PLGA, 데스트란-PLGA 간의 물리적인 혼합, 덱스트란만의 나노 미립구 그리고 PLGA만의 나노 미립구)을 나타내었다.
- 순수한 덱스트란, 순수한 PLGA, 덱스트란-PLGA 간의 물리적인 혼합, 덱스트란만의 나노 미립구 그리고 PLGA만의 나노미립구를 설정하였다. 덱스트란 또는 PLGA 나노미립구는 이중층 나노미립구와 동일한 방식으로 제조하였으며 덱스트란 나노미립구는 DCM의 양이 과량인 점을 감안, 액체질소를 이용하여 동결시킨 후 건조 과정을 수행하였다. 또한 제조과정에 따른 물성 변화 확인을 위해 증발기를 이용하여 건조시킨 이중층 나노미립구시료를 제조 하였다.
- 덱스트란의 생체 외 방출거동을 확인하기 위해 채취한 시료를 HPLC 로 정량하였다. 분석에 이용한 컬럼은 C, s(3.
- 12,13,14 본 실험에서는 계면활성제로 이용된 PVA의 농도에 따른 실험을 실시하였으며, 전자주사현미경(SEM) 및 전자투과 현미경 (TEM)을 통해 확인하였다. 덱스트란의 생체외방출 거동을 확인하기 위해 각 시료들을 직경 3X1 mm 몰드를 이용하여 각 샘플들을 웨이퍼로 제조하고 덱스트란의 방출 결과는 HPLC를 이용하여 확인하였다. 웨이퍼의 방출 후 물성 변화를 SEM 및 현미경을 이용하여 확인 하였다.
- 덱스트란 또는 PLGA 나노미립구는 이중층 나노미립구와 동일한 방식으로 제조하였으며 덱스트란 나노미립구는 DCM의 양이 과량인 점을 감안, 액체질소를 이용하여 동결시킨 후 건조 과정을 수행하였다. 또한 제조과정에 따른 물성 변화 확인을 위해 증발기를 이용하여 건조시킨 이중층 나노미립구시료를 제조 하였다.
- 이동상은 증류수와 아세토니 트릴을 1 : %v/v%)로 혼합하여 제조하였다. 맴브레인 필터(nylon acnodisc, 0.45 皿 Whatman, Kent, England)를 이용하여 여과한 후 1시간 동안 초음파를 실시하여 잔류 공기를 제거한 후 사용하였다. 유속은 1.
- 상기 방법으로 제조된 나노미립구의 모폴로지를 SEM(Model: S- 2250N, Hitachi Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다. SEM 사진 촬영을 위해 시료를 금속판 위에 고정시킨 후, 플라즈마 스퍼터곤 가스를 충진하면서 1분 30초 동안 백금 코팅을 실시하였다.
- 이중층 나노미립구와 물성비교를 위해 5가지의 대조군을 설정하 였다0able 1).순수한 덱스트란, 순수한 PLGA, 덱스트란-PLGA 간의 물리적인 혼합, 덱스트란만의 나노 미립구 그리고 PLGA만의 나노미립구를 설정하였다. 덱스트란 또는 PLGA 나노미립구는 이중층 나노미립구와 동일한 방식으로 제조하였으며 덱스트란 나노미립구는 DCM의 양이 과량인 점을 감안, 액체질소를 이용하여 동결시킨 후 건조 과정을 수행하였다.
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2.7생체외 방출 실험
실험군(PVA농도 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 및 0.4 w/v%)과 대조군(덱스트란 및 물리적인 혼합 모델)으로 웨이퍼를 제조하여 20 mL의 증류수에 첨가하고 인큐베이터 안에서 37.5 ℃로 보정한 다음 30, 60분, 3,6, 12, 24시간, 2, 3, 7일에 각각 1 mL을 취하여 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 단순 분산된 물질을 제거하였다. HPLC를 이용하여 용해된 덱스트란의 양을 측정하였다.
- 웨이퍼 방출 실험 동안 일정 시간에 추출한 시료를 HPLC로 정량하여 덱스트란의 방출 거동을 확인하였다(Figure 8).상기 제조한 웨이퍼의 방출 후 모습에서 예상되었듯이 계면활성제의 양에 따라 이중층 내부에 존재하는 덱스트란의 방출 거동은 상당한 차이가 있었다.
- 덱스트란의 생체외방출 거동을 확인하기 위해 각 시료들을 직경 3X1 mm 몰드를 이용하여 각 샘플들을 웨이퍼로 제조하고 덱스트란의 방출 결과는 HPLC를 이용하여 확인하였다. 웨이퍼의 방출 후 물성 변화를 SEM 및 현미경을 이용하여 확인 하였다.
- 이중층 나노미립구와 물성비교를 위해 5가지의 대조군을 설정하 였다0able 1).순수한 덱스트란, 순수한 PLGA, 덱스트란-PLGA 간의 물리적인 혼합, 덱스트란만의 나노 미립구 그리고 PLGA만의 나노미립구를 설정하였다.
- 제조된 나노미립구의 외부 형태와 내부의 덱스트란 봉입 유무를 TEM(JEOL, Co., TEM-2010 Tokyo, Japan)을 사용하여 확인하였다. 제조된 시료(5 mg)를 증류수(10 mL)에 희석하여 상층액을 취하여 실험을 수행하였다.
- ,18 이중층 나노 미립구 제조는 두 가지 방법이 있다. 첫 번째 방법은 미립구 제조 기술을 이용하여 내부 형태를 만든 다음 다른 종류의 고분자를 이용하여 나노 미립구를 코팅하는 것이고 두 번째 방법은 두 종류고분자 를 각각 다른 용매에 용해시킨 후 상분리 현상을 이용한 것이다.11,20-22
- SEM 사진 촬영을 위해 시료를 금속판 위에 고정시킨 후, 플라즈마 스퍼터곤 가스를 충진하면서 1분 30초 동안 백금 코팅을 실시하였다. 코팅이 완료된 시료를 15kV에서 관찰하였다.
대상 데이터
- Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하여 이용하였다. 제이인산나트륨은 Junsei Chem.
- (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. PLGA(RG 502 H, Mw; 8000 g/mole) 는 Boerhinger Ingetheim(Manheim, Germany)에서 구입하여 별도의 정제과정 없이 이용하였다. PVA(87-89 mol% hydrolysed, Mw ; 31000 — 50000 g/mole)는 Aldrich Chem.
- PLGA(RG 502 H, Mw; 8000 g/mole) 는 Boerhinger Ingetheim(Manheim, Germany)에서 구입하여 별도의 정제과정 없이 이용하였다. PVA(87-89 mol% hydrolysed, Mw ; 31000 — 50000 g/mole)는 Aldrich Chem. Co.
- 덱스트란의 생체 외 방출거동을 확인하기 위해 채취한 시료를 HPLC 로 정량하였다. 분석에 이용한 컬럼은 C, s(3.9X300 mm), 10 ㎛(Ilrend, Waters)를 이용하였다. 이동상은 증류수와 아세토니 트릴을 1 : %v/v%)로 혼합하여 제조하였다.
- 15 M에 용해시켰다. 실험에서 이용한 PBS에는 계면활성제 역할을 수행하는 PVA가 함량별(0.0, 0.1, 0.2, 0.3, and 0.4 w/v%)로 각각 용해되어 있었다. 유상 제조를 위해 DCM 12 mL에 PLGA를 15 mg 첨가하여 용해시켰다.
- 9X300 mm), 10 ㎛(Ilrend, Waters)를 이용하였다. 이동상은 증류수와 아세토니 트릴을 1 : %v/v%)로 혼합하여 제조하였다. 맴브레인 필터(nylon acnodisc, 0.
이론/모형
- 생분해성 고분자로 구성된 덱스트란/PLGA 이중층 나노미립구는 water-in-oil-in-water(W/O/W) 이 중 에멀젼의 용액 증발 방식을 이용하여 제조하였다. 대표적으로 15 mg의 덱스트란을 PBS 0.
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