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문제 정의
- 평가하였다. 또한, 동물용 생 바이러스 백신의 안전성 및 품질향상을 위해 universal primers를 이용한 동물용 생 바이러스 백신에 대한 PCR 검사법의 적용 가능성을 평가하였다. 기존의 연구자들에 의하면 universal primers는 16S rRNA 유전자를 근거로 하여 세 포배양내 주된 오염균인 M.
- 본 연구에서는 동물용 생 바이러스 백신의 안전성 및 품질향 상을 위해 Wong-Lee와 Lovett(26)가 언급한 PCR 기법과 2종류의 PCR 킷트를 이용해 다양한 종류의 mycoplasma 검출효율을 비교하였으며, mycoplasma 배양액 및 시판백신 내 mycoplasma 를 인공적으로 접종한 후 PCR 기법의 검출한계를 비교 . 조사함 으로써 동물용 생 바이러스 백신에 오염된 mycoplasma를 효과적으로 검출하기 위한 PCR 기법의 적용가능성을 평가하였다.
제안 방법
- 민감도를 조사하기 위하여 4주의 mycoplasma 표준주를 이용하여 universal primers로 PCR을 실시하였다. 4개의 표준주를 10 일간 배양한 후, 9 CFR Mycoplasma 액체배지로 10진 희석한 다음, 계수를 위해 각 희석단계별 배 양물 100 pl# 9 CFR Mycoplasma 한천배지에 접종하였으며, PCR 실시를 위해 각 희 석단계별 배양물 1 ml를 사용하였다.
- 9주의 mycoplasma에 대하여 universal primers와 시판 검줄 킷 트(T사, R사)간의 검줄 유효성을 비교조사 하였다. Universal primers의 경우, A.
- Mycoplasma universal primers 및 2종류의 시판 검줄킷트의 mycoplasma 검출 유효성을 비교조사하기 위하여 8주의 mycoplasma 표준주, 1주의 M. gallisepticum 백신주(ts-11), 그리고 8주의 세균을 이용하여 실시하였다. 또한, mycoplasma universal primers의 조류유래 mycoplasma 검출 유효성조사는 조 류유래 mycoplasma 표준주 4주 및 M.
- Mycoplasma universal primers는 유전자 변이가 거의 없는 것으로 알려진 16S rRNA 유전자를 기초로 하여 464 bp의 PCR 산물이 증폭되도록 고안된 Wong-Lee와 Lovett (25)의 방법에 준 하여 작성하였으며, 반응조건에서 전술한 연구자들이 PCR의 각 반응온도(94, 60, 72℃)에서 매 cycle 마다 ramp time을 1초씩 설정하였으나 본 실험에서는 ramp time을 설정하지 않았다(Table2). PCR 반응액은 2 μl의 10XPCR buffer(MgC12 첨가, 20 mM), 1(11 dNTP(lOmM), 각각 1 μl의 universal primer A와 B(10pM/ |il), 0.
- Mycoplasma 속균이 아닌 S. aureus 등 일반세균 8주에 대하여 universal primers와 시판 검출 킷트인 T사 및 R사의 검출특이성 을 비교 . 조사한 결과, 사용한 모든 PCR 기법에서 양성 대조균 인 M.
- Mycoplasma universal primers는 유전자 변이가 거의 없는 것으로 알려진 16S rRNA 유전자를 기초로 하여 464 bp의 PCR 산물이 증폭되도록 고안된 Wong-Lee와 Lovett (25)의 방법에 준 하여 작성하였으며, 반응조건에서 전술한 연구자들이 PCR의 각 반응온도(94, 60, 72℃)에서 매 cycle 마다 ramp time을 1초씩 설정하였으나 본 실험에서는 ramp time을 설정하지 않았다(Table2). PCR 반응액은 2 μl의 10XPCR buffer(MgC12 첨가, 20 mM), 1(11 dNTP(lOmM), 각각 1 μl의 universal primer A와 B(10pM/ |il), 0.1 |il Taq DNA polymerase(5U/gl), 2jil sample DNA를 혼 합한 후 최종 반응량이 20 μl가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였 으며 DNA thermal cycler(GeneAmp PCR system 9600? Perkin- Elmer, USA)를 이용하여 Table 2와 같이 반응을 실시하였다. 그 외 시판 검출킷트인 PCR Mycoplasma detection kit(Takara Bio inc.
- 단, 본 실 험은 PCR기법간 mycoplasma 검줄특이성 비교를 목적으로 하여 R사의 Mycoplasma PCR ELISA kit중 제조사의 lysis reagent와 PCR premix만을 이용하였다. PCR 증폭산물은 ethidium bromide (0.5p_g/ml)이 첨가된 1.5 % agarose gel에서 전기영동한 우 UV transilluminatoi에서 특이 band를 관찰하였다.
- Universal primers, R/사 및 T사 PCR 킷트를 이용한 각각의 PCR 반응의 특이성을 조사하기 위하여 양성 대조로 M. orale를 사용하였으며, 가축에 흔히 감염되는 8주의 세균배양액에 대하여 앞에서 언급한 PCR 반응조건으로 PCR을 실시하여 각각의 PCR 반응의 특이성을 조사하였다.
- , Japan)와 Mycoplasma PCR ELISA kit(Roche, Germany)는 제조사의 권장 사용술식에 준하여 시험에 이용하였다. 단, 본 실 험은 PCR기법간 mycoplasma 검줄특이성 비교를 목적으로 하여 R사의 Mycoplasma PCR ELISA kit중 제조사의 lysis reagent와 PCR premix만을 이용하였다. PCR 증폭산물은 ethidium bromide (0.
- 인공 배양한 mycoplasma를 이용한 PCR 민감도 결과를 근거 로 시판 백신에 대하여 적용 가능한 PCR 기법의 민감도를 조사 하기 위해 배양한 mycoplasma를 시판되는 동물용 생 바이러스 백신에 접종한 후 검출한계를 비교조사 하였다. 돼지 전염성 위 장염 및 로타바이러스 생 혼합 건조백신과 개 파보바이러스 생 건조백신을 각각 희석액으로 용해한 후 A. laidlawii 배양액(106.0 cfu/ml)을 첨가한 다음 10진희석하여 37℃에서 20시간 배양하고 증 식된 집락을 계수한 후 PCR 기법의 검출한계를 비교 조사하였다.
- gallisepticum 백신주(ts-11), 그리고 8주의 세균을 이용하여 실시하였다. 또한, mycoplasma universal primers의 조류유래 mycoplasma 검출 유효성조사는 조 류유래 mycoplasma 표준주 4주 및 M. synoviae 분리주 7주를 이용하여 추가로 실시하였다.
- 민감도를 조사하기 위하여 4주의 mycoplasma 표준주를 이용하여 universal primers로 PCR을 실시하였다. 4개의 표준주를 10 일간 배양한 후, 9 CFR Mycoplasma 액체배지로 10진 희석한 다음, 계수를 위해 각 희석단계별 배 양물 100 pl# 9 CFR Mycoplasma 한천배지에 접종하였으며, PCR 실시를 위해 각 희 석단계별 배양물 1 ml를 사용하였다.
- synoviae 분리주는 미국약전(15)에 등재된 9 CFR Mycoplasma 액체배지에서 37℃, 5% Cq하에 10일간 증균하였다. 배양물의 증균 농도를 확인하기 위하여 새로운 배지로 10진 희석하여 각 희석단계별 배양물 100ul를 9 CFR Mycoplasma 한천배지 3 plates에 접종한 다음 동일조건에서 5일 배양한 후 균증식성을 위상차현미경하에서 colony forming unit (cfu) 단위로 계수한 다음 평균치를 산출하였다. 8주의 세균은 각각의 권장배지에서 배 양하여 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 동물용 생 바이러스 백신의 안전성 및 품질향 상을 위해 Wong-Lee와 Lovett(26)가 언급한 PCR 기법과 2종류의 PCR 킷트를 이용해 다양한 종류의 mycoplasma 검출효율을 비교하였으며, mycoplasma 배양액 및 시판백신 내 mycoplasma 를 인공적으로 접종한 후 PCR 기법의 검출한계를 비교 . 조사함 으로써 동물용 생 바이러스 백신에 오염된 mycoplasma를 효과적으로 검출하기 위한 PCR 기법의 적용가능성을 평가하였다.
- 각종 세포배양 등에 오염된 mycoplasma를 검출하기 위한 많은 PCR 기법 및 시판킷트가 개발되어 실용화되고 있다(8, 11, 12, 13, 17, 18, 20, 21, 26). 본 연구에서는 시판되는 2종의 mycoplasma 검줄킷트와 mycoplasma 검줄 특이성과 민감도가 높 다고 알려져 있는 Wong-Lee와 Lovett (26)의 universal primers 를 자체 제작하여 PCR 반응조건을 일부 변경한 후, 각종 mycoplasma 및 세균들에 대한 PCR 검출특이성을 비교 . 평가하였다.
- 인공 배양한 mycoplasma를 이용한 PCR 민감도 결과를 근거 로 시판 백신에 대하여 적용 가능한 PCR 기법의 민감도를 조사 하기 위해 배양한 mycoplasma를 시판되는 동물용 생 바이러스 백신에 접종한 후 검출한계를 비교조사 하였다. 돼지 전염성 위 장염 및 로타바이러스 생 혼합 건조백신과 개 파보바이러스 생 건조백신을 각각 희석액으로 용해한 후 A.
대상 데이터
- Table 1에 나타난 바와 같이 본 연구에 사용된 균주는 11주의 mycoplasma 표준균주, 1주의 mycoplasma 백신주, 7주의 M. synoviae 분리주는 미국약전(15)에 등재된 9 CFR Mycoplasma 액체배지에서 37℃, 5% Cq하에 10일간 증균하였다. 배양물의 증균 농도를 확인하기 위하여 새로운 배지로 10진 희석하여 각 희석단계별 배양물 100ul를 9 CFR Mycoplasma 한천배지 3 plates에 접종한 다음 동일조건에서 5일 배양한 후 균증식성을 위상차현미경하에서 colony forming unit (cfu) 단위로 계수한 다음 평균치를 산출하였다.
이론/모형
- Genomic DNA 추출은 Sasaki 등(17)의 방법을 이용하였다. 즉, template DNA 용액은 mycoplasma 배양액 1 ml를 12,000 Xg에 30분 원심분리한 다음 상층액을 제거한 후 25 μ1 lysis buffer [10mM Tris-HCl (pH 8.
- 1 |il Taq DNA polymerase(5U/gl), 2jil sample DNA를 혼 합한 후 최종 반응량이 20 μl가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였 으며 DNA thermal cycler(GeneAmp PCR system 9600? Perkin- Elmer, USA)를 이용하여 Table 2와 같이 반응을 실시하였다. 그 외 시판 검출킷트인 PCR Mycoplasma detection kit(Takara Bio inc., Japan)와 Mycoplasma PCR ELISA kit(Roche, Germany)는 제조사의 권장 사용술식에 준하여 시험에 이용하였다. 단, 본 실 험은 PCR기법간 mycoplasma 검줄특이성 비교를 목적으로 하여 R사의 Mycoplasma PCR ELISA kit중 제조사의 lysis reagent와 PCR premix만을 이용하였다.
성능/효과
- synoviae 7주에 대하여 PCR 기법을 적용한 결과, 시험균주 모두에서 특이증폭산물 을 확인할 수 있어, 조류 병성감정 시료, 시육환경, 조류 백신 등에서 mycoplasma 감염 또는 오염유무를 1차적으로 확인 가능 함을 알 수 있었다. Mycoplasma 종에 따라 염기서열 및 그 크 기에 차이가 있는 것으로 알려진 16S~23S rRNA spacer 부위를 증폭시켜 각각의 균종에 따라 다양한 크기의 증폭산물이 검출되 게 하여 각각의 mycoplasma 균주를 PCR 증폭산물의 크기로 동 정할 수 있도록 제작한 T사의 킷트를 사용하여 8주의 mycoplasma 표준주 및 백신주를 검사하였을 때, 제조사의 시용 설명서에 언급되지 않은 A. laidlawii을 제외하고 7주에서 약 420 bp에서 850 bp 사이의 다양한 크기의 증폭산물들을 확인할 수 있었다. PCR 증폭산물을 biotin-labeled capture probe로 hybridization시켜 효소면 역법으로 mycoplasma 오염 유무를 확인 하는 R사 킷트의 경우, 제조사의 사용설명서에 언급되지 않eM.
- Universal primers를 이용한 PCR 기법으로 A. laidlawii 등 종 4주의 Mycoplasma속균의 PCR 검줄한계를 조사한바, A. laidlawiie}- M. bovis는 1025 cfu/ml, M. omle는 100.3 cfu/ml, M. gallisepticume IO0'1 cfu/ml로 균주에 따라 각각의 민감도가 상 이한 것으로 확인되었으나 약 1~100 chi/ml의 농도에서 mycoplasma 검출이 가능함을 확인하였다(Fig. 4).
- hyopneumoniae, 돼지의 호흡기계에 흔하게 존재하며, 비병원성인M. flocurlare, 닭에서 만성 호흡기성 질병을 야기하는 M. gallisepticwn과 닭에서 호흡기 질병 및 관절염을 야기하는 M. synoviae을 대상으로 universal primers의 검출특이성을 조사한 바 사용균주 모두에서 특이증폭산물을 확인되어 광범위한 mycoplasma를 검출하기 위해 충분히 사용가능할 것으로 판단되었다. 또한, 기존 연구보고에서 적용한 적이 없는 조류유래의 M.
- gallisepticum의 성장곡선을 근거하여 동물용 생 바이러스 백신에M. gallisepticum 배양액을 첨가한 후 7일간 배양하여 PCR을 실시한 결과, 1002 (1.6)cfu까지 검출한 것으로 보고하여 본 시험의 mycoplasma 검출 민감도가 다소 떨어지는 것으로 나타났으나 대 체적으로 기존에 발표된 연구결과들과 비교해 볼 때 비교적 양 호한 성적으로 생각되었다. 이러한 mycoplasma 균종에 따른 PCR 검출기법의 민감도가 상이하게 나타나는 이유로는 표준검사 법으로 사용하는 cfu/ml 산정방법이 균 증식에 시용한 배지의 종 류-, 배양 조건, 균의 증식단계 및 균의 생존 유무 등에 따라 민 감도가 다르게 나타날 수 있을 것으로 추정된다.
- 그리고 T사 킷트를 사용한 경우A. kMawii를 제외한 모든 mycoplasma를 검줄할 수 있었으며, 증폭산물의 크기는 균종에 따라 M. omle는 423 bp, M. kyopneitinoniae는 681 bp, M. hyorhiniser 448 bp, 양성대조군은 810 bp 산물이 관찰되었다. 또한, 제조사의 사용설명서에 언급되 지 않은 균주에 대한 검출능을 조사-한바 M.
- 동물용 생 바이러스 백신인 돼지 전염성 위장염 및 로타 바이 러스 생 혼합 건조백신과 개 파보바이러스 생 건조백신에 대하여 PCR 기법의 적용가능성 및 그 민감도를 확인하기 위하여, A laidlawii의 배양액을 각각의 백신에 접종하여 10진 희석한 후 20시간 배양한 결과, 배양균의 최종농도는 106'1 (1.3 X 106)cfu/ml 로 확인되었고, PCR 기법의 검출한계는 돼지 전염성 위장염 및 로타 바이러스생 혼합 건조백신의 경우 1011 (1.3X lO'Wml, 개 파보바이러스 생 건조백신의 경우 1021 (1.3X 102)cfu/ml로 조사되어, 동물용 생 백신내의 mycoplasma 오염 검출한계는 약 10-100 cfWml로 균 배양액에 대한 검출한계와 유사한 민감도가 확인되었다(Fig. 5).
- synoviae을 대상으로 universal primers의 검출특이성을 조사한 바 사용균주 모두에서 특이증폭산물을 확인되어 광범위한 mycoplasma를 검출하기 위해 충분히 사용가능할 것으로 판단되었다. 또한, 기존 연구보고에서 적용한 적이 없는 조류유래의 M. iowae 및 M. gallinaceume- 국내분리주인 M. synoviae 7주에 대하여 PCR 기법을 적용한 결과, 시험균주 모두에서 특이증폭산물 을 확인할 수 있어, 조류 병성감정 시료, 시육환경, 조류 백신 등에서 mycoplasma 감염 또는 오염유무를 1차적으로 확인 가능 함을 알 수 있었다. Mycoplasma 종에 따라 염기서열 및 그 크 기에 차이가 있는 것으로 알려진 16S~23S rRNA spacer 부위를 증폭시켜 각각의 균종에 따라 다양한 크기의 증폭산물이 검출되 게 하여 각각의 mycoplasma 균주를 PCR 증폭산물의 크기로 동 정할 수 있도록 제작한 T사의 킷트를 사용하여 8주의 mycoplasma 표준주 및 백신주를 검사하였을 때, 제조사의 시용 설명서에 언급되지 않은 A.
- 1). 반면에 시판 검출킷트인 R사의 킷트를 시용 하여 검출 유효성 조사를 실시한 결과 음성대조군, M. synoviae 및 M. floculare를 제외한 모든 mycoplasma에 대하여 약 550 bp의 특이 band가 관찰되었다. 그리고 T사 킷트를 사용한 경우A.
- pseudodiphteriticum 에서 430-464 bp의 증폭산물이 확인되어, 교차반응성이 있음을 보고하고 있다. 본 연구에서는 그람양성 인 Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Staphylococcus epidermis (ATCC 12228), Streptococcus gallolyticus (ATCC 9809), Clostridium difficile (ATCC 9689)과 그람음성균인 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), 효모균인 Candida albicans (ATCC 90028)를 주가로 공시하여 시험한 결과, E. faecalis, B. subtilis,S. epidermis, C.
- 본 연구의 결과를 통하여 종합하여 볼 때 universal primers를 이용한 PCR 기법은 광범위한 mycoplasma 검출능 및 높은 민감 도를 나타내어 동물용 생 바이러스백신내 mycoplasma 오염유무 를 신속 . 정확하게 검출할 수 있는 1차 스크리닝 기법으로 활용 가능할 것으로 판단되었다.
- 본 연구의 결과를 통하여 종합하여 볼 때 universal primers를 이용한 PCR 기법은 광범위한 mycoplasma 검출능 및 높은 민감 도를 나타내어 동물용 생 바이러스백신내 mycoplasma 오염유무 를 신속 . 정확하게 검출할 수 있는 1차 스크리닝 기법으로 활용 가능할 것으로 판단되었다.
- aureus 등 일반세균 8주에 대하여 universal primers와 시판 검출 킷트인 T사 및 R사의 검출특이성 을 비교 . 조사한 결과, 사용한 모든 PCR 기법에서 양성 대조균 인 M. 이ole를 제외하고 공시한 일반세균들에 대해서는 DNA증 폭산물이 관찰되지 않아 각각의 PCR 검출기법의 특이성이 인정 되었다(Fig. 3).
후속연구
- difficile에서 400-500 bp사이의 다양한 크기의 PCR 증폭산물들이 관찰되어 교차반응성이 일부 있음이 확인되어 Eldering 등(7)의 성적과 유사함을 알 수 있었다(data not shown). 그러나, 현행 동물용백신의 국가검정기준에서 모든 생 바이러스 백신은 mycoplasma 배양을 위한 특수배지가 아닌 일반세균배 양 용 배지를 이용한 무균(세균)시험을 실시하므로 균의 증식에 의한 배지의 탁도 및 균동정 시험 등의 방법으로 PCR에서 비특이 적으로 검출되는 그람양성균에 대한 교차반응성을 배제할 수 있을 것으로 생각되며, 추가로 PCR 증폭산물에 대한 염기서열 분석을 병행하여 실시한다면 쉽게 균종을 동정할 수 있어 특이성 에 대한 문제점이 개선되리라 생각된다.
- 이러한 mycoplasma 균종에 따른 PCR 검출기법의 민감도가 상이하게 나타나는 이유로는 표준검사 법으로 사용하는 cfu/ml 산정방법이 균 증식에 시용한 배지의 종 류-, 배양 조건, 균의 증식단계 및 균의 생존 유무 등에 따라 민 감도가 다르게 나타날 수 있을 것으로 추정된다. 그리고 1개월 이상의 많은 시간이 요구되는 직접배양법에 시용되는 베양액을 배양시간대 별로 시료를 채취하여 PCR 기법과 병행한다면 보다 민감하고 정확하게 mycoplasma의 오염유무를 검사할 수 있을 것으로 사료된다.
- flocculare에 대해서는 증폭산물을 확인할 수 없었다. 한편, 본 실험에서는 PCR 기법에 의한 mycoplasma 검 출특이성 조사에 중점을 두어 시험을 수행하였기 때문에 PCR에서 검출되지 않은 2주의 mycoplasma가 효소면역법 (ELISA)에서 추가 검출될 가능성은 조사하지 못하였으므로, 킷트 내 primers 의 검출특이성 문제로 단정지울 수 없어 앞으로' 다양한 mycoplasma 균주에 대하여 상기 킷트의 효소항체법에 의한 분석 및 PCR 증폭산물의 염기서열 분석에 대한 조사가 병행되어야 할 것으로 사료된다.
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