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문제 정의
- 살아있는 대장균에 lux AB 발광 유전자를 재조합하여 바이오센서로 사용하려는 시도는 최근 여러 연구자들에 의해 시도되고 있으며 유해물질로 인한 스트레스나 독성평가를 위해 사용되고 있다. 그러므로 본 연구에서는 급성 독성평가시 발광세균이 외부 기질을 요구치 않도록 lux CDABE operon을 재조합한 발광대장균(DH5α/pSB311)을 제작하였고 이를 해양성 발광세균인 Vibrio fischeii를 사용하는 LumisTox 법을 비교하여 중금속 급성독성에 대한 평가를 수행하였다.
제안 방법
- Table 2는 DH5α/pSB311 와 LumisTox 미생물의 ECso 값들을 Cu2+, Cd2+, Hg2+, Zn2+, Pb2+에 대해서 비교하였으며 최근 유사 연구자들의 중금속 독성을 재조합 발광세균과 Micro- Tox를 이용하여 실험한 선행연구결과를 비교한 것이다. 상기 기술한 바와 같이 유효농도는 발광박테리아의 발광량이 50%로 감소하였을 때 해당 물질의 유효농도로서 일반적인 생물검정의 독성을 대표하는 값이다.
- 중금속시료는 2차 증류수를 이용하여 9가지 희석배수로 준비하여 duplicates. 독성 실험을 수행하여 effective concentration (EGo)을 각 시료 공히 조사하였으며 실험한 사용한 중금속의 종류는 CuSQ(, CdCl2, HgCl2, ZnSCU를 증류수에 용해시켜 stock용액을 만들고 실험시 희석하여 사용하였다. 재조합 대장균인 E.
- coli는 호기적 조건하에서 37℃, 180 rpm의 교반배양기에서 배양하였다. 독성실험에 사용할 발광미생물의 농도를 일정하게 유지하기 위해서 세균시료 I mL를 cuvette 에 취한 후 UV-VIS spectrophotometer# 이용하여 660 nm 에서 측정 후 사용하였다.
- 4은 Cd2+에 대한 DH5α/pSB311과 LumisTox를 이용한 독성평가 결과이다. 독성평가는 중금속 용액을 투여 후 30분간 정치한 후 발광량 감소를 평가하였다. Cd2+의 농도는 2 mg/L에서 25 mg/L까지 9가지 CcF농도에 대한 독성을 발광량의 감소를 통해 평가한 것이다.
- 관찰시간은 30분으로 하였으며 이때 측정한 빛의 감소는 독성의 측정을 정량적으로 할 수 있게 한다. 발광미생물을 이용하여 독성을 측정할 때 발광미생물은 시간이 지남에 따라 발광량이 자연적으로 감소하므로 이에 대한 보정계수를 고려하여 EC50을 산정하였다.
- 독성 실험을 수행하여 effective concentration (EGo)을 각 시료 공히 조사하였으며 실험한 사용한 중금속의 종류는 CuSQ(, CdCl2, HgCl2, ZnSCU를 증류수에 용해시켜 stock용액을 만들고 실험시 희석하여 사용하였다. 재조합 대장균인 E. coli DH5α/pSB311는 12시간 배양하여 이것을 접종원으로 하여 4시간 배양한 배양액과 활성화된 LumisTox를 15℃ 와 실온(25 ℃)에서 중금속에 30분간 노출 후 발광량의 감소율을 측정하였다.
- 재조합된 대장균 3%를 접종한 후 적정시간이 지난 균주를 생리 식염수에 10, 100배 희석한 후 발광량 측정용cuve-tte에 1 mL을 취하여 Luminometer(Berthold Lumate LB 9501)로 측정하였다. 모든 시료는 상온에서 측정하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 균주의 배양에는 LB 배지(Luria-Bertani; trytone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, sodium chloride 5 g/L)를 사용하였으며 항생제 내성균주의 배양을 위해 AmpiciHine을 첨가하였고, E. coli는 호기적 조건하에서 37℃, 180 rpm의 교반배양기에서 배양하였다. 독성실험에 사용할 발광미생물의 농도를 일정하게 유지하기 위해서 세균시료 I mL를 cuvette 에 취한 후 UV-VIS spectrophotometer# 이용하여 660 nm 에서 측정 후 사용하였다.
성능/효과
- 4 X 107 RLU로 나타났다. 특히 상온조건에서는 DH5α/pSB311는 1" RLU이상의 발광량을 나타낸 것에 비해 LumisTox는 시간이 지남에 따라 발광이 감소하여 4시간 후 발광량이 5 X 103 RLU로 감소하였다. 발광유전자인 Lux CDABE> 일반 대장균에 재조합 한 발광미생물 DH5α/pSB311는 중금속 급성독성에 민감하게 반응을 나타내었고 대부분 LumisTox보다 민감한 특성을 보여주었다.
- 2는 15℃와 상온(25℃)에서 재조합 발광 대장균인 DH5α/pSB3ll과 LumisTox의 발광특성을 비교한 것이다. 15℃에서는 DH5α/pSB311 가 LumisTox보다 발광량 감소가 크게 나타났으나 25℃에서는 DH5α/pSB311는 106 RLU의 발광량을 나타내었으나 LumisTox는 시간이 지남에 따라 발광이 감소하여 4시간 후 발광량이 5xl03 RLU로 감소하는 특성을 나타냈으며 이는 재조합 발광 대장균인 DH5α/pSB311의 발광특성은 온도변화에 큰 영향을 받지 않는 것에 비해 LumisTox는 15 ℃ 와 25 ℃ 조건에서 발광특성이 최소 6배(2시간 노출)에서 최대 60배(4시간 노출)까지 변화하였다. 일반적 반응속도론에 의하면 온도에 따른 반응속도의 변화는 Vant hoff arrhenius식을 따른다.
- 1) 현존하는 급성독성 평가법은 호흡율 측정, 현미경 관찰, 화학적 분석 그리고 발광량 측정 법등이 있다.2)가장 이상적인 급성 독성 평가법은 경제적이고 측정이 쉽고 검출능이 높아야 하는 특성을 모두 만족시키는 방법이어야 한다.
- coli나 Bacillus균의 생합성 저해등과 같은 미생물 시험법들이 있다.3) 물고기나 무척추 수생생물을 이용한 독성측정방법은 대상 개체들을 균일한 활성을 유지하도록 배양하는 것이 번거롭고 개체수의 한계로 인한 시험결과의 재현성이 상대적으로 떨어지는 단점이 있다.4,5) 그러나 발광 미생물이나 세포내 효소를 이용한 급성독성측정방법은 시험과정이 간편하고 비용이 절감되고 많은 개체를 대상으로 평가하므로 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다.
- 3) 물고기나 무척추 수생생물을 이용한 독성측정방법은 대상 개체들을 균일한 활성을 유지하도록 배양하는 것이 번거롭고 개체수의 한계로 인한 시험결과의 재현성이 상대적으로 떨어지는 단점이 있다.4,5) 그러나 발광 미생물이나 세포내 효소를 이용한 급성독성측정방법은 시험과정이 간편하고 비용이 절감되고 많은 개체를 대상으로 평가하므로 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다.
- MicroTox를 이용한 ECso값은 연구자들의 결과에 따라 다소 넓은 범위의 값들을 나타내고 있다. Hg2+을 제외하고 MicroTox를 이용한 EC50값의 최대치는 본 실험에서 사용된 DH5α/ pS311과 LumisTox보다 높은 값들을 나타내고 있으며 유사 재조합 발광미생물인 BW322/pCSS108인 경우도 해양성 발광미생물인 LumisTox나 MicroTox보다 민감한 독성을 나타내고 있다. 이는 일반적으로 고농도 NaCl 용액에서는 중금속과 염이 안정성있는 화합물을 형성하여 독성을 경감하는 경향이 있다.
- LumisTox와 같은 해양성 발광세균의 온도에 따른 절대 발광량 및 온도 변화에 따른 발광량의 안정성 두 가지 모두 재조합 발광세균이 우수한 것으로 나타내었다.
- 급성독성에 사용된 중금속의 독성의 크기는 재조합 발광 미생물과 LumisTox가 비슷한 경향을 나타내었으며 재조합 발광미생물은 Hg2*>Cu*>Zn2*>Cd2*의 순이고 LumisTox는 Hg2+>Cu2+>Cd2*>Zn*순으로 나타났다. 재조합 발광미생물이 가지고 있는 다른 특성은 발광유전자의 재조합 기 술을 계속 향상시킬 수 있기 때문에 현재의 검출한계나 단점들이 계속 개선될 수 있다는 점이다.
- 이는 일반적으로 고농도 NaCl 용액에서는 중금속과 염이 안정성있는 화합물을 형성하여 독성을 경감하는 경향이 있다. 따라서 2.5% NaCl 조건에서 실험을 수행해야하는 LumisTox나 MicroTox는 실제 중금속 독성보다 작게 표현될 가능성이 크다.
- 특히 상온조건에서는 DH5α/pSB311는 1" RLU이상의 발광량을 나타낸 것에 비해 LumisTox는 시간이 지남에 따라 발광이 감소하여 4시간 후 발광량이 5 X 103 RLU로 감소하였다. 발광유전자인 Lux CDABE> 일반 대장균에 재조합 한 발광미생물 DH5α/pSB311는 중금속 급성독성에 민감하게 반응을 나타내었고 대부분 LumisTox보다 민감한 특성을 보여주었다. 본 실험에서 사용된 재조합 발광미생물은 초기형태의 재조합 발광미생물이나 LumisTox에서 사용되는 발광미생물과 같이 고가의 기질이나 고염조건이 없이 사용할 수 있었고 배양도 LB와.
- +과 Cu*는 낮은 EC5o 값을 나타내어 Cd?* 이나 Zr?+에 비해 생물독성이 강함을 나타내고 있다. 본 연구에서 측정한 중금속들의 생물독성의 크기는 Hg2+ > Cu2+ > Cd2+ > Zn"순으로 나타났고 Vibrio fisheri 를 사용한 LumisTox의 경우 Zn+2보다 Cd2+의 독성이 조금 높게 나타났으나 의미 있는 수준은 아니라고 판단된다. 선행 연구결과들과 비교해보면 Cho et al.
- 재조합 발광미생물의 발광량은 5.4 X 107 RLU로 나타났다. 특히 상온조건에서는 DH5α/pSB311는 1" RLU이상의 발광량을 나타낸 것에 비해 LumisTox는 시간이 지남에 따라 발광이 감소하여 4시간 후 발광량이 5 X 103 RLU로 감소하였다.
- 실험에 사용된 대장균의 농도는 660 nm에서 흡광도로 측정하였고 최대한 동일한 농도에서 발광량을 측정하였다. 측정결과 재조합 대장균의 발광량은 5.4 X IO, RUL로 나타났고 발광반응이 나타나지 않는 일반대장균인 DH5α는 background RLU를 나타내었다.
후속연구
- 온도변화가 발광미생물의 발광량 변화에 미치는 영향은 화학반응식에 기초로 하여 만들어진 arrhenius 식으로는 정량적인 발광량 변화를 설명하기 어려웠다. 그러므로 추후 발광량을 이용하기 위해 다른 종류의 세균이나 유전자 도입시 해당 경우의 온도 영향이 충분히 검토되어야 할 것이다.
- 중금속의 생물독성은 독성 시험에 사용된 대상 시험체의 종류(무척추 동물, 조류, 해양성 발광세균, 재조합 발광세균 등), 독성 실험의 조건(pH, 온도, 시험생체의 생리적 활성도 등)에 따라 독성도가 달라질 수 있기 때문에 대표성을 가지는 EGo값을 정하기에 어려움이 많다. 더욱이 인간을 대체하여 중금속의 독성을 평가하는 이러한 대체 생물과 인간이 가지는 독성 수용정도가 다르다는 점까지 고려한다면 대체 생물과 인간 사이에는 많은 괴리가 존재하며 이러한 괴리를 극복하기 위해서는 독성평가기법 에 있어서 유용한 생물체를 개발하는 것과 아울러 평가 방법과 결과의 해석기법에 대해서도 심도 있는 연구가 동반되어야 할 것이다.
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