[논문]카드뮴 및 납 검출을 위한 재조합 미생물 바이오센서

신혜자

doi:10.5352/jls.2016.26.5.503

카드뮴 및 납 검출을 위한 재조합 미생물 바이오센서
A Recombinant Microbial Biosensor for Cadmium and Lead Detection 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.26 no.5 = no.193, 2016년, pp.503 - 508

초록
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바이오센서는 간단하고 저렴하게 일차적으로 현장 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서는 유전자 재조합으로 카드뮴을 검출할 수 있는 미생물 유래 바이오센서를 제작하였다. 이를 위해 카드뮴과 반응하는 CadC 유전자와 관련 프로모터를 PCR로 증폭하고 β-galactosidase 유전자(lacZ)와 결합하고 E. coli BL21 (DE3)에 형질 전환하였다. 이 바이오센서 세포는 카드뮴 존재 하에서 β-galactosidase를 발현하며 기질인 CPRG을 분해하여 붉은색으로 발색된다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 카드뮴으로 3시간 유도하였을 때 β-galactosidase 활성의 최고값을 보여주었으며 pH 5에서 가장 좋은 활성도를 나타내었다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 0.01 μM에서 10 mM 카드뮴에서 검출범위를 보여주었으며 0.01~10 μM에서 직선관계의 검정선(y= 0.98 X + 0.142, R²=0.98)를 나타내었다. 중금속 중에서 카드뮴과 납에서 높은 반응성을 보여주었으며 수은과 구리에서는 전혀 반응하지 않았으나 주석과 코발트에서도 약간의 반응성을 나타내었다. 카드뮴을 spike 한 폐수에서의 반응이 완충용액에 spike한 것(control)과 비슷하게 나타났다. 이는 카드뮴 검출용 바이오센서가 전처리를 하지 않은 현장시료에서도 반응성을 보여주어 현장시료의 간단하고 저렴한 일차적 검출에 활용될 수 있음을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Biosensors have been used as first-step monitoring tools to detect on-site samples in a simple and cost-effective manner. Numerous recombinant microbial biosensors have been exploited for monitoring on-site toxic chemicals and biological signals. Herein, a recombinant microbial biosensor was constructed for monitoring cadmium. The cadmium responding cadC regulatory gene and it’s promoter from Staphylococcus aureus was amplified through PCR, fused with the lacZ gene, and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells. In the presence of cadmium, the biosensor cells express β-galactosidase showing red color development with chlorophenol red β-galactopyranoside (CPRG) as the enzymatic substrate. The biosensor cells showed the best β-galactosidase activity after 3 hr induction with cadmium at pH 5 and a detection range from 0.01 μM to 10 mM cadmium with a linearity from 0.01 to 0.1 μM cadmium (y = 0.98 x + 0.142, R2 = 0.98). Among the heavy metals, cadmium and lead showed good responses, tin and cobalt showed medium responses, and mercury and copper showed no responses. The biosensor cells showed good responses to several waste waters similar to buffer solution, all spiked with cadmium. The biosensor described herein could be applied for on-site cadmium monitoring in a simple and cost-effective manner without sample pretreatments.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

01 uM 에서 10 mM까지 되도록 바이오센서 세포에 넣고 3시간 유도한 후 B-galactosidase의 활성을 OD₅₇₀ nm에서 측정하였다. 또한 카드뮴 검출용 바이오센서의 특이성은 바이오센서가 다른 금속에 반응을 보이는 지를 통해 조사하였다. 최종 농도가 1 uM이 되도록 CdCl₂, PbCl₂, HgCl₂, SnCl₂, CoCl₂, CuCl2를같은 양의 세포에 넣고 3시간 유도 후 B-galactosidase의 활성을 조사하였다.
본 연구에서는 재조합 미생물 바이오센서를 활용하여 간단하고 저렴하게 카드뮴을 모니터링 하였다. 중금속 카드뮴 조절 유전자, cadC을 리포터 유전자 lacZ와 결합하여 미생물 바이오센서 플라즈미드를 만들고 이를 대장균에 형질 전환하여 카드뮴 검출용 바이오센서를 제작하고 최적 조건과 여러 시료 중 카드뮴의 검출 가능성을 조사하였다.
CadC 단백질은 항상 소량으로 생합성 되고 관련 프로모터에 결합하여 RNA 전사를 방해하는 음성 조절인자이나 카드뮴이 존재할 때는 CadC 단백질이 카드뮴과 결합하여 프로모터에서 떨어져 나와 RNA 전사가 일어나도록 조절한다고 알려져 있다[20, 24]. 본 연구에서는 프로모터 자리 바로 다음에 lacZ 유전자를 도입하여 전사가 일어날 때에 B-galactosidase가 발현되도록 하였다.

제안 방법

B-galactosidase 기질로 chlorophenol red-B-D-galactopyr-anoside (CPRG)를 선택하여 기질의 분해를 노란색에서 붉은색으로 변색됨으로 확연히 구별되도록 하였다. 바이오센서 세포를 96 multiwells에 넣고 카드뮴이 있는(현장)시료를 첨가하고 3시간 유도한 후에 원심분리로 세포를 모아 5% Triton X-100 (in 50 mM phosphate buffer, pH 7)를 넣어 lysis하였다.
따라서 모든 실험의 유도시간을 3시간으로 하였다. Control 실험으로 expression vector을 갖지 않는 E. coli BL21 (DE3)을 똑같이 처리하여 5시간까지 관찰하였으며 바이오센서 세포와 같은 반응을 보여 주지 않았다. Fig.
바이오센서 세포를 96 multiwells에 넣고 카드뮴이 있는(현장)시료를 첨가하고 3시간 유도한 후에 원심분리로 세포를 모아 5% Triton X-100 (in 50 mM phosphate buffer, pH 7)를 넣어 lysis하였다. Lysis한 세포에 CPRG을 넣고 1시간 정도 incubate한 후 Elisa plate reader (Versa Max, VA)을 사용하여 570 nm에서 CPRG 분해를 흡광도로 정량적으로 측정하여 분석하였다[4].
각 폐수처리장에서 수집하여 온 페수는 0.2 mm 크기의 막을 통해 여과를 하거나 여과 없이 카드뮴(최종농도 1 uM)을 spike하고 바이오센서 세포가 있는 wells에 넣고 3시간 후 B-galactosidase의 활성을 조사하고 같은 조건에서 카드뮴으로 spike한 완충용액 결과와 비교 검토하였다.
4B). 납에 대한 바이오센서 세포의 활성은 카드뮴에서와 같이 0.01 uM에서 10 mM까지 납 농도범위에서 바이오센서 세포를 3시간 유도한 후 B-galactosidase의 활성을 OD₅₇₀ nm에서 측정하였다. 납 농도 1 uM에서 최고 활성을 보여주었으며 그 이후로 점차감소되었으며 0.
유도물질인 카드뮴은 금속의 특징으로 산성에서 잘 용해되나 염기성 용액에서는 침전이 생길 수 있으므로 pH 에 따른 B-galactosidase의 활성을 조사할 필요가 있다. 다양한 pH의 완충용액에서 카드뮴을 유도시켰을 때 B-galactosidase 의 활성에 어떤 영향을 미치는 지 조사하였다(Fig. 2C). 이전연구와 비슷하게[16] 카드뮴 검출용 바이오센서는 pH 5에서 가장 좋은 B-galactosidase 활성을 보여주었으며 그 다음 pH 7에서도 상당히 좋은 활성을 보여주었다(Fig.
유도 발현되는 B-galactosidase의 양은 세포의 양에 비례되므로 주어진 실험조건에서 최적의 세포량을 조사하였다. 다양한 세포량(10~60 ul)을 OD₆₀₀ nm에서 흡광도로 세포의 밀도를 측정하고 동시에 같은 양의 세포로 B-galactosidase의 활성을 측정하였다. Fig.
5). 다양한 현장 공장폐수와 완충용액에 최종 1 uM 카드뮴을 spike하고 바이오센서 세포로 B-galactosidase 활성을 측정하여 비교 검토하였다. 다양한 현장 폐수에서 측정한 B-galactosidase 값이 실험실 완충용액에서의 값과 거의 비슷하거나(B, C, D, F) 또는 낮게(A) 혹은 높게(E) 나타나 이전 연구와 비슷한 결과를 보여 주었다[13, 21].
2C). 따라서 바이오센서 미생물을 키울 때는 대장균의 적정 pH 7 배지에서 하룻밤 키운 후 pH 5 조건에서 카드뮴 유도를 실시하였다.
마지막으로 실험실 시료에 반응하는 카드뮴 검출용 바이오센서가 현장 폐수 속 카드뮴도 검출하는 지 조사하였다(Fig. 5). 다양한 현장 공장폐수와 완충용액에 최종 1 uM 카드뮴을 spike하고 바이오센서 세포로 B-galactosidase 활성을 측정하여 비교 검토하였다.
카드뮴 검출용 바이오센서의 최적 조건을 조사하기 위하여 다양한 조건에서 바이오센서의 B-galactosidase의 활성을 측정하였다. 먼저 카드뮴이 세포로 들어가서 얼마나 빠르게 B-galactosidase를 활성화시키는 지 조사하였다(Fig. 2A). 정해진 세포의 양에 같은 양의 카드뮴(최종농도 1 uM CdCl₂)을 시간 별로 처리한 후 세포를 5% Triton x-100 (in 0.
바이오센서 plasmid (pLZCadC) 제작을 위해 미국 NCBI gene bank를 검색하고 cadC regulatory 유전자와 관련 promoter 유전자를 Staphylococcus aureus 염색체 유전자로부터 다음과 같은 primers을 사용하여 94C 1분, 57C 3분, 72C 3분에서 25 cycles로 PCR 증폭하고 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인하였다: forward 5'-GAA GCG GGT ACC TTG ACT ATT TGT TTA TAG (Kpn자리 포함), reverse 5'-GAA GCG GCT AGC CTA TCC AAT ACT AGC AAC (Nhe 자리 포함). 증폭된 cadC 유전자를 TA cloning vector에 넣고 blue colony를 선별하고 전기영동으로 확인한 후 Kpn과 Nhe으로 자르고 gel-isolation 하였다.
바이오센서 세포의 민감도는 카드뮴 최종 농도가 0.01 uM 에서 10 mM까지 되도록 바이오센서 세포에 넣고 3시간 유도한 후 B-galactosidase의 활성을 OD₅₇₀ nm에서 측정하였다. 또한 카드뮴 검출용 바이오센서의 특이성은 바이오센서가 다른 금속에 반응을 보이는 지를 통해 조사하였다.
실험 조건의 최적화를 결정하기 위해 다양한 세포량(10~60 ul), induction 시간(1~5 hr), 및 pH (pH 4&5은 50 mM acetate buffer, pH 6&7은 50 mM Bis-Tris buffer, pH 8~10은 50 mM bicine buffer를 사용) 등의 실험 조건에서 바이오센서 세포의 B-galactosidase activity를 측정하였다.
2B). 유도 발현되는 B-galactosidase의 양은 세포의 양에 비례되므로 주어진 실험조건에서 최적의 세포량을 조사하였다. 다양한 세포량(10~60 ul)을 OD₆₀₀ nm에서 흡광도로 세포의 밀도를 측정하고 동시에 같은 양의 세포로 B-galactosidase의 활성을 측정하였다.
요인이다. 이 요인을 조사하기 위해 다양한 카드뮴 농도에 따른 바이오센서의 활성도를 측정하였다(Fig. 3). 카드뮴 최종 농도를 0.
증폭된 cadC 유전자를 TA cloning vector에 넣고 blue colony를 선별하고 전기영동으로 확인한 후 Kpn과 Nhe으로 자르고 gel-isolation 하였다. 잘린 cadC 유전자를 같은 제한 효소로 자른 pLZCapR [13]의 backbone과 ligation한 후 이 플라즈미드(pLZCadC)를 E. coli DH₅a에 transform하고 colony PCR로 확인/선별한 후 선별된 colony의 miniprep plasmids을 다시 E. coli BL21 (DE3)에 형질 전환하여 바이오센서 세포로 활용하였다. 염색체 DNA는 NucleoSpin Microbial DNA 정제 kit (Macherey-Nagel, Germany)로 플라즈미드 DNA는 Qiagen spin column kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 정제하였으며 Cloning과 ligatione 표준 방법[19]을 이용하여 수행하였고 plasmid pLZCadCe CaCl₂방법으로 E.
2A). 정해진 세포의 양에 같은 양의 카드뮴(최종농도 1 uM CdCl₂)을 시간 별로 처리한 후 세포를 5% Triton x-100 (in 0.1 M phosphate buffer, pH 7)으로 lysis 하고 CPRG을 기질로 B-galactosidase의 활성을 측정하였다. B-galactosidase의 활성은 3시간까지 증가하다가 3시간에서 최고 활성을 나타낸 후 감소하였다(Fig.
저렴하게 카드뮴을 모니터링 하였다. 중금속 카드뮴 조절 유전자, cadC을 리포터 유전자 lacZ와 결합하여 미생물 바이오센서 플라즈미드를 만들고 이를 대장균에 형질 전환하여 카드뮴 검출용 바이오센서를 제작하고 최적 조건과 여러 시료 중 카드뮴의 검출 가능성을 조사하였다.
증폭된 cadC 유전자를 TA cloning vector에 넣고 blue colony를 선별하고 전기영동으로 확인한 후 Kpn과 Nhe으로 자르고 gel-isolation 하였다. 잘린 cadC 유전자를 같은 제한 효소로 자른 pLZCapR [13]의 backbone과 ligation한 후 이 플라즈미드(pLZCadC)를 E.
또한 카드뮴 검출용 바이오센서의 특이성은 바이오센서가 다른 금속에 반응을 보이는 지를 통해 조사하였다. 최종 농도가 1 uM이 되도록 CdCl₂, PbCl₂, HgCl₂, SnCl₂, CoCl₂, CuCl2를같은 양의 세포에 넣고 3시간 유도 후 B-galactosidase의 활성을 조사하였다.
또한 카드뮴 검출용 바이오센서의 특이성은 바이오센서가 다른 금속에 반응을 보이는 지를 통해 조사하였다. 최종 농도가 1 uM이 되도록 CdCl₂, PbCl₂, HgCl₂, SnCl₂, CoCl₂, CuCl2를같은 양의 세포에 넣고 3시간 유도 후 B-galactosidase의 활성을 조사하였다.
카드뮴 검출용 바이오센서 플라스미드를 제작하기 위해 Staphylococcus aureus로부터 카드뮴에 반응하는 유전자 cadC 와 프로모터 유전자를 PCR로 증폭하고 lacZ 유전자와 결합하여 플라스미드, pLZCadC를 제작한 후 E. coli BL21 (DE3) 에형질 전환 하였다(Fig. 1). CadC 단백질은 항상 소량으로 생합성 되고 관련 프로모터에 결합하여 RNA 전사를 방해하는 음성 조절인자이나 카드뮴이 존재할 때는 CadC 단백질이 카드뮴과 결합하여 프로모터에서 떨어져 나와 RNA 전사가 일어나도록 조절한다고 알려져 있다[20, 24].
그러므로, 카드뮴 바이오센서는 미생물 세포의 생리적 상태와 세포의 생존에 영향을 미치는 다양한 실험 변수들에 의해 영향을 받을 수 있다[10, 15]. 카드뮴 검출용 바이오센서의 최적 조건을 조사하기 위하여 다양한 조건에서 바이오센서의 B-galactosidase의 활성을 측정하였다. 먼저 카드뮴이 세포로 들어가서 얼마나 빠르게 B-galactosidase를 활성화시키는 지 조사하였다(Fig.

대상 데이터

본 연구에서 사용한 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며 대부분 Sig ma-Aldrich에서 주문하여 정제 없이 사용하였다.

이론/모형

coli BL21 (DE3)에 형질 전환하여 바이오센서 세포로 활용하였다. 염색체 DNA는 NucleoSpin Microbial DNA 정제 kit (Macherey-Nagel, Germany)로 플라즈미드 DNA는 Qiagen spin column kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 정제하였으며 Cloning과 ligatione 표준 방법[19]을 이용하여 수행하였고 plasmid pLZCadCe CaCl₂방법으로 E. coli DH₅a와 BL21 (DE3)에 형질 전환하였다.

성능/효과

01 mM에서 최고 활성을 보여주었으며 그 이후로 점차 감소되었다. 검정선 (regression curve)은 0.01~10 uM에서 직선관계(y= 0.98X - 0.142, R²=0.98)를 보여주어 같은 세포를 사용하여 측정하는 미지시료의 표준 검정선으로 사용 가능함을 시사하였다. 이 결과는 다른 논문과 비슷한 검출 범위(0.
본 바이오센서는 카드뮴 이외의 다른 중금속도 검출 가능하므로 폐수에서의 중금속에 대한더 자세한 농도와 구성을 결정하기 위해 추후 기기적 분석이필요할 것이다. 결론적으로, 이 결과들은 pLZCadC을 함유하는 E. coli 바이오센서 세포가 간편하게 전처리 없이 현장의 오염된 토양과 폐수 중 카드뮴과 납의 일차적 검출에 사용될수 있음을 검증하였다.
바이오센서 결과는 오염물질의 농도뿐만 아니라 세포에 미치는 오염물질의 독성까지 나타낸다고 보고되었다[1, 3, 6, 9]. 또한 96-well plate 활용으로 훨씬 간단하고 한꺼번에 96개의 시료를 측정할 수 있는 장점과 적은 시료의 측정으로 인해 환경 및 경제적으로 이득이 될 것으로 사료된다. 본 바이오센서는 카드뮴 이외의 다른 중금속도 검출 가능하므로 폐수에서의 중금속에 대한더 자세한 농도와 구성을 결정하기 위해 추후 기기적 분석이필요할 것이다.
최종농도가 1 uM이 되도록 CdCl₂, PbCl₂, HgCl₂, SnCl₂, CoCl2, CuCl2를 같은 양의 세포에 넣고 3시간 유도 후 B-galactosidase의 활성을 조사하였다. 카드뮴과 납에서 높은 반응성을 보여주었으나 주석과 코발트에서 낮은 수준의 반응을 보여주었고 수은과 구리에서 전혀 반응을 보이지 않았다(Fig. 4A). 이 결과는 납, 아연에서 반응성을 보여준 이전 연구[16, 20]와수은, 구리, 니켈, 망간, 납, 그리고 아연에서도 반응성을 나타낸 이전 연구[24]와 다른 양상을 보여주고 있어 다양한 세포들의 금속에 대한 다양한 반응과 반응 기작를 가지고 있음을시사한다.

후속연구

또한 96-well plate 활용으로 훨씬 간단하고 한꺼번에 96개의 시료를 측정할 수 있는 장점과 적은 시료의 측정으로 인해 환경 및 경제적으로 이득이 될 것으로 사료된다. 본 바이오센서는 카드뮴 이외의 다른 중금속도 검출 가능하므로 폐수에서의 중금속에 대한더 자세한 농도와 구성을 결정하기 위해 추후 기기적 분석이필요할 것이다. 결론적으로, 이 결과들은 pLZCadC을 함유하는 E.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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