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문제 정의
- 고정화 된 HRP 내부의 보결군 활성을 위해 전해질로 사용되어진 인산염 완충용액 (phosphate buffer solution, PBS)의 농도, pH, 외부 산소 주입량 및 공급전압을 변화시켜 전기화학 반응기 내부에서 발생되는 과산화수소 농도 및 이에 대한 전류효율을 고려하여 최적 조건을 결정하였다. 또한 최적 과산화수소 자체 발생조건에서 HRP가 고정화된 RVC 전극을 이용하여 페놀의 분해 특성에 관한 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 페놀의 효과적인 처리를 위해 페놀 처리에 적합하다고 보고되어진 HRP를 고정화 시약(^coupling agent) 인 l-ethyl-3-(3-dimethylamin° propyl) carbodiimide hydrochlo ride (EDC)와 가수분해 저해물질 (hydrolysis-resistant active intermediate) 인 N-hydroxy succinimide(NHS)를 사용하여 다공성 탄소 전극(reticulated vitreous carbon, RVC) 표면에고정화시켜 전기화학반응기에 도입하고자 하였다. 고정화 된 HRP 내부의 보결군 활성을 위해 전해질로 사용되어진 인산염 완충용액 (phosphate buffer solution, PBS)의 농도, pH, 외부 산소 주입량 및 공급전압을 변화시켜 전기화학 반응기 내부에서 발생되는 과산화수소 농도 및 이에 대한 전류효율을 고려하여 최적 조건을 결정하였다.
제안 방법
- Peiia 연구 그룹에서는 6 N 염산을 이용하여 RVC 표면에 tyro- sinase를 고정화시켜 페놀류의 검출을 위한 센서를 보고하였다.'” 또한 K. E. William 연구그룹에서 DNA 인식을 위해 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 에 PNA(peptide nucleic acid) 를 고정화시키기 위해 진한 황산과 질산의 3 : 1 혼합용액을 이용한 방법을 제안하였다”) 두 가지 방법에 의해 처리된 탄소 표면의 카르복실기 생성 여부를 확인하기 위해 4, 000- 400 cm'1 범위에서 KBr pellet을 이용하여 FT/IR(Frourier transform infrared, 460 plus, Jasco, Japan) spectrometer를 측정하였다. 카르복실기는 1, 740〜1, 720 cm'1 범위에서 발견되는데 6 N 염산 용액으로 처리된 RVC의 경우(Fig.
- 0) 전해질인 인산염 완충용액의 농도를 10-200 mM로 변화시켜 가며 자체 발생되는 과산화수소의 농도 및 전류 효율을 측정하여 비교하였고(Fig. 5(a)), 일정 전해질 농도 하에서 pH 조건을 달리하여 과산화수소 발생 및 그에 따르는 전류효율을 측정하였다(Fig. 5(b)).
- 이용하여 페놀의 분해 특성을 조사하였다. 100 mM 고체상의 HRP를 100 mM PBS에 용해시켜 1 mM 페놀을 포함하고 있는 용액에 넣고 일정 시간 후에 UV/VIS spec- trometer(Shimadzu Corp., Japan)을 이용하여 270 run 범위에서 흡광도를 측정하여 페놀의 농도를 결정하였다.
- 연동펌프를 이용하여 양극실의 인산염 완충용액은 순환시켰고 페놀을 포함하고 있는 음극실 용액은 연속 운전 후 방류되었다. 2.4절의 과산화수소 발생실험에서 potentiostat/ galvanostat에 의해 측정된 전압 값을 근거로 하여 전력공급 장치(Power supply, Agilent 6613 C, USA)를 이용하여 반응기의 양 끝단에서 전압을 공급해 주었으며 최적 결정된 PBS 의 농도 및 pH 조건의 전해질을 사용하였다. 페놀의 농도는 UV/VIS spectrometer를 이용하여 270 nm 범위에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
- 위한 가교제로 널리 사용되고 있다. EDC를 이용하여 HRP의 아미노기(-NH2)와 펩티드 결합을 위한 카르복실기 (-COOH) 생성을 위해 지름 3 cm의 RVC를 6 N 염산 용액이나 진한 황산(98%)과 질산(65%)의 3 : 1 혼합용액에 넣고 2시간 동안 초음파 처리 후에 하루 동안 방치하였다.13,14)산성 처리된 RVC를 증류수를 이용하여 수차례 세척 시킨 후에 80°C 오븐에서 하루 정도 건조시켰다.
- 이는 HRP 1, 000 Units을 진한 황산과 질산의 3 : 1 혼합용액에 의해 처리된 RVC에 고정화 했을 때, 단위 부피 당 470 Units, 35% 정도의 효소를 고정화할 수 있음을 나타낸다. Fig. 4에서는 HRP의 투여량에 따른 RVC에 고정화된 HRP의 활성 및 초기 활성에 대한 상대적 효소 활성도(relatively enzymatic activity)를 4주 동안 조사하여 비교하였다. 효소 투여량에 상관없이 초기 5일 동안은 RVC 표면에 고정화된 초기 HRP의 양(Table 1의 세 번째 열)에 대해 10-15% 정도 감소하였다.
- HRP 의 활성은 과산화수소(H2O2) 존재 하에서 HRP와 (2, 21-azino-bis(3-ethyl benzthiazoline-6-sulfbnic acid)(ABTS) 의 반응 산물인 ABTS+ 라디칼을 측정하여 판별한다. 5 wt% ABTS 용액 0.
- HRP의 전기효소법에의 적용 가능성을 보이기 위해 용존 HRP를 이용하여 페놀의 분해 특성을 조사하였다. 100 mM 고체상의 HRP를 100 mM PBS에 용해시켜 1 mM 페놀을 포함하고 있는 용액에 넣고 일정 시간 후에 UV/VIS spec- trometer(Shimadzu Corp.
- 전기화학반응기에 도입하고자 하였다. 고정화 된 HRP 내부의 보결군 활성을 위해 전해질로 사용되어진 인산염 완충용액 (phosphate buffer solution, PBS)의 농도, pH, 외부 산소 주입량 및 공급전압을 변화시켜 전기화학 반응기 내부에서 발생되는 과산화수소 농도 및 이에 대한 전류효율을 고려하여 최적 조건을 결정하였다. 또한 최적 과산화수소 자체 발생조건에서 HRP가 고정화된 RVC 전극을 이용하여 페놀의 분해 특성에 관한 연구를 수행하였다.
- 0 사이에서 큰 변성없이 안정한 상태로 활성을 유지하게 되는데10) pH를 조절하기 위해 인산염 완충 용액(pho sphate buffer solution, PBS)이 전기화학 반응기 내의 전해질로서 사용되었다. 과산화수소(H2O2)의 농도를 결정하기 위해 2, 9-dimethyl-l, 10-phenanthroline(DMP)와 CuSCM의 혼합 용액을 이용하였으며 효소 고정화를 위한 담체로 다공특성 을 갖는 RVC(Duocel ®, ERG Materials and Aerospace Corp., USA, 100 ppi(pores per linear inch), 유효전극면적: 7.07 cm2) 전극을 사용하여 전기화학반응기에 도입하였다 (Fig. 1).
- 양이온교환막(Naflon 450, Aldrich, USA)에 의해 분리된 2-compartment 회분식 전해장치(부피: 150 cn?)의 전극반응을 이용하여 과산화수소의 자체 발생 실험을 실시하였다. 전해 징치 내의 작업 전극(working electrode)은 RVC 전극, 상대 전극(counter electrode)으로는 백금이 도금된 티타늄 판을 기준 전극(reference electrode)으로는 Ag/AgCl 전극을 사용하였다.
- 위 실험은 전해질의 농도(10〜100 mM) 및 pH(5.0~8.0) 등의 내부 조건과 공급되는 일정전위(-0.8〜-0.2 volt, vs. Ag/AgCl) 및 외부 산소 주입량(10〜50 mL/min) 등의 외부조건을 조절하여 1시간 후에 발생한 과산화수소의 농도와 전류효율을 측정하였다.
- 6은 본 연구에서 사용되어진 RVC 전극에서의 자체 과산화수소 발생 특성에 관한 결과를 나타내고 있다. 일정 pH 조건에서(pH 7.0) 전해질인 인산염 완충용액의 농도를 10-200 mM로 변화시켜 가며 자체 발생되는 과산화수소의 농도 및 전류 효율을 측정하여 비교하였고(Fig. 5(a)), 일정 전해질 농도 하에서 pH 조건을 달리하여 과산화수소 발생 및 그에 따르는 전류효율을 측정하였다(Fig.
대상 데이터
- 1에 나타내었다. 양극(Anode)은 티타늄 표면에 백금이 도금된 전극을 사용하였으며 음극(Cathode)은 RVC 전극이나 HRP가 고정화된 RVC 전극을 사용하였다. 양극실(anolyte compartment) 에서생성된 H*을 음극 표면으로 이동시켜 과산화수소의 발생을 촉진하기 위해 수소이온에 대해 선택성이 높은 Nafion 450 (유효 막 면적: 7.
- 양극(Anode)은 티타늄 표면에 백금이 도금된 전극을 사용하였으며 음극(Cathode)은 RVC 전극이나 HRP가 고정화된 RVC 전극을 사용하였다. 양극실(anolyte compartment) 에서생성된 H*을 음극 표면으로 이동시켜 과산화수소의 발생을 촉진하기 위해 수소이온에 대해 선택성이 높은 Nafion 450 (유효 막 면적: 7.07 cm2, Aldrich, USA) 양이온교환막을 사용하였다. 연동펌프를 이용하여 양극실의 인산염 완충용액은 순환시켰고 페놀을 포함하고 있는 음극실 용액은 연속 운전 후 방류되었다.
- 전해 징치 내의 작업 전극(working electrode)은 RVC 전극, 상대 전극(counter electrode)으로는 백금이 도금된 티타늄 판을 기준 전극(reference electrode)으로는 Ag/AgCl 전극을 사용하였다. 과산화수소는 전극의 양단에서 일정한 전위(poten- tiostatic method)를 공급해 줌으로써 양극 표면에서 생성된 H*이 음극으로 이동하여 외부 주입된 산소와 만나 전해 장치 내에서 자체적으로 발생하게 된다.
- 오염물질 분해를 위한 산화 . 환원 효소로 동식물 세포 유래의 효소(HRP, type VI-A, EC 1.11.1.7, Sigma, USA)를 선정하여 페놀(Sigma Aldrich Co.)을 분해하였다. HRP는 pH 6.
이론/모형
- 일정한 전압의 공급과 이때 발생하는 전하량의 기록은 potentiostat/galvanostat (PGSTA 30, Autolab, Netherlands 의해 공급 . 기록되었고, 과산화수소의 농도를 결정하기 위해 DMP 방법을 이용하였다.'' 1 wt% DMP 용액 1 mL, 0.
성능/효과
- 이는 탄소 매질 표면에 생성된 카르복실기와 HRP의 아미노기 사이에 완전한 펩티드 결합을 형성하지 못하고 약한 공유결합 때문에 RVC 표면에서 누출되는 HRP가 존재함을 의미한다. 그러나 5일 후에, 약한 공유결합이 제거되고 RVC 표면과 강한 펩티드 결합을 생성하고 있는 HRP만 남게 되므로 탄소 전극 표면에서 누출되는 HRP의 양은 초기 5일에 비해 감소하게 되며 4주 후의 최종 활성은 초기 고정화된 HRP 활성에 대해 0.85- 0.89의 값을 보이게 되었다.
- 이는 전기화학반응기 내의 전압 증가에 따른 반응기 내에서 자체 생산되는 과산화수소의 양이 증가하여 HRP를 활성화시킴으로 인해 페놀의 분해에 적절하게 사용되었기 때문이다. 또한 공급전압 조건에 상관없이 HRP가 고정화된 RVC 전극을 이용한 전기화학반응기가 RVC 전극만을 사용한 전기화학반응기에 비해 높은 분해효율을 나타내었다. 특히 전기화학반응기 내의 과산화수소 자체 발생량이 가장 많은 40 V 공급 전압 조건에서는 RVC 전극만을 이용한 전기화학반응기가 38.
- 6 volt의 범위에서 가장 높은 전류효율을 보였다. 또한 외부 산소 주입량 20 mL/min 이상 조건에서는 거의 일정한 농도의 과산화수소가 자체 발생되었으며 30 mL/min에서 가장 효과적으로 전류를 이용하고 있었다. 이는 30 mL/min의 외부 산소 주입량에 의해 전해질이 충분히 포화되었으며 과포화조건에서는 약간의 전류효율감소가 나타남을 확인 할 수 있었다.
- 5(b)). 모든 조건에서 연속적으로 과산화수소가 자체 발생하였고 과산화수소의 발생량 및 전류효율을 고려했을 때 과산화수소 발생의 최적 전해질 농도 및 pH 조건은 100 mM, pH 7.0임을 확인 할 수 있었다. 수소이온농도의 변화는 효소 내 반응 사이트의 이온 특성을 변화시켜 활성을 결정지을 뿐 아니라 효소의 3차원 구조를 변화시켜 분해 특성을 변화시킬 수 있는 인자이다.
- 수소이온농도의 변화는 효소 내 반응 사이트의 이온 특성을 변화시켜 활성을 결정지을 뿐 아니라 효소의 3차원 구조를 변화시켜 분해 특성을 변화시킬 수 있는 인자이다. 본 연구에서 사용된 HRP 의 경우 약산성이나 중성 조건에서 최적 활성을 나타내므로22,23) 자체발생 되는 과산화수소의 최적 pH 조건에서 큰 변성(de naturation) 없이 활성을 유지할 것으로 예상되어진다. 또한 외부 실험 조건인 공급 전압(Fig.
- 이는 전기장 하에서 자체 발생된과산화수소에 의해 HRP의 활성이 높아져 페놀의 분해에 촉매로 작용하여 RVC 전극만을 사용한 전기화학반응기에 비해 높은 분해특성을 지니고 있다. 이로써 HRP를 고정화 시킨 다공성 탄소 전극을 도입한 전기화학반응기는 페놀에 대해 효과적인 분해특성을 지니고 있는 것을 알 수 있었다.
- 0 범위에서 빠른 분해 반응 속도를 지니고 있어20)초기 5분 내에 모든 반응이 완료되어 초기 페놀 농도에 대해 95% 이상 분해되었다. 이를 통해 HRP 는 페놀류에 대해 우수한 분해 특성을 지니고 있으며 전기화학 반응 기내에서 고정화된 효소 전극으로 존재할 경우 과산화수소의 외부 주입 없이 반응기내에서 자체발생 되는 과산화수소를 이용하여 페놀류에 대해 높은 처리 효율을 기대할 수 있어 전기효소법에의 적용가능성이 확인되었다.
- 9%의 분해 효율을 나타내었다. 이를 통해 HRP를 다공성 탄소 전극에 고정화시킨 전기화학반응기가 페놀에 대해 우수한 분해 특성을 지니고 있음을 알 수 있었다.
- 의해 화학적으로 고정화되었다. 처리된 RVC 전극에 1, 000 U/mL 이상의 HRP를 투여했을 때 투여량에 대해 35%, RVC 단위 부피당 470 U/mL의 HRP가 고정화 되었고, 4주 동안 초기 활성도에 대해 85% 이상의 상대적 효소 활성도를 나타내었다. RVC가 도입된 원형 전기화학반응기에서 효소를 활성화 시킬 수 있는 과산화수소를 반응기에서 발생시키기 위한 최적 외부 조건은 -0.
- 0, 100 mM이었다. 페놀은 전기화학반응기내에 공급되는 전압이 중가할수록 내부에서 자체 생산되는 과산화수소의 양의 증가에 따라 분해효율이 높아졌으며 RVC 전극을 도입한 전기화학반응기의 경우 38.2%의 분해 효율을 나타내는데 비해 HRP를 고정화시킨 RVC 전극을 도입한 전기화학반응기는 85.9%의 분해 효율을 나타내었다. 이를 통해 HRP를 다공성 탄소 전극에 고정화시킨 전기화학반응기가 페놀에 대해 우수한 분해 특성을 지니고 있음을 알 수 있었다.
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