홍색유황세균, Thiocapsa roseopersicina가 광합성 종속영양상태에서 수소를 생산하기 위한 여러 가지 인자 중에서 광원, 광세기, 배양온도의 영향을 실험하였다. 또한 균체의 성장곡선과 아울러 수소 생산과 소비에 영향을 주는 효소 역가의 변화를 측정하였다. 할로겐등과 형광등을 사용하여 균체성장과 수소생산을 관찰한 결과 배양 48시간 만에 균체성장은 할로겐등과 형광등을 $7.5{\sim}10$ klux로 조사할 때 각각 1.38 및 1.41 g-DCW/L로 가장 높은 균체 성장을 보였고, 수소생산성은 할로겐등과 형광등 10 klux일 때 각각 0.90 및 0.48 $ml-H_2/mg$-dcw를 보여 할로겐등 10 klux일 때 가장 높은 수소생산성을 보였다. 최적 수소생산 온도는 $26^{\circ}C$이었고, $30^{\circ}C$ 이상에서는 수소생산이 감소하였다. $30^{\circ}C$에서 할로겐 램프로 $8{\sim}9$ klux를 조사하면서 photoheterotrophic 조건으로 배양할 때 T. roseopersicina NCIB 8347 세대시간은 약 4.2시간이었다. 수소는 성장대수기 중간인 18시간부터 발생하여 succinate가 모두 소비되는 45시간까지 발생하였고, 그 이후는 더 이상 생산되지 않았다. 그러나 배양시간이 연장되면서 발생한 수소는 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 또한 본 배양 조건에서 발생한 수소생산은 nitrogenase에 의한 것으로 사료되었다.
홍색유황세균, Thiocapsa roseopersicina가 광합성 종속영양상태에서 수소를 생산하기 위한 여러 가지 인자 중에서 광원, 광세기, 배양온도의 영향을 실험하였다. 또한 균체의 성장곡선과 아울러 수소 생산과 소비에 영향을 주는 효소 역가의 변화를 측정하였다. 할로겐등과 형광등을 사용하여 균체성장과 수소생산을 관찰한 결과 배양 48시간 만에 균체성장은 할로겐등과 형광등을 $7.5{\sim}10$ klux로 조사할 때 각각 1.38 및 1.41 g-DCW/L로 가장 높은 균체 성장을 보였고, 수소생산성은 할로겐등과 형광등 10 klux일 때 각각 0.90 및 0.48 $ml-H_2/mg$-dcw를 보여 할로겐등 10 klux일 때 가장 높은 수소생산성을 보였다. 최적 수소생산 온도는 $26^{\circ}C$이었고, $30^{\circ}C$ 이상에서는 수소생산이 감소하였다. $30^{\circ}C$에서 할로겐 램프로 $8{\sim}9$ klux를 조사하면서 photoheterotrophic 조건으로 배양할 때 T. roseopersicina NCIB 8347 세대시간은 약 4.2시간이었다. 수소는 성장대수기 중간인 18시간부터 발생하여 succinate가 모두 소비되는 45시간까지 발생하였고, 그 이후는 더 이상 생산되지 않았다. 그러나 배양시간이 연장되면서 발생한 수소는 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 또한 본 배양 조건에서 발생한 수소생산은 nitrogenase에 의한 것으로 사료되었다.
The purple sulfur phototrophic bacterium, Thiocapsa roseopersicina NCIB 8347 has been studied on hydrogen production and cell growth under different culture conditions, such as light source, light intensity, and growth temperature. T. roseopersicina showed maximum cell growth of 1.38 and 1.42 g-DCW/...
The purple sulfur phototrophic bacterium, Thiocapsa roseopersicina NCIB 8347 has been studied on hydrogen production and cell growth under different culture conditions, such as light source, light intensity, and growth temperature. T. roseopersicina showed maximum cell growth of 1.38 and 1.42 g-DCW/L under 7.5-10 klux of halogen and fluorescent light, respectively, and produced maximum amount of hydrogen with values of 0.90 and 0.48 $mL-H_2/mg$-DCW under the irradiation of 10 klux of halogen and fluorescent light, respectively. The optimum growth temperature for hydrogen production was $26^{\circ}C$, and hydrogen production rate was lowered over $30^{\circ}C$. When T. roseopersicina was grown photoheterotrophically under irradiation of 8-9 klux of halogen lamp, the generation time was 4.2 hr. The strains started producing hydrgen from the middle of the logarithmic growth phase and continued until succinate concentration leveled out.
The purple sulfur phototrophic bacterium, Thiocapsa roseopersicina NCIB 8347 has been studied on hydrogen production and cell growth under different culture conditions, such as light source, light intensity, and growth temperature. T. roseopersicina showed maximum cell growth of 1.38 and 1.42 g-DCW/L under 7.5-10 klux of halogen and fluorescent light, respectively, and produced maximum amount of hydrogen with values of 0.90 and 0.48 $mL-H_2/mg$-DCW under the irradiation of 10 klux of halogen and fluorescent light, respectively. The optimum growth temperature for hydrogen production was $26^{\circ}C$, and hydrogen production rate was lowered over $30^{\circ}C$. When T. roseopersicina was grown photoheterotrophically under irradiation of 8-9 klux of halogen lamp, the generation time was 4.2 hr. The strains started producing hydrgen from the middle of the logarithmic growth phase and continued until succinate concentration leveled out.
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문제 정의
즉 T roseopercisina는 mixotrophic 으로 다양한 조건에서 적응하며 수소를 생산할 수 있으나 빛, 온도 등 외부 배양조건에 대하여 잘 알려져 있지 않다. 이 연구에서는 홍색 유황세균인 T. roseopercisina NCIB 8347를 이용하여 광합성 종속영양 조건에서 수소생산과 균체 성장을 최적화하기 위하여, 온도, 광원, 광세기 영향을 검토하였으며, 수소 생산에 관여하는 효소의 변화를 측정하였다.
제안 방법
광세기, 배양온도의 영향을 실험하였다. 또한 균체의 성장곡선과 아울러 수소 생산과 소비에 영향을 주는 효소 역가의 변화를 측정하였다. 할로겐등과 형광등을 사용하여 균체 성장과 수소생산을 관찰한 결과 배양 48시간 만에 균체 성장은 할로겐등과 형광등을 7.
Serum bottle의 head space gas 10% (3 ml)를 주사기로 빼내고 동량의 acetylene gas로 채워준 후 7, 500 lux 의 할로겐램프를 비추며 27°C 에서 반응시켰다. 반응 시간 10분 간격으로 GC를 측정하여 생성된 ethylene 가스양을즉정하여 활성을 계산하였다. Nitrogenase 1 unit은 1 jimol of ethylene/min 생 성 량으로 정의 하였다.
0)로 제조하였으며, 모든 반응은 Ar 가스로 치환 후 혐기조건에서 이루어졌다. 반응 시작 후 5 분 간격으로 GC를 측정하여 생성된 수소양을 측정하였다. 효소 활성 1 unit은 분당 1 umole의 수소가 생산되는 양으로 정하고, 효소 비활성도는 unit/mg-단백질로 정하였다.
이 균주는 최소 4개의 hydrogenase를가지고 있으며, 이중 2개는 세포막에 존재하고 나머지 2개는 세포질에 존재하여 수소의 생산, 소비 및 수소 sensor 역할을 한다(1). 본 연구에서는 photoheterotrophic 조건으로 배양하였으며 이때 수소 발생은 hydrogenase보다는 nitrogenase 에 의한 것으로 사료된다(Table 4). 본 배양 조건에서 48시간동안 배양한 균체를 수확하여 nitrogenase, uptake hydrogenase, 및 hydrogenase의 수소생성 활성을 측정한 결과, nitrogenase 활성은 1.
수소 산화 활성 (Uptake hydrogenase activity)은 수소가스로 포화된 methylene blue 염색시약의 Hzase에 의한 산화 반응에 의한 탈색을 분광광도계 (UV/VIS, Shimadzu, kyoto, Japan)로 분석하였다(3). 3 mL stoppered cuvette에 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.
수소생산 활성 (玦 evolution activity)은 dithionite로 환원된 methyl viologen을 이용하여 Fhase에 의해 발생하는 수소 양을 gas chromatograph 14-B (Shimadzu, kyoto, Japan) 로분석하여 측정하였다(2). 10 mL vacuum vial에 1.
최적의 광원과 광세도를 결정하기 위해 할로겐등과 백열등을 사용하여 균체 성장과 수소생산을 비교하였다. 조도의 영향을 측정하기위하여 0, 2, 500, 5, 000, 7, 500, 10, 000 lux로 비교하였다. 최적 배양온도를 측정하기위해 15°C, 26°C, 30°C 및 37°C에서 할로겐등을 이용하여 7500 lux에서 알곤으로 치환한 T.
조도의 영향을 측정하기위하여 0, 2, 500, 5, 000, 7, 500, 10, 000 lux로 비교하였다. 최적 배양온도를 측정하기위해 15°C, 26°C, 30°C 및 37°C에서 할로겐등을 이용하여 7500 lux에서 알곤으로 치환한 T. roseopersicina를 혐기 배양하였으며 배양 중 수소생성량, pH, 균체 농도 및 유기산 분해율을 관찰하였다.
홍색유황세균, Thiocapsa roseopersicina가 광합성 종속영양 상태에서 수소를 생산하기 위한 여러 가지 인자 중에서 광원, 광세기, 배양온도의 영향을 실험하였다. 또한 균체의 성장곡선과 아울러 수소 생산과 소비에 영향을 주는 효소 역가의 변화를 측정하였다.
성능/효과
5 klux를 조사할 때의 약 90%이었다. 2.5-10 klux에서 자란 균체를 빛 조사량을 높여서 30 klux 이상으로 조사하였을 때 적녹색이 적색으로 서서히 변하였으며, 최종적으로는 색소를 잃었다. 이와 같은 표백 현상이나 광 저해 현상은 홍색 비유황 세균이 약 400 W/m2 (100 klux로 환산됨, 1 klux = 4 W/n?)이상인 강한 태양광이나 인공광으로 광합성 세균이 자라지않거나, 또는 이미 자란 상태에서 강한 빛으로 인하여 색소를 잃는 경우가 보고된 적이 있다(4-7).
T. roseopersicina 는 다양한 서식지에서 생존하기위해 photoautotrophic 조건 뿐만 아니 라, photoheterotrophic, 및 heterotrophic 조건 모두에서 생장이 가능하여 다양한 대사과정을 수행할 수 있는 것으로 보인다. 지금까지 photoautotrophic 조건에서의 연구는 많이 이루어졌으나, photoheterotrophic 조건에서의 균체 성장 및 수소생산에 관련한 연구는 많이 이루어지지 않았다.
본 배양조건에서는 유리 투명 배양기 표면에서 약 7.5 - 10 klux를 할로겐 등으로 조사하면서 배양할 때가 T. roseopersicina NCIB 8347 균체 성장과 수소생산에 가장 적합한 것으로 사료된다. 이러한 광세기는 일반적으로 홍색 비 유황 세균이 자연 상태, 즉 진흙이나 연못의 혐기상태인곳에서 독립영양으로 서식할 때와 비교하면 약 20배 이상 강한 빛세기이다.
roseopersicina NCIB 8347는 succinate를 탄소원으로 첨가한 배양조건에서 빛을 조사하지 않을 때 균체가 성장하지 않았으며, 수소도 생성되지 않았다. 빛 세기가 높아질수록 동일한 배양시간 동안 succinate 분해율이 높아졌고, 수소생산량도 증가하였다(Table 1). 그러나 10-30 klux 이상에서는 균체 성장이 약간 저하되어 7.
roseopersicina 와 유사한 값은 나타내었다. 이 결과로 미루어본 배양조건에서의 수소생산은 nitrogenase가 최종 수소생산에 관여하여 을 환원한 것으로 유추되었다.
이러한 광세기는 일반적으로 홍색 비 유황 세균이 자연 상태, 즉 진흙이나 연못의 혐기상태인곳에서 독립영양으로 서식할 때와 비교하면 약 20배 이상 강한 빛세기이다. 이러한 결과는 T. roseopersicina NCIB 8347이 자연에서는 낮은 빛 세기에서도 광합성 작용을 하면서 공기 중의 이산화탄소를 고정하며, 천천히 성장하는 반면, 인위적인 종속영양 배양조건에서는 높은 빛 세기도 이용할 수 있는 것으로 보인다. 홍색유황세균은 일반적으로 담수나 해수에 모두 서식하는 세균으로 호수의 경우 약 15 m 깊이에 태양광이 200-500 lux 정도 약하게 비추고, 산소가 희박한 곳에서 자라며, 이러한 곳 중에서도 동식물의 잔해나 오염된 유기물을 이용하여 sulfate reducing 세균이 발생한 HzS가 풍부한 진흙이나 늪 같은 곳에 주로 서식한다(8).
roseopersicina NCIB 8347을 배양하기에 적합하였다. 즉, 할로겐 램프를 7.5 klux를 조사하면서 약 48시간 배양할 때 succinate의 분해율 및 수소 생산량이 각각 70% 및 0.79 ml H^mg dew이었으며, 이는 같은 실험조건에서 형광 램프를 사용할 때보다 1.15배 및 2.80배 증가한 것이다. 그러나 균체 성장은 1.
또한 균체의 성장곡선과 아울러 수소 생산과 소비에 영향을 주는 효소 역가의 변화를 측정하였다. 할로겐등과 형광등을 사용하여 균체 성장과 수소생산을 관찰한 결과 배양 48시간 만에 균체 성장은 할로겐등과 형광등을 7.5-10 klux로 조사할 때 각각 1.38 및 1.41 g-DCW/L로 가장 높은 균체 성장을 보였고, 수소 생산성은 할로겐등과 형광등 10 klux일 때 각각 0.90 및 0.48 ml-Hz/mg-dcw를 보여 할로겐등 10 klux일 때 가장 높은 수소 생산성을 보였다. 최적 수소생산 온도는 26°C이었고, 30°C 이상에서는 수소생산이 감소하였다.
아직까지 광저해현상에 대한 확실한 원인은 밝혀지지 않았으나 광합성 배양 중 높은 농도의 formate가 배양액 중에 축적되어서 pH 가 저해하기 때문에 발생하거나, 빛 세기가 높을 때 빛을받는 Bchl에 손상이 온 것으로 추측하고 있다(6). 형광 램프나 할로겐 램프는 광원으로 조사할 때 수소생산과 균체성장에 유사한 경향을 보였으나, 후자가 T. roseopersicina NCIB 8347을 배양하기에 적합하였다. 즉, 할로겐 램프를 7.
본 배양 조건에서 48시간동안 배양한 균체를 수확하여 nitrogenase, uptake hydrogenase, 및 hydrogenase의 수소생성 활성을 측정한 결과, nitrogenase 활성은 1.73 unit/mg-DCW를 나타내었고, uptake hydrogenase-^! 활성은 5.8 x 10'2 unit/mg-protein이었으며, 수소생산 hydrogenase의 활성은 극소량 측정되었다. Purple non-sulfur bacteria 인 R.
후속연구
지금까지 photoautotrophic 조건에서의 연구는 많이 이루어졌으나, photoheterotrophic 조건에서의 균체 성장 및 수소생산에 관련한 연구는 많이 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 photoheterotrphic 조건에서 균체 성장 및 수소생산에 대한 광원, 광도, 및 온도의 영향을 관찰하였으며, 앞으로 균체생장 및 수소생산 최적화를 위한 탄소원, pH 및 공기영향 등의 연구가 계속될 계획이다.
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