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문제 정의
- 본 연구에서는 콜라겐의 분석 및 확인에 MALDI-TOF MS를 도입하고자 하였다. 쥐의 꼬리로 부터 얻은콜라겐 섬유에서 콜라겐을 분리한 후 gel 상에서 분자량 별로 분리하였다.
- 분리된 각각의 띠들을 채취한 후 trypsin을 이용한 digestion을 수행하여 MALDI-TOF MS 스펙트럼 상에서 digested fragment들을 분석하고, 확인된 fragment들에 대해 Q-TOF MS/MS를 사용하여 각각의 아미노산 서열을 분석하였다. 이를 통해 시료 중의 콜라겐의 종류에 대한 정보를 확인하고, 콜라겐분석에서 MALDI-TOF 질량분석을 통해 a-chain의 종류 확인 및 이에 따른 시료 콜라겐의 종류를 쉽게 예측할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.
- 큰 생체분자에 대해서 정확한 분자량 정보를 제공할 수 있고, 간단한 전처리만으로 다수의 시료분석이 가능한 MALDI-TOF MS를 이용하여 콜라겐 시료의 구조를 쉽게 확인할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다. 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐 시료를 SDS-PAGE로 분리했을 때 10개의 band로 나누어지는 것을 확인할 수 있었는데, 동일한 콜라겐 시료를 MALDI-TOF MS로 분석한 결과 SDS-PAGE에서의 band와 질량이 일치히는 6개의 peak를 얻을 수 있었으며, 이들 단백질 분자들의 정확한 질량을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- MALDI-TOF MS 상에서 type I collagen 중의 서열로 확인된 두 fragment들에 대해 fragment의 아미노산 서열을 확인 . 검증하기 위하여, Q-TOF MS/MS 분석을 통해 GlylO56-ArglO73으로 확인된 如gment와 Gly985-Argl002 로 확인된 fragment의 서열을 확인하였으며, 그 결과를 그림 8과 그림 9에 나타내었다.
- 확인 . 검증하기 위하여, Q-TOF MS/MS 분석을 통해 GlylO56-ArglO73으로 확인된 如gment와 Gly985-Argl002 로 확인된 fragment의 서열을 확인하였으며, 그 결과를 그림 8과 그림 9에 나타내었다.
- 5분간 소독하였다. 꼬리를 150 mm petri dish에 놓고서 연골도를 써서 꼬리 끝에서부터 10 mm 간격으로 피부를 절개하였다. 상방으로 꼬리끝을 끌어 올리면 콜라겐 섬유가 따라 올라온다.
- 쥐의 꼬리로 부터 얻은콜라겐 섬유에서 콜라겐을 분리한 후 gel 상에서 분자량 별로 분리하였다. 분리된 각각의 띠들을 채취한 후 trypsin을 이용한 digestion을 수행하여 MALDI-TOF MS 스펙트럼 상에서 digested fragment들을 분석하고, 확인된 fragment들에 대해 Q-TOF MS/MS를 사용하여 각각의 아미노산 서열을 분석하였다. 이를 통해 시료 중의 콜라겐의 종류에 대한 정보를 확인하고, 콜라겐분석에서 MALDI-TOF 질량분석을 통해 a-chain의 종류 확인 및 이에 따른 시료 콜라겐의 종류를 쉽게 예측할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.
- 상방으로 꼬리끝을 끌어 올리면 콜라겐 섬유가 따라 올라온다. 이를 절단하여 다른 petri dish에 들어있는 0.1% acetic acid에 담갔으며, 이 과정을 반복하여 콜라겐 섬유를 모았다. 한 마리에서 나온 콜라겐(50~70 mg)을 100 ml acetic acid이 든 병에 옮긴 다음 4℃에서 magnetic stirrer로 24시간 교반 하였다.
- 쥐의 꼬리에서 분리한 콜라겐을 SDS sample buffer 에 녹이고 100℃에서 3분간 끓인 후 시료를 loading 하기 위한 5% stacking gel과 sample를 분자량별로 분리하기 위한 6% separating ge로 이루어진 discontineous gel에 standard marker와 4℃에서 저장한 sample collagen 를 각각 15 以씩 loading하였다. Standard marker로는 myosin(206, 676 Da), 0-galactosidase(l 15, 757 Da), Bovine serum albumin(98, 003)Da, Ovalbumin(54, 604 Da), Carbonic anhydrase(37, 390 Da), Soybean trypsin inhibitor(29, 559 Da), Lysozyme(20, 336 Da), Aprotinin (7, 036 Da)를 사용하였다.
대상 데이터
- MALDI-TOF MS 장치는 Voyager DE-STR(Pereeptive Biosystems, USA)를 사용하였으며, Q-TOF MS/MS 장치는 JMS-HX110A(Jeol, Japan)을 사용하였다. 광원은 337 nm의 N2 레이저를 사용하였으며, 가속전압은 25 kV, 격자전압은 90%, 유도선 전압은 0.
- 각각 15 以씩 loading하였다. Standard marker로는 myosin(206, 676 Da), 0-galactosidase(l 15, 757 Da), Bovine serum albumin(98, 003)Da, Ovalbumin(54, 604 Da), Carbonic anhydrase(37, 390 Da), Soybean trypsin inhibitor(29, 559 Da), Lysozyme(20, 336 Da), Aprotinin (7, 036 Da)를 사용하였다.
- A)에서 구입하였다. Trypsin(sequencing grade modified), Standard marker(SDS-PAGE standards, High Range)는 Bio-Rad(USA)사에서 구입하였다. 용매 Methanol, acetic acid glacial, acetonitrile(ACN)은 고순도 용매를 사용하였다.
- 광원은 337 nm의 N2 레이저를 사용하였으며, 가속전압은 25 kV, 격자전압은 90%, 유도선 전압은 0.3%였다. 질량측정 시 보정은 외부 보정법을 사용하였으며, 108 kDa 분자량 범위에서 약 0.
- 사용하였다. 본 연구에서 사용한 Acrylamide, N, N'-methylene-bis-acrylamide, Ammonium persulfate, Tris (Trizma base), Sodium dodecyl sulfote(SDS), Dithio-threitol(DTT), TEDED, Tris Buffer, Bromophenol blue, Coomassie Brilliant blue R 250, Ammonium bicarbonate(ABC), Trifluoroacetic acid(TFA), Glycine, Formic acid(FA)는 Sigma(U.S.A)에서, sinapinic acid (SA) 은 Aldrich(U.S.A)에서 구입하였다. Trypsin(sequencing grade modified), Standard marker(SDS-PAGE standards, High Range)는 Bio-Rad(USA)사에서 구입하였다.
- 본 연구에서는 쥐의 꼬리에서 추출 및 정제한 콜라겐을 사용하였다. 본 연구에서 사용한 Acrylamide, N, N'-methylene-bis-acrylamide, Ammonium persulfate, Tris (Trizma base), Sodium dodecyl sulfote(SDS), Dithio-threitol(DTT), TEDED, Tris Buffer, Bromophenol blue, Coomassie Brilliant blue R 250, Ammonium bicarbonate(ABC), Trifluoroacetic acid(TFA), Glycine, Formic acid(FA)는 Sigma(U.
- Trypsin(sequencing grade modified), Standard marker(SDS-PAGE standards, High Range)는 Bio-Rad(USA)사에서 구입하였다. 용매 Methanol, acetic acid glacial, acetonitrile(ACN)은 고순도 용매를 사용하였다.
이론/모형
- 3%였다. 질량측정 시 보정은 외부 보정법을 사용하였으며, 108 kDa 분자량 범위에서 약 0.05~0.1%의 오차범위 이내에 있었다.
성능/효과
- 이는 질량 스펙트럼을 분리된 각각의 콜라겐 사슬이 조 각화된 것을 전제로 한 예상되는 fragment와 비교하기 어렵게 만들며, 이로 인해 확인되는 digested fragment 의 수가 감소되는 것으로 예상할 수 있다. 10개의 분리된 barmd에서 확인된 fragment가 전체 예측가능한 fragment 중 1.5%에 해당한다는 것은 아직 분리된 콜라겐 내에 가교결합이 많이 남아있음을 예상할 수 있는데, 그럼에도 불구하고 SDSTAGE상에서 확인된 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9의 band들에서 type I collagen의 %-chain과 a2-chain 으로부터 예상되는 fragment들이 확인되었다는 것은, 적어도 이들 7개의 분리된 단백질은 type I 콜라겐으로이루어져 있음을 확인할 수 있으며, type I 콜라겐을 MALDI-TOF MS로 분석할 때에 위의 두 f* ragment 스펙트럼상의 지문(fingerprint)로 사용하여 간편하게 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
- 5%만이 확인되었지만, 두 확인된 fragment를 통해 SDS-PAGE에서 분리된 단백질 중 적어도 7개에서 type I 콜라겐이존재함을 확인할 수 있었다. MALDI-TOF MS에서 예측값과의 비교로써 확인된 두 fragment의 아미노산 서열을 Q-TOF MS/MS로 확인한 결과 MALDI-TOF MS 분석결과와 동일한 서열분석 결과를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐에 type I collagen이 포함되어 있음을 확인함과 동시어〕, 이 두 digested fragment에 의한 MALDI-TOF MS 스펙트럼상에서의 peak가 type I collagen 확인시의 지문으로- 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐 시료를 SDS-PAGE로 분리했을 때 10개의 band로 나누어지는 것을 확인할 수 있었는데, 동일한 콜라겐 시료를 MALDI-TOF MS로 분석한 결과 SDS-PAGE에서의 band와 질량이 일치히는 6개의 peak를 얻을 수 있었으며, 이들 단백질 분자들의 정확한 질량을 확인할 수 있었다. SDS-PAGE로 분리된 10개의 각 band에 대해 tryptic digestion을 수행한 후 MALDI-TOF MS로 확인한 결과, 4개의 band에서 type 1 콜라겐의 %-chaha에 해당하는 GlylO56-ArglO73 fragment를 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 a2-chain에 해당하는 Gly985-Argl002 fragment# 확인할 수 있었다. 콜라겐 사슬간에 존재하는 가교결합으로 인해 예측되는 type I 콜라겐의 fragment 중 1.
- 6484 는 band 10에 해당됨을 볼 수 있다. 그러므로 MALDI-TOF MS 스펙트럼에서는 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐을 분석한 결과 SDS-PAGE에서 확인된 총 10개의 band 증 60%에 해당하는 6개의 일치되는 많은 단백질을 확인할 수 있었다. 또한 standard marker와의 비교에 의해 대략적 분자량을 산출했던 SDS-PAGE에 비해 MALDI-TOF MS 결과에서는 각 단백질에 대해 매우 정확한 분자량 정보를 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
- 그러므로 MALDI-TOF MS 스펙트럼에서는 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐을 분석한 결과 SDS-PAGE에서 확인된 총 10개의 band 증 60%에 해당하는 6개의 일치되는 많은 단백질을 확인할 수 있었다. 또한 standard marker와의 비교에 의해 대략적 분자량을 산출했던 SDS-PAGE에 비해 MALDI-TOF MS 결과에서는 각 단백질에 대해 매우 정확한 분자량 정보를 확인할 수 있음을 볼 수 있었다.
- 아울러 낮은 질량 영역에서 발견되는 충돌에 의해 각 아미노산의 이모늄이온(immoniiim ion)으로 분리된 단량체들의 확인된 질량을 같이 나타내었다. 이 Q-TOF MS/MS 결과를 볼 때, 그림 8에서의 스펙트럼 및 이의 분석결과는 type I 콜라겐 내 %-chain에 속하는 fragment인 GETGPAGPAGPIGPAGAR의 서열과 일치하는 것을 확인할 수 있었으며, 그림 9에서의 결과에서는 type I 콜라겐 내 CQ-chais에 속하는 fragment인 GEPGPA-GSVGPVGAVGPR의 서열과 일치함을 확인힐, 수 있었는더L 이는 MALDI-TOF MS 분석에서의 peak을 예상된 fragment들과 비교하여 확인되었된 두 서 열의 예측과 일치하고 있다. 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출된콜라겐이 type I 의 구조를 포함하고 있음을 확인할 수 있었고, 따라서 MALDI-TOF MS에서 확인된 a, -chain 내의 Glyl056-Argl073과(/-chain 내의 Gly985-Argl002 의 fragment에 해당하는 peak로서 type I collagen을 쉽게 확인할 수 있음을 검증할 수 있었다.
- 그리고 band 3, 6, 10에 대한 질량분석 스펙트럼에서는 콜라겐 아미노산의 fragment 서열에 해당되는 peak를 확인할 수 없었다. 이들 각 band에서 얻은 스펙트럼 peak들의 분석을 종합하면 1, 2, 4, 7의 band에서는 콜라겐의 g-chain으로부터 예상되는 fragment인 Glyl056-Argl073 서열(*)이 확인되었고, 1, 4, 5, 8, 9의 band로부터는 콜라겐의 aechain 으로부터 예상되는 Gly985-Argl002 fragment(**)7|-확인되었다.
- 또한 band 10은 매우 희미하게 확인되어 분자량을 결정하기 어려웠다. 이를 볼 때 SDS-PAGE를 이용한 콜라겐 시료의 분석은 시료 내 분자들의 각 분자량에 따른 분리는 비교적 수월하나, 정확한 분자량에 대한 정보를 확인하기 어려움을 확인할 수 있었다. 동일한 콜라겐 시료를 m/z 10, 000-250, 000 범위에서 MALDI-TOF MS로 확인한 스펙트럼을 그림 2에 나타내었다.
- 이 Q-TOF MS/MS 결과를 볼 때, 그림 8에서의 스펙트럼 및 이의 분석결과는 type I 콜라겐 내 %-chain에 속하는 fragment인 GETGPAGPAGPIGPAGAR의 서열과 일치하는 것을 확인할 수 있었으며, 그림 9에서의 결과에서는 type I 콜라겐 내 CQ-chais에 속하는 fragment인 GEPGPA-GSVGPVGAVGPR의 서열과 일치함을 확인힐, 수 있었는더L 이는 MALDI-TOF MS 분석에서의 peak을 예상된 fragment들과 비교하여 확인되었된 두 서 열의 예측과 일치하고 있다. 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출된콜라겐이 type I 의 구조를 포함하고 있음을 확인할 수 있었고, 따라서 MALDI-TOF MS에서 확인된 a, -chain 내의 Glyl056-Argl073과(/-chain 내의 Gly985-Argl002 의 fragment에 해당하는 peak로서 type I collagen을 쉽게 확인할 수 있음을 검증할 수 있었다.
- 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐 시료를 SDS-PAGE로 분리했을 때 10개의 band로 나누어지는 것을 확인할 수 있었는데, 동일한 콜라겐 시료를 MALDI-TOF MS로 분석한 결과 SDS-PAGE에서의 band와 질량이 일치히는 6개의 peak를 얻을 수 있었으며, 이들 단백질 분자들의 정확한 질량을 확인할 수 있었다. SDS-PAGE로 분리된 10개의 각 band에 대해 tryptic digestion을 수행한 후 MALDI-TOF MS로 확인한 결과, 4개의 band에서 type 1 콜라겐의 %-chaha에 해당하는 GlylO56-ArglO73 fragment를 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 a2-chain에 해당하는 Gly985-Argl002 fragment# 확인할 수 있었다.
- SDS-PAGE로 분리된 10개의 각 band에 대해 tryptic digestion을 수행한 후 MALDI-TOF MS로 확인한 결과, 4개의 band에서 type 1 콜라겐의 %-chaha에 해당하는 GlylO56-ArglO73 fragment를 확인할 수 있었고, 5개의 band에서 a2-chain에 해당하는 Gly985-Argl002 fragment# 확인할 수 있었다. 콜라겐 사슬간에 존재하는 가교결합으로 인해 예측되는 type I 콜라겐의 fragment 중 1.5%만이 확인되었지만, 두 확인된 fragment를 통해 SDS-PAGE에서 분리된 단백질 중 적어도 7개에서 type I 콜라겐이존재함을 확인할 수 있었다. MALDI-TOF MS에서 예측값과의 비교로써 확인된 두 fragment의 아미노산 서열을 Q-TOF MS/MS로 확인한 결과 MALDI-TOF MS 분석결과와 동일한 서열분석 결과를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 쥐의 꼬리에서 추출한 콜라겐에 type I collagen이 포함되어 있음을 확인함과 동시어〕, 이 두 digested fragment에 의한 MALDI-TOF MS 스펙트럼상에서의 peak가 type I collagen 확인시의 지문으로- 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 그림 1에서 Lane Ie standard marker에 의한 띠들이고, lane Ⅱ에 콜라겐시료의 분리된 띠들을 나타내었다. 콜라겐의 분리 결과 총 10개의 띠들을 확인할 수 있었는데, 이들의 분자량을 standard marker와 비교한 결과 각각 약 220 kDa, 95 kDa, 65 kDa, 47 kDa, 33 kDa, 30 kDa, 27 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 10 kDa 해당됨을 볼 수 있었다. 그러나
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