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문제 정의
- 본 연구에서는 혈청 내 콜레스테롤을 정 량분석하기위한 최상위 측정방법으로 ID LC/MS 방법을 제안하였다. 이 방법은 ID GC/MS에 비해 유도체화 과정 이필요 없고 시료 전처리 과정이 간단하여 시간과 비용을 감소시킬 수 있는 장점이 있다.
- 본 연구에서는 혈청 내 콜레스테롤을 정량하기 위한 일차분석 법으로 동위 원소희석 액 체크로마토그래 피 /질량분석법을 개발하였다. 일차분석법은 측정 에 있어서 질적으로 가장 상위인 방법으로 그 조작 방법이 완벽하게 기술되어야하고, 측정하고자하는 양(화학측정의 경우, mol)에 대해 어떤 표준을 참고하지 않고도 그 결과가 받아들여질 수 있어야 한다.
- 혈청 콜레스테롤 측정에 있어 소급성의 확립은 외국의 경우 국가적인 과제 규모로 진행되고 있지만, 우리나라의 경우는 아직 발판이 미비한 상태라 본 연구에서는 소급성을 확립하고 이 소급성을 임상 진단기관 등에 보급하고자 인증표준물질의 제조 및 인증에 대한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 3개의 혼합표준용액에 대한 동위원소희석 액체크로마토그래피/질량분석법 실험을 4회 반복측정한 후 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2의 무게비에 대한 피이크 면적비에 해당하는 감도계수(response factor, R.F.) 를 구하여 상호 비교하였다. 혼합표준용액은 동위원소 희석 질량분석법에서 결과산출을 위한 직접적인 표준이 되므로 이에 대한 검증은 반드시 필요하다.
- 4 종류의 혈청인증표준물질을 제조하여 이에 대한 인증을 실시하였다. 콜레스테롤의 전처리 과정은 앞의 실험 부분에서 언급한바와 같으며, 비교적 혈 중 농도가 높고 혈청 내에 존재하는 다른 물질에 비해서 추출이 잘되므로 혼합표준용액 제조과정과 spiking만 유의한다면 좋은 결과를 얻을 수 있다.
- APCI 양이온 모드에서 콜레스테롤의 질량 스펙트럼을 확인하였다. 먼저 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 각각의 용액에 대해 질량 스펙트럼을 얻은 후, 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 혼합표준용액의 질량 스펙트럼을 확인하였다.
- KRISS (Korea Research Institute of Standards and Science)에서 제조한 4종류의 혈청 인증표준물질 각각을 무작위로 5 개씩 선택하여 전처리 과정을 수행하였다. 최적화 조건에서 혼합표준용액, 시료의 순서로 4회 이상 반복 측정하여 분석하였다.
- 매번 측정 할 때 마다 혈청 인증표준물질 4 종류에 대해 무작위로 5개 시료를 선택하였고, 미리 예비실험을 통해 측정된 혈청 인증표준물질 내 콜레스테롤의 농도값을 기준으로 콜레스테롤-3, 4-%:2를 이 되도록 첨가하여 전처리를 진행하였다.
- 먼저 갈색 병의 무게를 측정하였다. 다음 혈청 0.
- 혈청 시료는 -75℃ 에서 보관되었다. 먼저 냉동혈청은 상온에서 완전히 해동시키고 저울실에서 약 2 시간 정도 두어 온도에 의한 무게 변화가 생기지 않도록 하였다. 냉동건조혈청은 다음의 재구성 과정을 거친 후사용하였다.
- 확인하였다. 먼저 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 각각의 용액에 대해 질량 스펙트럼을 얻은 후, 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 혼합표준용액의 질량 스펙트럼을 확인하였다. Fig.
- 43%로 나타났다. 본 연구를 통하여 혈청 내 콜레스테롤을 절대 정량 분석하는 최상위 비교분석법으로써 ID LC/MS 방법을 확립하였으며, 이 방법은 혈청 인증표준물질을 인증하는 일차기준즉정절차로 사용될 수 있다.
- 약 2주 간격으로 6회 반복 측정하여 재현성을 살펴보았다. 매번 측정 할 때 마다 혈청 인증표준물질 4 종류에 대해 무작위로 5개 시료를 선택하였고, 미리 예비실험을 통해 측정된 혈청 인증표준물질 내 콜레스테롤의 농도값을 기준으로 콜레스테롤-3, 4-%:2를 이 되도록 첨가하여 전처리를 진행하였다.
- 3 에서 가장 큰 이온세기를 나타내었다. 이는 물 분자가 떨어진 [M-H20+H]+ 이온에 해당하는 것으로 분자 이온보다 더 큰 이온세기를 나타내었으며 본 연구에서는 이 두 이온을 모니터링하여 정 량하였다.
- 3 mL를 취하여 미리 무게를 달아둔 갈색 병에 옮기고 다시 무게를 측정하였다. 채취한 시료의 콜레스테롤과 동위원소비가 l:l(w/w)이 되도록 콜레스테롤-3,4-13c2 표준용액을 spiking하고 갈색 병의 무게를 측정하였다. 콜레스테롤-3, -3,4-13c2 표준용액이 첨가된 시료는 잘 흔들어 섞어준 후, 1시간 동안 실온에 보관하였다.
- 최적화 조건에서 혼합표준용액, 시료의 순서로 4회 이상 반복 측정하여 분석하였다. 분석 결과로 콜레스테롤/콜레스테롤-3, 4*C2 의 면적비를 얻었으며, 콜레스테롤 농도(C)는 아래 식에 각각의 변수를 대입하여 계산하였다.
- 분석하여 상호 비교하였다. 측정결과 인증값과불확도 범위 내에서 일치하는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 4 종류의 혈청 인증표준물질에 대한 제조와 인증을 실시하였다.
- 콜레스테롤-3, 4-%2 표준용액과 콜레스테롤 일차표준 용액의 농도비가 1:1이 되도록 혼합하여 3개의 혼합표준용액을 제조하였다. 혼합표준용액의 정확한 농도를 계산하여 약 50 jig/g 농도가 되도록 에탄올로 희석 한 후 사용하였다.
- 혈청 내 콜레스테롤을 분석하기 위해 본 연구에서 확립한 동위원소희석 액체크로마토그래 피/질 량분석 법의 정확성과 유효성을 확인하기 위하여 인증값을 갖고 있는 NIST SRM 909b를 분석하였다. 분석을 위해 1 회 측정 시 SRM 909b로부터 5개의 시료를 취하여 분석하였다.
- 냉동건조혈청은 다음의 재구성 과정을 거친 후사용하였다. 혈청시료 병은 가볍게 두드려 모든 혈청 분말이 병 바닥에 모이도록한 후 무게를 측정하여 기록하였다. 시료 병을 열고 1어=0.
- 혈청시료의 질량 크로마토그램에서 신호 대 잡음비 (S/N ratio)에 기초하여 검출한계와 정 량한계를 측정하였다. 시료용액을 묽힌 다음 최적조건에서 시료를 5 uL 취하여 반복 측정하였다.
대상 데이터
- 1% 아세트산 포함) 100%, 순수 메탄올 100%, 메탄올:아세토니트릴(95:5, v/v), 아세토니트릴:물 (95:5, v/v) 등 여러 종류로 실험해 본 결과, 이온세기는 모두 비슷한 값을 가졌다. APCI는용매의 이온화가 먼저 일어나고 이온화된 용매 분자가 측정 대상물질을 이온화시키므로 이온화가 잘되고, 머무름 시간이 가장 빠른 메탄올 100%를 이 동상으로 선택하였다. 유속은 피이크 모양을 고려하여 0.
- 동위원소표지 내부표준물질, 콜레스테롤-3, 4-%2(99%)는 Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 수산화칼륨(ACS, *85%) 과 아세트산(ACS, 99%)은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)사에서 , 에 탄올 (ACS, HPLC certified solvent), 헥 산(ACS, HPLC certified solvent), 아세토니트릴(ACS, HPLC certified solvent), 2-프로판올(ACS, HPLC certified solvent)은 Burdick&Jackson (Muskegon, Ml, USA)사에서, 메탄올 (HPLC grade)은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)사에서 구입하였다. 이동상은 사용하기 전에 0.
- 일차표준용액 제조에 쓰인 콜레스테롤 고순도 표준물질(NIST SRM 911b)과 분석 방법의 유효성을 확인하기 위해서 사용된 혈청표준물질(NIST SRM 909b) 은 NlST(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 동위원소표지 내부표준물질, 콜레스테롤-3, 4-%2(99%)는 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
- 이 온화 장치는 APO (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) 양이온 모드를 사용하였다. 칼럼은 ODS hypersil Cig (Thermo, 100x2.1 mm, 3 jim)을사용하였고, 보호 칼럼 도 ODS hypersil c18 (Thermo, 10x3 mm, 5 |im)을 사용하였다. 액체크로마토그래피에서 이동상은 100% 메탄올, 유속은 0.
- 혈청시료는 본 연구에서 제조한 4 종류의 혈청 인증표준 물질로 냉동혈청(Frozen human serum, Level 1 and 11) 두 종류와 냉동건조혈 청 (Lyophilized human serum, Level 1 and 11) 두 종류를 포함하고 있다. Level Ie 정상농도, level Ⅱ는 고농도를 의미한다.
- 71%의 낮은 상대표준 편차를 얻음으로써 혼합표준용액의 제조가 정확하고 측정하는 동안 기기에 대한 drift도 낮았음을 알 수 있었다. 혼합표준용액 중에서 평균값에 근접하고 반복 측정의 상대표준 편차가 작은 혼합표준용액 1개를 선택하여 콜레스테롤 정 량을 위한 표준용액으로 사용하였다.
데이터처리
- 이러한 필요에 의하여 혈청 내 콜레스테롤을 분석하는 일차분석 법으로 동위 원소희석 액 체 크로마토그래피/질량분석법을 확립하였고, 이 방법의 유효성을 확인 하기 위하여 NIST (National Institute of Standards and Technology) SRM (Standard Reference Material) 909b를 분석하여 상호 비교하였다. 측정결과 인증값과불확도 범위 내에서 일치하는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 4 종류의 혈청 인증표준물질에 대한 제조와 인증을 실시하였다.
- 측정불확도는 불확도 평가 프로그램인 PUMA (Program for Uncertainty Calculation in Measurement and Analysis)를 이용하여 ISO guide끄에 따라 평가하였으며, 냉동혈청 Level 1 시료의 콜레스테롤 측정 결과에 대한 불확도 평가 결과를 Table 4에 나타내었다. 여기에서 또 하나 중요한 요점은 불확도에 영향을 미치는 인자와 기여도의 정도이다.
이론/모형
- 액체크로마토그래피는 Agillent 1100 series를 사용하였고, 질량분석기는 triple-stage quadrupole mass spectrometer로 ABI회사의 API 2000 모델을 사용하였다. 이 온화 장치는 APO (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) 양이온 모드를 사용하였다.
- 3 mL/min, 시료주입 량은 5 pL를 최적화 조건으로 하였다. 질량분석 기 에서는 선택 이 온분석 법(Selected Ion Monitoring, SIM)을 통해 콜레스테롤은 m/z 369.4, 콜레스테롤- 3, -3,4-13c2 은 m/z 371.3에서 모니터링하였다. 최적 질량분석기 조건은 양이온 모드에서 curtain gas는 35 psi, nebulizer current는 1.
성능/효과
- Table 1은 감도계수를 나타낸 것으로 이로부터 표준용액 제조의 정확성과 측정 도중 기기의 drift에 의한 영향 여부 등을 알 수 있다. 0.71%의 낮은 상대표준 편차를 얻음으로써 혼합표준용액의 제조가 정확하고 측정하는 동안 기기에 대한 drift도 낮았음을 알 수 있었다. 혼합표준용액 중에서 평균값에 근접하고 반복 측정의 상대표준 편차가 작은 혼합표준용액 1개를 선택하여 콜레스테롤 정 량을 위한 표준용액으로 사용하였다.
- 8%의 범위에 해당하는 좋은 반복성을 보였으며, 각 시료에 대해 6회 독립적으로 반복 측정한 평균값과 상대표준편차를 Table 3에 나타내었다. 4 종류에 대해 모두 0.24%이하의 상대표준 편차를 얻음으로써 좋은 재현성을 보였다. 인증표준 물질에 대한 인증값은 냉동혈청 (Frozen human serum) Level Ie 1259.
- 시료용액을 묽힌 다음 최적조건에서 시료를 5 uL 취하여 반복 측정하였다. 검출한계는 신호 대 잡음 비가 3인 피이크 세기에서의 농도이며 약 0.05 μg/g임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음 비가 최소 10인 피이크 세기에서의 농도로 약 0.
- 3에서 방해 이온 없이 정 량에 합당한 크로마토그램을 얻을 수 있었다. 방법의 유효성을 확인하기 위해 NIST SRM 909b 를 분석하여 인증값과 비교한 결과 불확도 범위 내에서 일치함을 보였다. 혈청 인증표준물질 4종류를 분석한 결과, 반복성의 상대표준 편차는 0.
- 여기에서 또 하나 중요한 요점은 불확도에 영향을 미치는 인자와 기여도의 정도이다. 불확도에 영향을 미치는 인자의 기여도를 살펴보면 시료의 면적비(콜레스테롤/콜레스테롤-3,4-13c2가 가장 큰 영향을 미치고 그 다음으로 혼합표준용액의 면적비가 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이는 질량분석기가 얼마나 안정하게 반복 측정하는지의 여부에 따른 것으로 기기의 안정된 운용이 불확도를 줄이는 주요 관건이 될 수 있음을 알 수 있었다.
- NIST SRM 909b는 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석법으로 얻은 인증값으로서 두 방법간의 비교도 가능하게 했다. 이로써 동위원소 희석 기체크로마토그래 피/질량분석 법 대신에 유도 체화 과정이 필요 없는 동위원소희석 액체크로마토그래피/질량분석법으로의 분석법 확립이 가능함을 확인하였다.
- 24%이하의 상대표준 편차를 얻음으로써 좋은 재현성을 보였다. 인증표준 물질에 대한 인증값은 냉동혈청 (Frozen human serum) Level Ie 1259.67±18.01 jig/g, 냉동혈청 Level Ⅱ는 1554.49±22.23 jig/g, 냉동건조혈청 (Lyophilized human serum) Level Ie 1373.46±19.64 jig/g, 냉동건조혈청 Level Ⅱ는 1512.26±21.63 |ig/g임을 확인하였다.
- 05 μg/g임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음 비가 최소 10인 피이크 세기에서의 농도로 약 0.17 μg/g이나 측정의 재현성을 고려하여 최소 0.5 |Lig/g 이상의 농도가 적절함을 확인하였다.
- 실시하였다. 콜레스테롤의 전처리 과정은 앞의 실험 부분에서 언급한바와 같으며, 비교적 혈 중 농도가 높고 혈청 내에 존재하는 다른 물질에 비해서 추출이 잘되므로 혼합표준용액 제조과정과 spiking만 유의한다면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 혼합표준용액 제조 시에는 에탄올 용매를 사용하므로 휘발로 인한 농도의 변화가 없도록 주의하고, spiking을 할 때는 용매와 혈청의 매질이 다르므로 정확한 농도의 spiking을 위해 부피에 대한 무게의 보정을 실시해 주는 것이 필요하다.
- 방법의 유효성을 확인하기 위해 NIST SRM 909b 를 분석하여 인증값과 비교한 결과 불확도 범위 내에서 일치함을 보였다. 혈청 인증표준물질 4종류를 분석한 결과, 반복성의 상대표준 편차는 0.1 ~0.8%, 재현성은 0.24%이하로 좋은 결과를 얻었다. 확장 불확도는 95% 신뢰도에서 약 1.
- 7분이었고 콜레스테롤-3,4-13c2와 동일한 머무름 시간을 나타내었으며, 매질에 의한 간섭현상 없이 정량하기에 합당한 이온세기와 피이크 모양을 얻을 수 있었다. 혈청시료에 콜레스테롤-3, 4*C2 의 오염 여부를 알기 위해 순수한 혈청에 대한 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2의 질량 크로마토그램을 얻었을 때 혈청에 콜레스테롤-3,4-13c2는 불순물로 포함되어 있지 않음을 확인하였다.
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